婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸的测定方法.doc

婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸的测定方法中国乳品工业dq/ryindustry婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸的测定方法郝岩平,张秋梅,王象欣(东北农,3k大学,黑龙-2c省乳品工业技术开发中心,哈尔滨150086)摘要:采用碱性磷酸酶先将样品中的核苷酸酶解为核苷.然后用高效液相色谱法测定婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸总量.试样经水提取,通过调ph值沉淀蛋白质.样液中的核苷酸经碱性磷酸酶水解生成核苷,再通过快速加热的方式终止酶解反应,同时进一步去除杂质,用磷酸二氢钾及甲醇作流动相,用普通c18色谱柱,采用梯度洗脱的模式对5种核苷进行有效分离.本方法回收率在92.4%-103.7%之间.相对标准差2.0%8.0%.核苷酸各组分定量限:cmp)0.6mg/100g,ump为0.7mg/100g,imp+amp为0.5mg/100g,gmp为0.4mg/100g(均为质量分数).该方法简便,快速,准确,完全能满足婴幼儿配方食品中核苷酸总量测定的要求.为核苷酸检测开辟了全新的途径.关键词:配方食品;乳粉:核苷酸;核苷;高效液相色谱中图分类号:ts252.7文献标识码:a文章编号:10012230(2011)04-004805researchondeterminationofnucleotidesininfantformulafoodandmilkpowderhaoyanpin,zhangqiumei,wangxiangxin(northeastagriculturaluniversity,heilongjiangdairyindustrytechnicaldevelopmentcenter,harbin150086,china)abstract:wefirstemployalkalinephosphatasetohydrolyzenucleotidestothecorrespondingnucleosidesandestablishamethodforwhichdetectsthetotalnucleotidesininfantformulafoodandmilkpowderusinghplc.thesampleisextractedbywater,andeliminatedofproteinbyadjustingph.thenthenucleotidesinsamplearedegradedintonucleosides.thisenzymehasbeenheatdeactivatedinordertostopreactionandremoveimpuritiesfurther.thechromatographicseparationwasachievedusingac18columnandagradientelutionwithamixtureoftwosolvents.whicheffectivelyseparatefivekindsofnucleosides.therangeofrecoveryratesofis92.4%103.7%andtherangeofrelativestandarddeviationsis2.0%一8.0%.thedetectionlimitsforthesenucleotidesare:cmpo.6mg/100g,ump0.7mg/100g,imp+ampo.5mg/100gandgmp0.4mg/100g.conclusion:themethodwhichoffersanewwaytodetectthenucleotidesissimple,rapidandaccurateanditcancompletelymeetthedetectionoftotalnucleotidesininfantformulafoodandmilkpowder.keywords:formulafood;milkpowder;nucleotides;nucleosides;hplc0引言人乳中天然的核苷酸质量浓度很高,而牛乳中天然核苷酸质量浓度低.