Rap1GAP基因对宫颈癌HeLa细胞系增殖、迁移、侵袭能力的影响--优秀毕业论文 可复制黏贴.pdf

r a p i g a p 基因对宫颈癌h e l a 细胞系增殖 迁移 侵袭能力的影响 计 学位论文 3 3 页 表格 5 个 插图 1 i 幅 指导教师 申请学位级别 论文提交日期 学位授予单位 郝明 赵春艳教授 硕士学位专业名称 l 临床检验诊断学 2 0 0 7 年5 月论文答辩日期 2 0 0 7 年5 月 大连医科大学学位授予时间 2 0 0 7 年6 月 评阅人 答辩委员会主席 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地 方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 签字日期 衅年 月粤日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留 使用学位论文的规定 同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机 构送交学位论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授 权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位 论文 论文作者签名 指导教师签名 签字日期 毕年上月早日 r a p l g a p 基因对宫颈癌h e l a 细胞系增殖 迁移 侵袭能力的影响 硕士研究生 郝明 指导教师 赵春艳教授 专业名称 临床检验诊断学 摘要 目的 探讨抑癌基因r a p lg a p 对宫颈癌h e l a 细胞增殖 转移 侵 袭能力的影响及其分子生物学机制 宫颈癌 c a r c i n o m ao fc e r v i x 是全球 妇女中发病率仅次于乳腺癌而占第2 位的恶性肿瘤 近年其发病率上升 发病年龄年轻化 加之人口的老龄化 使得宫颈癌的患病人数较以往有 了明显增多 抑制宫颈癌恶性增殖 侵袭转移对于宫颈癌患者的治疗 预后及提高生存率具有重要意义 目前认为 肿瘤的发生是由调节细胞 增殖 凋亡 基因稳定性 血管生成 浸润或转移的基因异常所启动 在肿瘤细胞多因素 多阶段的转移过程中 抑癌基因能够充分发挥抑制 作用 r a p l g a p r a p lg t p a s e a c t i v a t i n gp r o t e i n1 是r a p l 特异的g t p 酶活化蛋白 催化r a p l 从有活性的g t p 结合形式转变成无活性的g d p 形式 而r a p l 是一种小分子g 蛋白 参与细胞的多种功能 调节细胞 的增殖 分化及整合蛋白介导的细胞基质粘附和钙粘蛋白介导的细胞间 的粘附 r a p l 活性的失调与恶性肿瘤的发生发展有关 因此作为调控 r a pl 活性的r a p 1g a p 与肿瘤的发生发展也会有密切关系 r a p l 功能的发挥具有细胞特异性 如在s w i s s 3 t 3 细胞中 r a p1 能 够促进d n a 合成 加速增殖 而在r a s 转染的n i h 3 t 3 细胞及星形角质 细胞中 抑制增殖 因此 r a p lg a p 的作用也可能具有细胞特异性 本 文选取宫颈癌h e l a 细胞系 探讨r a p lg a p 基因对h e l a 细胞增殖 转 移 侵袭能力的影响 并初步研究r a p1g a p 抑制肿瘤转移的作用机制 方法 选用h e l a 细胞系 人宫颈癌细胞系 h e l a p e g f p 稳定 表达空质粒的人宫颈癌细胞株 和h e l a r a p lg a p 细胞 稳定表达 r a p lg a p 基因的人宫颈癌细胞株 进行体外培养 m t t 法检测r a p lg a p 基因对h e l a 细胞增殖的影响 细胞一基质粘附实验 细胞划痕实验 体 外细胞迁移实验 侵袭实验研究r a p lg a p 基因对h e l a 细胞粘附 迁移 侵袭能力的影响 明胶酶谱技术检测细胞内m m p 蛋白表达水平 结果 1 h e l a r a p 1g a p 细胞组与对照组 未转染组和转染空质粒 组 细胞相比较 生长速度明显减慢 p 0 0 5 2 h e l a r a p lg a p 细 胞组 h e l a p e g f p 细胞组和h e l a 细胞组与f n 粘附率分别为7 4 3 4 5 2 9 0 8 士12 6 和9 2 5 士14 1 h e l a r a p1g a p 细胞组与对照组细胞的差异 有统计学意义 p o 0 5 3 三组细胞迁移距离分别为1 4 6 2 219 2 7 4 6 3 7 8 2 8 7 士5 5 2 9 1 t m h e l a r a plg a p 细胞组与对照组细胞的差异有统计学意 义 p 0 0 5 4 三 组细胞迁移实验穿膜细胞数分别为l 36 2 0 9 2 3 0 2l6 2 士12 8 7 2 2 2 0 8 2 7 013 个 h e l a r a p1g a p 细胞组与对照组细胞的差异有统计学 意义 p 0 0 5 5 