酶的早期利用.ppt

第八章酶通论 酶的早期利用 公元前21世纪 我国人民就会酿酒 19世纪中叶对发酵本质的探讨 1833年payen和persoz 淀粉糖化酶 diastase 19世纪70年代pasteur 发酵是酵母细胞活动的结果1878年k hne enzyme 在酵母中 1897年b chner兄弟 用酵母提取液实现发酵 1907年的诺贝尔化学奖 关于酶的化学本质的认识 1926年 sumner从刀豆种子中分离 纯化得到了脲酶结晶 首次证明酶是具有催化活性的蛋白质 1949年诺贝尔化学奖 1982年cech从四膜虫发现rrna的自身催化作用 并提出了核酶 ribozyme 的概念 1989年诺贝尔化学奖 酶反应机制的研究 1894年fisher 锁钥学说 1903年henri 中间复合物学说 1913年 michaelis和menten提出了酶促动力学原理 米氏学说 1925年 briggs和handane对米氏学说做了一项重要修正 提出稳态学说 邹承鲁60年代初 提出酶蛋白必需基团的化学修饰和活性丧失的定量关系公式和确定必需基团数的方法 分别被称为 邹氏公式 邹氏作图法 还提出了酶活性部位的柔性学说 主要内容 酶催化作用的特点酶的化学本质及其组成酶的命名和分类酶的专一性酶的活力测定和分离纯化核酶和抗体酶酶工程简介 8 1 酶催化作用的特点 一 酶是催化剂 降低酶促反应活化能 8 1 酶催化作用的特点 二 酶是生物催化剂反应条件温和 常温常压 中性ph 酶易失活 酶具有很高催化效率 比非催化反应一般可提高108 1020倍 酶具有高度专一性 反应专一性 底物专一性 酶活性受调节控制 酶活力受到调节和控制 调节酶浓度激素控制反馈调节抑制剂或激活剂调节别构调控 共价修饰调节 酶原激活等 8 2 酶的化学本质及其组成 一 酶的化学本质 目前发现的大多数酶符合蛋白质的特性 是蛋白质 有些酶的成分是rna 称为核糖酶 8 2 酶的化学本质及其组成 二 酶的化学组成简单蛋白质 除蛋白质外 不含其它物质 如脲酶 蛋白酶 淀粉酶 脂肪酶等 缀合蛋白质 除蛋白质外 还包含了非蛋白组分 辅助因子 如细胞色素 丙酮酸氧化酶等 几个概念 脱辅酶 酶蛋白 apoenzyme apoprotein 辅助因子 cofactor 全酶 holoenzyme 辅基 prostheticgroup 辅酶 coenzyme 8 2 酶的化学本质及其组成 三 单体酶 寡聚酶 多酶复合体单体酶 通常由一条肽链组成 如溶菌酶 寡聚酶 二个或以上的亚基组成 亚基可以是相同的 也可不同 通常是偶数个亚基 亚基之间以次级键结合 如苹果酸脱氢酶 过氧化氢酶 多酶复合体 由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成 如丙酮酸脱氢酶复合体 脂肪酸合成酶复合体等 8 3 酶的命名与分类 习惯命名 根据底物或作用性质来进行命名如淀粉酶 胃蛋白酶 胰蛋白酶 过氧化氢酶 国际系统命名 明确酶催化反应的底物与反应性质 如 乙醇 nad 氧化还原酶丙氨酸 酮戊二酸氨基转移酶脂肪 水解酶 8 3 酶的命名与分类 酶的国际系统分类1 氧化还原酶类2 转移酶类3 水解酶类4 裂合酶类5 异构酶类6 合成酶 连接酶 类 氧化 还原酶类oxido reductases 氧化 还原酶催化氧化 还原反应 主要包括脱氢酶 dehydrogenase 和氧化酶 oxidase 如 乳酸 lactate 脱氢酶催化乳酸的脱氢反应 转移 移换 酶类transferases 转移酶催化基团转移反应 即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上 例如 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应 水解酶类hydrolases 水解酶催化底物的水解反应 主要包括淀粉酶 蛋白酶 核酸酶及脂酶等 例如 胰蛋白酶 trypsin 催化的肽链的水解反应 裂合 裂解 酶类lyase 主要包括醛缩酶 水化酶 脱水酶 及脱氨酶等 裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子而形成双键的反应及其逆反应 例如 丙酮酸脱羧酶催化的反应 异构酶类isomerases 异构酶催化各种同分异构体的相互转化 即底物分子内基团或原子的重排过程 例如 丙氨酸消旋酶催化的反应 合成酶类ligasesorsynthetases 合成酶 又称为连接酶 能够催化c c c o c n以及c s键的形成反应 这类反应必须与atp分解反应相互偶联 a b atp h o h a b adp pi例如 谷氨酰胺合成酶催化的反应 8 4 酶的专一性 酶的专一性即特异性 substratespecificity 指酶对它所作用的底物有严格的选择性 一种酶只能作用于某一种或某一类结构性质相似的物质 酶的专一性类型 结构专一性和立体异构专一性 结构专一性 绝对专一性 absolutespecificity 有些酶对底物的要求非常严格 只作用于一个特定的底物 这种专一性称为绝对专一性 absolutespecificity 例如 脲酶 麦芽糖酶 淀粉酶 碳酸酐酶及延胡索酸水化酶 只作用于反丁烯二酸 等 结构专一性 相对专一性 relativespecificity 对象不是一种底物 而是一类化合物或一类化学键 包括 族 group 专一性 对键两端的基团要求的程度不同 只对其中一个基团要求严格 如 葡萄糖苷酶 催化由 葡萄糖所构成的糖苷水解 但对于糖苷的另一端没有严格要求 胰蛋白酶 水解硷性氨基酸的羧基形成的肽键 键 bond 专一性 如酯酶催化酯的水解 对于酯两端的基团没有严格的要求 立体异构专一性stereochemicalspecificity stereospecificity 