为了使牛乳更接近母乳许多企业在乳粉中添加核苷酸,现在在婴儿配方食品和奶粉中添加的核苷酸品种主要有以下5种:胞嘧啶核苷酸,腺嘌呤核苷酸,尿嘧啶核苷酸,鸟嘌呤核苷酸和次黄嘌呤核苷酸.目前一些企业采用湿法工艺生产婴幼儿配方食品.在标准化工艺阶段添加核苷酸后.由于乳中本身含有一定量的磷酸酶会使核苷酸脱磷酸而变成核苷导致核苷酸结果偏低.又因核苷的生理作用与核苷酸近似.若只检测核苷酸,不能真实反映出产品中核苷酸的含量本研究用碱性磷酸酶先将样品中的核苷酸酶解为核苷.以核苷为测定目标物,建立了高效液相收稿日期:20101221作者简介:郝岩乎(1960一),女,高级工程师,研究方向为乳品检测及食品安全色谱法测定婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸总量的简便,准确的检验方法.1仪器与材料主要仪器:天平,ph计,培养箱,电炉,水浴锅,微波炉.高效液相色谱仪:配有二极管阵列检测器或紫夕检测器试剂:淀粉酶.盐酸,氢氧化钠,乙酸,醋酸钠,碱性磷酸酶.叠氮化钠,甲醇,磷酸氢二钾,磷酸二氢钾,核苷酸标准品.核苷标准品.2样品的处理方法的确定2.1蛋白质分离的方式样品的处理主要考虑的是既能将样品中的蛋白质分离出去.又能将核苷酸无损失的提取出来.为此将样品用水溶解,用质量分数为10%乙酸及调ph值的方法沉淀蛋白质:10%乙酸沉淀蛋白沉淀蛋白质的方法是将充分溶解的样品转入50ml-w-量瓶中,加入482,9卷第期(总第245f1.-.-.-)inspectionmethods测定方法5ml质量分数为10%乙酸,定容,充分混匀后用滤纸过滤:调ph法沉淀蛋白质的方法是用稀盐酸溶液将充分溶解的样品溶液lph值调至4.5,转入50lnl容量瓶中用水定容,混匀,用滤纸过滤.上述滤液通过0.45m的滤膜过滤后上机测定通过对测定色谱图进行分析后发现:上述处理方式沉淀蛋白,杂质峰都多,且与目标峰分离不开.进一步去除杂质后,通过调ph来沉淀蛋白质的方法杂质少.分离情况好.根据上述蛋白质分离方法的比较,确定采用调ph值来沉淀蛋白质的方法.2.2最佳酶解的条件的选择酶解ph值的选择:经过大量的实验确定酶解的最佳ph值为8.2.酶用量及酶解时间长度的选择:碱性磷酸酶价格较高.它的用量直接影响到酶解的效果及本方法的操作成本和检测速度.实验表明碱性磷酸酶的用量越大需要的酶解时间越短.碱性磷酸酶用量越少需要的酶解时间越长.经过大量实验摸索比对.结果表明每1g样品用30活力单位的酶.酶解3h即可达到最佳效果2.3去除其他杂质的方式在去除蛋白后还有许多杂质影响分析.曾经考虑采用预柱分离的方法去除这些杂质,试过几种预柱.效果都不理想.经过与预柱专家细致的讨论切磋后决定放弃使用预柱分离.并大量查阅资料,同时与乳品工艺专家请教讨论.尝试着在沉淀蛋白过滤后酶解前进一步调样品13ph值到碱性,酶解后加热,去除杂质.实验过程如下:调ph值所用试剂的选择:使用磷酸氢二钾,氢氧化钠,醋酸钠调样品tlph值至碱性,酶解后加热.去除杂质.结果表明用氢氧化钠i.1ph值的效果比用其他缓冲盐调ph值的效果要好,杂质明显的少,故选定用氢氧化钠调dh值.ph值的控制:ph值从7.59.0作了大量实验,结果表明ph值为8.2为最佳.即可满足酶解的要求又可有效的去除杂质加热方式的选择:比较了用微波炉加热,热水浴加热及电炉加热等加热方式.感觉差别不大.但加热速度应尽量快,鉴于微波对人体有害,热水浴加热速度慢且不方便.故采用事先预热好的电炉加热的方式.3色谱条件3.1色谱柱的选择色谱柱性能是待测物能否达到理想的分离度,方法成功的关键之一在色谱柱的选择上.先后采用了phenomenexluna5mc18250mmx4.60mm,phenomenexluna5ixmc18150ramx4.60mm,diamonsilc185m250mmx4.60mm结果发现:phenomenexluna5mc18150mmx4.60mm柱分离效果好,检测时间短.因此,选jphenomenexluna5mc18150mxn4.60rnrn,.3.2流动相的选择3.2.1流动相的组成成分的选择资料上测定核苷酸的流动相种类很多.有用水的,磷酸盐,草酸盐,醋酸盐的等等,经过比较磷酸盐效果更好一些.选用浓度为o.01mol/l的磷酸二氢钾作为流动相主成分.盐的浓度极低对于色谱柱的寿命大有益处.3.2.2流动相的ph值流动相的ph值影响到目标物质的出峰时间及与杂质的分离效果,考虑到各个核苷的性质,对ph值在3.07.0之间的流动相进行实验,试验证明:ph为6.0时,经过酶解后的核苷酸的5个色谱峰以及杂质峰能够完全分开,灵敏度比较高,最终确定选择ph值为.3甲醇的体积分数由于色谱柱分离耗时极长,我们考虑在流动相中加入部分甲醇.