三组细胞侵袭实验穿膜细胞数分别为121 4 8 7 3 5 213 0 4 31 8 4 7 2l6 2 6 4 58 个 h e l a r a p lg a p 细胞组与对照组细胞的差异有统计学意 义 p 0 0 5 6 h e l a r a p l g a p 组细胞内m m p 2 m m p 9 表达均明显降低 结论 1 r a p 1g a p 基因抑制宫颈癌h e l a 细胞增殖 2 r a p lg a p 基 因在体外具有抑制宫颈癌h e l a 细胞迁移的作用 3 r a p 1g a p 基因在体 外具有抑制宫颈癌h e l a 细胞侵袭转移的作用 4 r a p 1g a p 基因抑制宫 颈癌h e l a 细胞侵袭转移的可能机制是降低基质金属蛋白酶的表达 关键词 r a p 1g a p增殖迁移侵袭基质金属蛋白酶 2 r a p l g a p i n h i b i t e dt h ep r o l i f e r a t i o n m i g r a t i o na n d i n v a s i o na b i l i t i e so fh e l a p o s t g r a d u a t e h a o m i n g s u p e r v i s o r p r o f e s s o rz h a oc h u n y a n m a j o r c l i n i c a ld i a g n o s i s a b s t r a c t o b j e c t i v e t oe x p l o r et h e e f f e c t so fr a p lg a po nt h ep r o l i f e r a t i o n m i g r a t i o na n di n v a s i o na b i l i t i e s o fh e l aa n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f i n h i b i t i n gi n v a s i o n c e r v i c a lc a n c e rr a n k ss e c o n do n l yt o b r e a s tc a n c e ri n w o m e nm a l i g n a n tt u m o r sg l o b a l l y i nr e c e n ty e a r s t h ei n c i d e n c ei n c r e a s e s s i g n i f i c a n t l yw i t hi n c r e a s i n gi n c i d e n c er a t e e a r l i e ra g eo fo n s e ta n da g i n g t oi n h i b i tu t e r i n ec e r v i xc a n c e rc e l lp r o l i f e r a t i o n i n v a s i o na n dm e t a s t a s i s h a st h ev i t a ls i g n i f i c a n c e f o rm a l i g n a n tt u m o rt r e a t m e n ta n de n h a n c e s c a n c e r p a t i e n t s s u r v i v a l r a t e t u m o rg e n e s i si sr e g u l a t e db y g e n e a b n o r m a l i t yi n c e l lp r o l i f e r a t i o n a p o p t o s i s g e n es t a b i l i t y a n g i o g e n e s i s i n v a s i o no rm e t a s t a s i s a n t i o n c o g e n ei n h i b i t st u m o rm e t a s t a s i sd u r i n gt h e m u l t i f a c t o ra n dm u l t i s t a g ep r o c e s s r a p lg a p r a p lg t p a s e a c t i v a t i n g p r o t e i n1 i saf a m i l yo fp r o t e i n sw i t hg a p f u n c t i o ns p e c i f i cf o rr a p1 w h i c h c a t a l y z e sa c t i v a t e dr a p 1 g t pi n t oi n a c t i n a t e dr a p1 g d p r a p1 i sas m a l l g t p b i n d i n gp r o t e i n w h i c h c o n t r o l s p r o l i f e r