旋光异构专一性酶的一个重要特性是能专一性地与手性底物结合并催化这类底物发生反应 即当底物具有旋光异构体时 酶只能作用于其中的一种 例如 淀粉酶只能选择性地水解d 葡萄糖形成的1 4 糖苷键 l 氨基酸氧化酶只能催化l 氨基酸氧化 乳酸脱氢酶只对l 乳酸是专一的 立体异构专一性stereochemicalspecificity stereospecificity 几何异构专一性geometricalspecificity有些酶只能选择性催化某种几何异构体底物的反应 而对另一种构型则无催化作用 如延胡索酸水合酶只能催化延胡索酸即反 丁烯二酸水合生成苹果酸 对马来酸 顺 丁烯二酸 则不起作用 酶作用专一性的假说 锁钥学说 1894年emilfischer lockandkey或模板学说 temolate 认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的 酶表面具有特定的形状 酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样 酶作用专一性的假说 诱导契合学说 1958年d koshland inducedfit 该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状 而只是由于底物的诱导才形成了互补形状 从而有利于底物的结合 四个要点 诱导契合学说的要点 酶有其原来的形状 不一定一开始就是底物的模板底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化 专一性结合 当酶的形状发生变化后 就使得其中的催化基团形成正确的排列 在酶反应过程中 酶活性中心构象的变化是可逆的 即酶与底物结合时 产生一种诱导构象 反应结束时 产物从酶表面脱落 酶又恢复其原来的构象 inducedfit inducedfit inducedfit catalyzesphosphorylationofglucosetoglucose6 phosphateduringglycolysissuchalargechangeinaprotein sconformationisnotunusualbut notallenzymesundergosuchlargechangesinconformationnotonlyenzymeschangetheirconformations manystructural motor proteinsundergolargeconformationalchangesduringtheir cycles hexokinase 8 5 酶的活力测定和分离纯化 酶活力 enzymeactivity 酶活力是指酶催化某一反应的能力 通常用反应产物的增加速率来表示 测定时通常测定反应初速率 以底物浓度的变化在5 以内的速率为初速率 8 5 酶的活力测定和分离纯化 酶的活力单位 u activityunit 1961年 提出用 国际单位 iu 表示酶活力 即 1个酶活力单位 是指在特定条件下 1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量 或转化底物中1微摩尔有关基团的酶量 25 c 最适底物浓度和最适ph 1iu mol min1972年 提出新的酶活力国际单位 最适条件下 每秒钟能催化1mol底物转化为产物所需的酶量 定为1kat 1mol s所以 1kat 60x106iu 酶的比活力 酶的比活力用来表示酶的纯度 即每mg蛋白质所含的酶活力单位 比活力 活力u mg蛋白质 总活力u 总蛋白mg有时也用单位酶制剂中含有的活力单位来表示 如u g u ml 8 5 酶的活力测定和分离纯化 酶活力测定方法 1 分光光度法 spectrophotometry 多利用产物在紫外或可见光部分的光吸收性质 选择适当波长 测定反应过程的进行情况 简便 节约时间和样品 可以检测nmol l水平的变化 2 荧光法 fluorometry 主要利用底物或产物的荧光性质 灵敏度高 但易受到干扰 3 同位素测定法 同位素标记底物 反应后经分离 检测产物的脉冲数 即可换算成酶的活力单位 灵敏度最高 4 电化学方法 ph计 氧电极法 农药残留分析 分光光度法测乙酰胆碱酯酶活性 酶的分离与纯化 选材破碎细胞抽提分离与提纯盐析 有机溶剂沉淀 选择性变性 柱层析 制备电泳 加入edta可防重金属离子的影响 加入巯基乙醇可防酶在制备时被氧化 结晶保存 8 6 核酶和抗体酶 核酶有些rna具有生物催化功能 统称为ribozyme 1982年 cech等以原生动物嗜热四膜虫为材料 研究rrna的基因转录问题时发现 rrna前体在鸟苷和mg2 存在下 切除自身的内含子 使两个外显子拼接起来 成为成熟的rrna分子 进一步研究证明 这个内含子rna分子具有特定的三维结构 可以再进行催化反应 8 6 核酶和抗体酶 核酶作用的特点化学本质 rna dna底物 rna 肽键 葡聚糖 dna反应特异性 专一性 碱基催化效率 低 8 6 核酶和抗体酶 核酶的分类 8 6 核酶和抗体酶 抗体酶本质上是免疫球蛋白 但是在可变区被赋予了酶的属性 称为抗体酶 思路 根据中间复合物学说 酶要与其底物形成过渡态中间复合物 这个复合物中的底物处于一种旧键将断未断 新键将成未成的状态 叫做过渡态底物 然后 产物才被释放 反过来 如果有一种物质能够与过渡态底物专一接合 那它是否能成为该底物的酶呢 抗体酶的制造方法 首先要设计出过渡态底物的类似物 将其注入动物体内 诱导出抗体 提取抗体 将它与真正的底物反应 看看能不能催化 应用前景 可以产生出自然界不存在的酶 具有不可估量的工业应用前景 原则上来说 今后所有的工业都可以被酶促反应来代替 8 6 核酶和抗体酶 8 7 酶工程简介 化学酶工程天然酶化学修饰