以缩短分离时间.经过大量实验最终决定在流动相b液中加入质量分数为10%的甲醇.3.3梯度洗脱条件的选择由于色谱分离耗时极长.一度达到一个样品在色谱仪上运行需要的时间为1.5h.无论怎么调整都没有明显效果,最终决定采用梯度洗脱的方法,经过大量摸索确定了洗脱条件.在下面条件下每个样品色谱分离所需时间缩短/j22min表1梯度洗脱程序4核苷酸转化成核苷的转化率用核苷标准品对核苷酸标准溶液进行测定.每份标准溶液加1mg碱性磷酸酶,酶解3h.对每种核苷酸转化为核苷的效率进行了实验研究.结果表明:cmp,ump-gmp3种核苷酸转化为核苷的转化率达100%:由于在酶解过程中,其中的amp全部转化为肌苷.所以最终测定的实际上是amp与imp之和经试验证明与分别对p与imp酶解后的测定结果之和与混合酶解后的测定结果无差异.说明amp全部转化为肌苷后对测定核苷酸总量结果不受影响.实验结果如表2所示.5标准和试样核苷酸色谱图图1图3为核苷酸标样,样品,样品+核苷酸(复合)色谱图.图中出峰顺序为cmp(3.75rain),ump(5.35min),imp(+amp)(10.6min),gmp(11.5min).t/min图1核苷酸标样色谱图o0.no4,lo试249测定方法inspectionmethods表3核苷酸标准系列质量浓度及峰高间回归方程与相关系数图2样品色谱图3.ooit3样品+核苷酸(复合)色谱图6标准曲线的绘制00将核苷酸标准溶液用dh值为8.2+0.1的水稀释成不同浓度的标准系列.加碱性磷酸酶,放入培养箱中在37下培养3h取出,放在事先预热好的电炉上,强火加热至刚刚沸腾.取下冷却至室温,水定容配成核苷酸系列标准工作液分别用不同浓度的标准工作液进样,以浓度为横坐标.峰高为纵坐标,绘制标准工作曲线,通过回归计算求得回归方程和相关系数.可见在一定质量浓度范围内质量浓度与峰高间呈正相关.相关性好.可用于外标法进行定量测定.结果如表3所示.7准确度实验选择奶粉,豆粉,米粉作为测试样品,并向样品中加入一定量的标准溶液.采用前面确定的方法处理测定.结果如表4所示.由表4可以看出,回收率均在92.4%103.7%之间,该方法准确度满足实验要求.表4方法回收率实验8精密度实验取奶粉,豆粉,米粉样品各3个梯度,每个梯度重复测定6次.结果如表5所示.由表5可以看出.各类样品各个梯度的日内重复测定标准偏差均小于10%,符合实验要求.9检出限及定量限9.1方法最低检出限根据gb/t5009.12003.中a2.1色谱法的计算方5ol匀卷第4期.(总系245-jy)inspectionmethods测定方法法.计算检出限:检出限=垦堡堕笪:式中:6为标准曲线回归方程中的斜率,响应值/微克或响应值/纳克:s为仪器噪音的3倍,即仪器能辨认的最小的物质信号.结果确认检出限:cmp0.07mg/l;ump为0.08mg/l;imp+amp为0.05mg/l;gmp0.04mg/l.9.2样品定量限根据定量限定义.以信噪比为10倍时的溶液浓度为定量限.考虑称样量及样品处理过程中的稀释倍数.计算出本方法样品的定量限如下:cmpump定量限为0.6mg/100g.定量限为0.7mg/loog.imp+amp定量限为0.5mg/100g.gmp定量限为0.4mg/100g.10最终实验方法的确定样品处理:5g样品温水溶解,调ph值为4.5,用水定容50ml,过滤,加碱性磷酸酶,调ph值为8.2,在37下酶解3h.取出快速加热沸腾.冷却定容.过滤,上机.色谱条件:流动相a液浓度为0.01mol/l酸二氢钾(ph值为6.0),质量分数为0.02%j氮化钠;了流动相b液浓度为0.01mo1/l磷酸二氢钾(ph值为6.0),质量分数o.02%迭氮化钠,质量分数为10%甲醇色谱柱为c18色谱柱(150x4.6mm,5m);流速为1ml/min;波长为254ylm;柱温为(302);进样体积为50l.色谱程序如表6所示表6梯度洗脱程序11结论经实验验证:本方法的简便,快速,可操作性强,成本低.其准确性,重现性,检出限等完全能满足婴幼儿配ytr-品中核苷酸含量测定的要求本方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸总量的测定.包括:胞嘧啶核苷酸(cmp),尿嘧啶核苷酸(ump).腺嘌呤核苷酸(amp),鸟嘌呤核苷酸(gmp).