a t i o n d i f f e r e n t i a t i o n a n d a d h e s i o n r e l a t e df u n c t i o n ss u c h a sc e l l c e l lc o n t a c t sa n df u n c t i o n a l a c t i v a t i o no fi n t e g r i n s d i s t u r b a n c eo fa c t i v er a p 1c o n t r i b u t e st ot h e p a t h o g e n e s i s a n d d e v e l o p m e n t o f m a l i g n a n tt u m o r s t h e r e f o r e a s a r e g u l a t o rd u r i n gr a p la c t i v a t i o n r a p1g a pw i l lp r o v et o b eoneh i g h l y r e l e v a n tf a c t o ri nt h es a m ep r o c e s s e f f e c t so fr a p1a r ec e l lt y p es p e c i f i c f o re x a m p l e o v e r e x p r e s s i o no f r a p 1i ns w i s s3 t 3c e l l si n d u c e sd n as y n t h e s i sa n dd e c r e a s e sd o u b l i n g t i m e b u ti n h i b i t sp r o l i f e r a t i o n i nr a st r a n s f e c t e dn i h 3 t 3c e l l s a n d a s t r o c y t e s a c c o r d i n g l y t h e f u n c t i o n o fr a p 1g a pi sp r o b a b l yc e l lt y p e s d e c i f i c t h i sa r t i c l ee x p l o r e st h ee f f e c t so fr a p 1g a po nt h ep r o l i f e r a t i o n m i g r a t i o na n di n v a s i o na b i l i t i e so fh e l aa n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f i n h i b i t i n gi n v a s i o n m e t h o d s t h eu t e r i n ec e r v i xc a n c e rh e l ac e l l s h e l ac e l l s s t a b l y e x p r e s s i n gg f pa n dh e l ac e l l ss t a b l ye x p r e s s i n gr a p 1g a pw e r ec u l t u r e di n v i t r o t h ee f f e c t so fr a p1g a po np r o l i f e r a t i o ni nh e l aw e r ed e t e c t e db y m t tt e s t t os t u d yt h ee f f e c t so ft h er a p1g a po ni n h i b i t i n gh e l aa d h e r e i n v a d ea n dm i g r a t et h r o u g hc e l la d h e r s i o na s s a y c e l lw o u n dh e a l i n ga s s a y m a t r i g e li n v a s i o na s s a ya n dt r a n s w e l lm i g r a t i o na s s a y m m p 2a n dm m p 一9 w a sd e t e c t e db yg e l a t i nz y m o g r a p h y r e s u l t s 1 c o m p a r e d w i t hc o n t r o l g r o u p s u n t r a n s f e c t e dg r o u p a n d e m p t yp l a s m i dt r a n s f e c t e dg r o u p g r o w t hv e l o c i t yd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y p 0 0 5 2 t h ea d h e r e n t r a t et of ni