次黄嘌呤核苷酸(imp).12讨论12.1核苷酸酶解为核苷情况从牛肠黏膜提炼而来的碱性磷酸酶(p7640),可以将5种核苷酸脱磷酸转fl为相应的核苷:胞嘧啶核苷酸(cmp)转化为胞苷,尿嘧啶核苷酸(ump)转化为尿苷.腺嘌呤核苷酸(amp)转化为腺苷.鸟嘌呤核苷酸(gmp)转化为鸟苷,次黄嘌呤核苷酸(imp)转化为肌苷.其中的腺苷进一步脱氨转化为肌苷.腺苷进一步转化为肌苷的程度因酶解条件的不同而变化,经试验无论转化程度如何.其腺苷和肌苷含量的总和基本不变鉴于本标准测定的是五种核苷酸的总量.为提高测定结果的准确度.采用了可使腺苷全部转化为肌苷的酶解条件.计算时只计算imp的质量分数.其他三种核苷酸仍分别计算.核苷酸总量即为实际测定的是涵盖有amp的五种核苷酸测定结果的总和12.2本方法核苷酸测定结果的讨论由于碱性磷酸酶在将核苷酸转化为核苷后.测定的实际上是测定核苷的量由于样品中往往存在质量分数不等的游离态核苷成分.该法测定结果也包括在内.所以测定结果往往比实际添加的核苷酸偏高对于以乳基为主的样品中的本地值较低.其核苷酸的测定结果差异较小:但对于含豆基的样品则本底值相对较高采用该法分别对全脂奶粉与速溶豆粉样品进行了本底值的测定:全脂奶粉一般在(21o)rag/1oog.速溶豆粉一般在(20100)mg/100g.由此可看出:采用该法测定的核苷酸质量分数并非全部为添加的核苷酸.还包括了样品本身含有的核苷等所以在使用不同的原料时应注意本地值的质量分数.以便使产品中核苷i测定方法inspectionmethods酸的总量不要超过标准规定.本方法样品处理过程中不加碱性磷酸酶可直接测定样品中的游离核苷质量分数.参考文献:1isabelmplv0.thedeterminationanddistributionofnucleotidesindairyproducusinghplcanddiodearraydetectionfjjfoodchemistry,2001,74:239-244.【2j2杨大进,方从容.婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量的测定方法研究卟中国食品卫生杂志,2003,15:496499.3张燕婉,鲁红军,王津生.高效液相色谱法测定食品中核苷酸的含量li1l食品科学,1994(6):59624张宗岩.牛乳的物理化学m1.黑龙江:黑龙江科学技术出版社,1995.关注健康产业,龙力生物给力新资源食品研究新资源食品应用与发展高峰论坛在上海举行近年来在食品领域.新资源食品发展迅速.大量的研究证实,新资源食品大多具有一定的健康功效.对人体健康具有一定的改善意义.3月24日,新资源食品发展与应用高峰论坛在上海的成功举行.对我国新资源食品的发展意义深远新资源食品是食品的一个类别.符合食品的基本属性,可以说它是一类特殊的食品但与传统食品相比,新资源食品在我国无食用习惯.卫生部会根据新资源食品使用情况.适时公布新资源食品转为普通食品的名单.把新资源食品划入普通食品之列由中国食品添加剂和配料协会新资源食品配料分会,山东龙力生物科技股份有限公司,石家庄君乐宝乳业有限公司联合主办的新资源食品应用与发展高峰论坛在上海光大会展中心光韵1号厅成功举行国家公众营养与发展中心主任于小冬先生.中国乳制品工业协会理事长宋昆冈先生.中华预防医学会微生态分会主任熊德鑫教授.中国营养学会副会长,中国食品添加剂协会新资源分会副主任杨月欣教授.禹城市人民政府市长张磊.中国食品添加剂协会新资源分会秘书长,江南大学江波教授,中国农业大学高彦祥教授,中国轻工联合会资深专家尤新教授.新资源分会会员单位代表.新资源食品应用企业的专家及领导等300余人汇聚一堂.共同研究,探讨我国新资源食品的应用发展现状如何通过新资源食品实现公众营养改善.达到有效健康管理的目的此次论坛是由中国食品添加剂和配料协会副理事长杜雅正主持禹城市人民政府市长张磊.中国乳制品工业协会宋昆冈理事长.国家公众营养与发展中心主任于小冬先生分别致辞.张磊介绍了禹城作为中国功能糖城的发展现状.并对龙力生物为代表的禹城功能糖生产企业提出了更高的要求宋昆冈理事长指出把合生源添加到乳制品中符合乳制品健康,功能化的发展趋势.他鼓励更多的乳品生产企业研发有益人体健康的新产品:于小冬主任对近年来新资源食品在改善公众营养,食品安全等方面的成绩给予了肯定.并祝愿新资源食品会发展的更好中国食品添加剂和配料协会副理事长,新资源分会主任,山东龙力生物科技股份有限公司董事长程少博发表了热情洋溢的讲话.他首先感谢了行业领导,专家的参与,并表示龙力公司将继续加大新资源食品的研发力度.推动新资源食品行业健康