n h e l a r a p 1g a pd e c r e a s e d c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p s p 0 0 5 3 t h e r ew a ss t a t i s t i c a ld i f f e r e n c e b e t w e e nh e l a r a p1g a pa n dc o n t r o lg r o u p si nm i g r a t i o nd i s t a n c e 4 c e l l s c o u n t sw e r em u c hl e s si nh e l a r a p1g a pt h a ni nc o n t r o lg r o u p si nm a t r i g e l i n v a s i o na s s a ya n dt r a n s w e l lm i g r a t i o na s s a y 5 t h es y n t h e s i sa n da c t i v a t i o n o fm m p 一2a n dm m p 9i nh e l a r a p1g a pw a sl o w e r c o n c l u s i o n s 1 r a p lg a pc ano b v i o u s l yi n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no fh u m a nu t e r i n e c e r v i xc a n c e re e l ll i n eh e l ai nv i t r o 2 r a plg a pi n h i b i t e dt h em i g r a t i o no fu t e r i n ec e r v i xc a n c e rc e l l l i n e h e l ai nv i t r o 3 r a p l g a pi n h i b i t e dt h ei n v a s i o no fu t e r i n ec e r v i xc a n c e rc e l l l i n e h e l ai nv i t r o 4 s u p p r e s s i n gt h ee x p r e s s i o no fm m p 2a n dm m p 一9m a yb eaf e a s i b l e w a y b yw h i c hr a p 1g a pe d u c e si t si n h i b i t i n ge f f e c ti nh e l ac e l l si n v a s i o n k e yw o r d s r a p 1g a pp r o l i f e r a t i o n m i g r a t i o n i n v a s i o nm m p 4 r a p 1g a p 基因对宫颈癌h e l a 细胞系增殖 迁移 侵袭能力的影响 硕士研究生 郝明 指导教师 赵春艳教授 专业名称 临床检验诊断学 1 l k 刖罱 肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病之一 肿瘤的发生由调节细胞 增殖 凋亡 基因稳定性 血管生成 浸润或转移的基因异常所启动 所以了解对细胞恶变起抑制作用的基因 将会为肿瘤发病机制的研究 早期诊断等提供线索 子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一 是妇女癌 症死亡的首要原因1 2 j 也是发展中国家最常见的癌症 最近的全球资料 显示 在全世界妇女中 每年的新发病例数为4 6 6 0 0 0 其中8 0 病例发 生在发展中国家 我国每年新发病例3 15 万 约占世界宫颈癌新发病例 的2 8 8 3 抑制宫颈癌恶性增殖 侵袭转移对于宫颈癌患者的治疗 预 后及提高生存率具有重要意义 因此 宫颈癌癌细胞增殖 迁移 侵袭 转移的机制研究至关重要 r a p l g a p r a p lg t p a s e a c t i v a t i n gp r o t e i n1 含有6 6 3 个氨基酸 分 子量为8 3 k d a 是r a p l 特异的g t p 酶活化蛋白 4 催化r a p l 从有活性 的g t p 结合形式转变成无活性的g d p 形式 而r a p1 是一种小分子g 蛋 白 参与细胞的多种功能 调节细胞的增殖 分化及整合蛋白介导的细 胞基质粘附和钙粘蛋白介导的细胞间的粘附 r a p l 活性的失调与恶性肿 瘤的发生发展有关 5j 因此作为调控r a p l 活性的r a p lg a p 与肿瘤的发 生发展也会有关系 r a pl 功能的发挥具有细胞特异性 如在s w i s s 3 t 3 细胞中 r a p l 能 够促进d n a 合成 加速增殖 而在r a s 转染的n i h 3 t 3 细胞及星形角质 细胞中 抑制增殖 6j 因此r a p lg a p 的作用也可能具有细胞特异性 本 课题选取宫颈癌h e l a 细胞系 探讨r a p lg a p 基因对h e l a 细胞系增殖 粘附 迁移 侵袭能力的影响 进一步检测r a p lg a p 基因对h e l a 细胞 内基质金属蛋白酶 m m p 表达的影响 探讨其是否通过调节m m p 的 表达水平发挥抑制肿瘤转移的作用 材料与方法 1 材料 1 1 细胞 h e l a 购自中科院上海细胞所 h e l a p e g f p h e l a r a p l g a p 细胞由本实验室购建 h e l a p e g f p h e l a r a p l g a p 细 胞由本实验室转染 g 418 筛选 w e s t e r nb l o t t i n g 鉴定 保存 1 2 主要试剂 d m e m 细胞培养基购自g i b c o 公司 g 418购自g i b c o 公司 新生牛血清购自g i b c o 公司 庆大霉素购自大连医科大学附属二院 纤维粘连蛋白f n购白北京医科大学生物教研室 t r a n s w e l l 培养板 滤膜孔径8 1 tm 购自c o r n i n g 公司 人工基底膜胶 m a t r i g e l 购自s i g m a 公司 二甲基偶氮唑蓝 m t t 购自s i g m a 公司 u n i v e r s a lg e n o m i cd n ae x t r a c t i o nk i tv e r 3 0购自t a k a r a 公司 1 3 主要仪器 目测微尺武汉恒岭科技有限公司 倒置显微镜o l y m p u sx d s 5 0 0 c日本o l y m p u s 公司 酶标仪t h e r m op x e7 0美国t h e r m o 公司 荧光显微镜o l y m p u sd p 7 0日本o l y m p u s 公司 凝胶成像仪u v p b i o s p e c t r u m a c 美国u v p 公司 2 方法 2 1 细胞培养 2 1 1 细胞的复苏 取出在一8 0 0 c 冰箱中保存的h e l a h e l a p e g f p h e l a r a p lg a p 三种细胞 3 7 水浴1m i n 内解冻 吸 取细胞悬液至离心管中 补加5 m i d h a n k s 液 2 0 0 0 r r a i n 室温低速离心 5 m i n 去上清 用培养液适当稀释后装入培养瓶中 h e l a 细胞用含10 小牛血清 庆大霉素10 0 1 x g m l 的d m e m 培养液 h e l a p e g f p h e l a r a p lg a p 两种细胞用含1o 小牛血清 庆大霉素10 0 l t g m l 和g 4 l8 8 0 0 g m l 的d m e m 培养液 以下实验三种细胞培养用液均按以上叙 述 置于3 7 0 c 5 c 0 2 培养箱内培养 次日更换培养液 2 1 2 细胞的传代 细胞长成单层后即可传代 弃去旧培养液 加入 少许0 2 5 胰酶室温下消化 镜下观察 若细胞已相互分离 间隙加大 6 胞体趋于变圆时 立即弃去消化液 加2 m l 细胞培养液终止消化 用弯 头吸管轻轻吹打细胞 制备细胞悬液 用吸管取适量细胞悬液接种于新 培养瓶中 于3 7 0 c 5 c 0 2 培养箱内培养 2 2 荧光显微镜检测转染细胞中g f p 蛋白表达 倒置显微镜观察正常培养状态下的h e l a 细胞 h e l a p e g f p 细胞和 h e l a r a p lg a p 细胞生长状态 荧光显微镜4 8 8 n m 波长检测h e l a p e g f p 和h e l a r a p 1g a p 细胞中g f p 蛋白的表达 2 3 细胞生长曲线的绘制 分别取对数生长期的h e l a h e l a p e g f p 和h e l a r a p lg a p 细胞 调整细胞浓度后 以1 l0 3 孔的细胞数接种于9 6 孔板 每组设六个平行 孔 分别常规培养1 2 3 4 5 6 d 每天测定吸光度前4 h 加入m t t 液 4 h 后加入溶解液二甲基亚砜 d m s o 振荡10 m i n 待结晶完全溶解 后用全自动酶标仪在4 9 0 n m 波长处测定每孔吸光度值 共六天 绘制生 长曲线 上述实验独立重复三次 2 4d n a 梯状电泳 d n al a d d e r 凋亡检测 预冷p b s 洗h e l a h e l a p e g f p h e l a r a p l g a p 三组细胞 按 u n i v e r s a lg e n o m i cd n ae x t r a c t i o nk i tv e r 3 0 试剂盒说明书提取三组细 胞的基因组d n a 12 0 v 电压 2 a g a r o s e 凝胶电泳30 m i n 凝胶成像 仪观察结果 2 5 细胞一基质粘附实验 c e l la d h e r s i o na s s a y 1 用p b s 将纤维粘连蛋白 f n 配成o 0 2 u g u l 9 6 孔板每孔铺5 0 u l 4 包被过夜 2 5 b s a 于3 7 封闭培养4 0 m i n 适量无血清d m e m 培养液漂洗 3 次 洗去多余的f n 3 分别制备h e l a h e l a p e g f p 和h e l a r a p 1g a p 细胞悬液 以4 x10 5 个细胞 孔的浓度分别接种于上述处理过的孔中 每种细胞各设9 个重复孔 4 置3 7 5 c 0 2 培养箱内培养12 h 5 取每组6 个重复孔细胞上清液 4 c 12 0 0 0 r m i n 离心用于酶谱分 析 p b s 洗6 个重复孔细胞 其余未洗3 个孔用于总细胞吸光度a 值的 测定 6 每孔加入m t t1 0 u l 5 9 l 置3 7 0 c 5 c 0 2 培养箱内继续培养 4 h 每孔加入二甲基亚砜2 0 0 u l 在室温下于振荡器上振荡1 0 m i n 7 酶标仪4 9 0 n m 处读取吸光度a 值 计算粘附百分率 粘附细胞 a 值 总细胞a 值 10 0 上述实验独立重复三次 2 6 细胞划痕实验 w o u n dh e a l i n ga s s a y 1 分别制备h e l a h e l a p e g f p 和h e l a r a p lg a p 三种细胞悬液 三种细胞均以2 10 5 个细胞 孔的浓度接种于2 4 孔板 37 5 c 0 2 培养箱培养6 h 2 更换无血清培养液 置培养箱继续培养2 4 h 3 用10 0 u l 枪头在2 4 孔板接种细胞的孔每孔中央作一垂直相同宽度 的划痕 用无血清培养液冲洗两遍以去除细胞碎片 然后分别加入0 5 m l 细胞培养液 沿划痕边缘等距离间隔做5 个标记作为数据测定点 置培 养箱培养 4 分别于划痕后0 2 4 4 8 7 2 h 用目测微尺测量各孔划痕处无细 胞区的宽度 上述实验独立重复三次 2 7 体外细胞迁移实验 t r a n s w e l lm i g r a t i o na s s a y 方法步骤与体外细胞侵袭实验相同 只是t r a n s w e l l 小室的滤膜不用 人工基底膜胶覆盖 实验独立重复三次 2 8 体外细胞侵袭实验 m a t r i g e li n v a s i o na s s a y 1 t r a n s w e l l 小室 8 0 u m 孔径 4 预冷 每孔加入5 0 9 l 用无血清 d m e m 培养液1 5 稀释的m a t r i g e l 使其在滤膜上重组为基底膜结构 3 7 干燥1 2 h 2 分别制备h e l a h e l a p e g f p 和h e l a r a p lg a p 三种细胞悬液 调整细胞浓度为5 10 5 m l 上室分别加入10 0 u l 细胞悬液 下室加入含 13 t j x 牛血清的条件培养液5 0 0 b t l 作为趋化因子 3 37 5 c 0 2 培养箱培养2 4 h 4 取出带有滤膜的小杯 p b s 洗涤三次 4 甲醛固定15 m i n 用棉 棒擦去仍保留在滤膜内面的细胞和m a t r i g e l 仅留下由滤膜内面侵袭到 滤膜外面的细胞 0 1 结晶紫染色后 2 5 0 倍光镜下计数5 个不同视野 上 下 左 右 中 的侵袭细胞数 取平均值 上述实验独立重复三次 2 9 酶谱法检测m m p 活性 1 收集2 5 实验中细胞培养板内的上清液 4 c o12 0 0 0 r m i n 离心5 r a i n 除去细胞碎片 2 取上清液4 0 u l 加入其1 4 体积的5 x 上样缓冲液 0 0 6 m o l l t r i s 2 s d s 2 5 甘油 0 1 溴酚蓝 p h 6 8 室温静置3 0 m i n 3 进行t r i s 甘氨酸s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用1o 分离胶和 5 浓缩胶 分离胶中加入明胶溶液使明胶终浓度为1m g m l 电泳采用垂 8 直板式电泳 恒压 浓缩胶8 0 v 分离胶lo o v 整个电泳过程须在4 c 条件下进行 4 电泳结束后 凝胶移入2 5 t r i t o n x10 0 溶液 2 5 t r i t o n x10 0 5 0 m m o l l t r i s h c i 5 m m o l lc a c l 2 p h 7 6 中 低速振洗2 次 每次3 0 m i n 5 凝胶移入孵育液 5 0 m m o l l t r i s h c l l0 m m o l l c a c l 2 2 0 0 m m o l l n a c l p h7 5 3 7 c o 恒温孵育18 h 6 o 2 5 考马斯亮蓝r 2 5 0 染色1 5 2 h 脱色液 5 甲醇 7 5 乙酸 脱色至负染条带出现 2 1 0 统计学处理 计量资料以x s 表示 采用s p s s1o 0 统计软件进行统计分析 p 0 0 5 而h e l a r a p 1g a p 细胞从 2 4 h 开始生长速度明显减慢 与h e l a 细胞组和h e l a p e g f p 细胞组相比 有显著性差异 奎p o 0 5 各组数据及生长曲线见下 a m 卅 一 m 一 w m 一h e 1 w 日 一一 一w b 至 h e l a r a p l g a p h e l a p e g f p h e l ap 值 o d 值o d 值o d 值 2 40 0 3 74 0 0 1 0 0 0 4 64 0 0 0 50 0 4 8 0 0 1 4 4 8 7 2 9 6 1 2 0 0 0 4 0 0 0 0 5 o 0 5 1 o 0 1 0 0 0 8l o 0 2 80 0 7 74 0 0 0 4 0 0 8 94 0 0 2 00 0 7 94 0 0 0 7 0 0 5 4 0 0 l l0 i l2 0 0 2 90 0 9 l 4 0 0 2 0 0 0 6 4 0 0 0 60 1 7 8 0 0 4 50 1 4 9 4 0 0 4 l 与 0 15 8 0 0 0 1 章 0 0 0 0 木 0 0 0 0 串 0 0 0 0 木 与 与 0 7 0 0 o 7 2 3 0 1 9 9 0 0 9 7 0 1 6 5 o 0 8 0 0 0 0 2 幸 0 0 0 3 0 0 1 0 i r 0 0 0 l 1 4 40 0 7 8 4 0 0 1 2 0 3 0 14 0 0 6 00 2 6 3 0 0 4 9 0 0 0 0 丰0 1 7 10 0 0 0 幸 2 4487 29 612 014 4h 0 u r s f i g u r e 2 r a p l g a pi n h i b i t sp r o l i f e r a t i o no fh e l ac e l l t h eh e l a c e l l sa n dh e l ac e l l s s t a b l ye x p r e s s i n gg f po rg f p r a p1g a pw e r ep l a t e di n9 6 w e l la tad e n s i t yo f10 0 0 c e l l sp e rw e l la n dp r o l i f e r a t i o nw a sm e a s u r e da sd e s c r i b e di nt h em a t e r i a l sa n d m e t h o d ss e c t i o na th o u r s2 4 4 8 7 2 9 6 1 2 0a n d1 4 4a f t e rs e e d i n g a t h ev a l u e s r e p r e s e n tm e a n so fo dv a l u e so fe a c hc e l l s4 s db a s e do ns i xw e l l sp o i n ti nas i n g l e l o o o 0 o o 0 o 0 o o 5 o 5 o 5 o 5 0 4 3 3 2 2 l l 0 0 o o 0 o o o 0 o o a o e x p e r i m e n tf 卓p o 0 5v e r s u st h ec o r r e s p o n d i n gc o n t r 0 1 b c e l lp r o l i f e r a t i o n t h e e x p e r i m e n tw a sr e p r e s e n t a t i v eo f t h r e ee x p e r i m e n t sw i t hs i m i l a rr e s u l t s 3 r a p lg a p 基因对细胞凋亡的影响 见图3 3 h e l a h e l a p e g f p h e l a r a p lg a p 细胞基因组d n a 电泳结果见 图3 三组细胞均未见i8 0 2 0 0 b p d n a 断裂片断 l2 3m 15 0 0 b p 5 0 0 b o 1 h e l a r a p i g a p 2 h e l a p e g f p 3 一h e l a m 一1 0 0b pd n al a d d e r f i g u r e 3 r a p1 g a pc o u l d n ti n d u c ea p o p t o s i so fh e l ac e l l c e l l sw e r eh a r v e s t e da n d d n aw a se x t r a c t e d t h ed n af r a g m e n t sw e r ee l e c t r o p h o r e s e do n2 a g a r o s eg e l c o n t a i n i n g0 1g m lo fe t h i d i u mb r o m i d ea n dw e r ev i s u a l i z e du n d e ru l t r a v i o l e tl i g h t n o18 0 2 0 0 b pd n af r a g m e n tw a so b s e r v e di nt h e s et h r e eg r o u p s 4 r a p lg a p 基因抑制细胞一基质的粘附 见图4 h e l a h e l a p e g f p 和h e l a r a p l g a p 三组细胞与f n 的粘附率分 别为0 9 2 5 0 141 o 9 0 8 0 12 6 和o 7 4 3 0 0 5 2 h e l a r a p lg a p 细胞 组与h e l a p e g f p h e l a 细胞组相比有显著性差异 p 0 0 5 a 细胞细胞粘附率p值 h e l a 细胞 0 9 2 5 0 1 4 1 o 8 1 2 h e l a p e g f p 细胞 0 9 0 8 0 1 2 6 0 0 1 4 h e l a r a p i g a p 细胞 0 7 4 3 o 0 5 2 0 0 2 3 b 1 2 r l 0 8 0 6 0 4 0 2 o h e l a h e l a p e g f ph e l a r r a p i g a p f i g u r e 4 e f f e c t so fr a p 1g a po na d h e s i o np o t e n t i a l so fh e l ac e l l st of i b r o n e c t i n f n b ya d h e s i o na s s a y t h e9 6 一w e l l sw e r ec o a t e dw i t hf j b r o n e c t i n 2 0p g m 1 o v e r n i g h ta t 4 a f t e rp l a t e sb l o c k e dw i t ho 2 b s af o r2 ha t3 7 t h ec e l l sr e s u s p e n d e di n d m e m4 1 0 5 w e l lw e r ea d d e dt oe a c hw e l la n di n c u b a t e df o r1 2 ha t3 7 t h e nr e m o v e d u n a t t a c h e dc e l l s c e l l sr e m a i n i n ga t t a c h e dt ot h ep l a t e sw e r eq u a n t i f i e dw i t ham t t a s s a y a f t e rd i s c a r d i n gt h es u p e r n a t a n t t h es u b s t r a t ew a sm e a s u r e dw i t ha ne l i s a r e a d e ra t4 9 0 n m t h ep e r c e n t a g eo fa d h e r e n tc e l l sw a sc a l c u l a t e db y d i v i d i n gt h e o p t i c a ld e n s i t yo ft h ea d h e r e n tc e l l sd i v i d e db yt h a to ft h ei n i t i a lc e l li n p u t a s u m m a r yr e s u l t s b a d h e s i o nv sc o n t r 0 1 e x p e r i m e n t sw e r er e p e a t e dt h r i c e 十p o 0 5 5 r a p l g a p 基因对迁移能力的影响 见图5 1 5 2 5 1 划痕实验 h e l a h e l a p e g f p 和h e l a r a p lg a p 三组细胞2 4 h 组迁移距离分别为1 2 8 0 2 5 6 1 4 3 0 3 5 1 和5 9 0 1 1 4um 三组细 胞4 8 h 迁移距离分别为2 2 2 0 4 1o 2 3 4 0 4 7 0 和1o 5 0 2 8 9um 三 组细胞7 2 h 迁移距离分别为2 8 7 0 5 5 3 2 7 4 0 6 3 8 和1 4 6 0 2 2 2i lm 三个时间段h e l a r a p lg a p 细胞组迁移距离与h e l a p e g f p 细胞组 h e l a 细胞组迁移距离相比均有显著差异 p 0 0 5 a 0 h h e l a h e l a p e g f p h e l a r a p lg a p h e l a h e l a p e g f ph e l a r a p l g a p 1 2 i口扫g凸13讷 ro一岍qc口 文 b c 7 2 h 2 4 h o u r s4 8 h o u r s7 2 h o u r s f i g u r e 5 1 w o u n dh e a l i n ga s s a y c e l l sw e r es e e d e di n2 4 w e l lp l a t e si nd m e m c o n t a i n i n g 1o f bsa n dg r o w nu n t il9 0 c o n f l u e n t t h e nt h ec e l l sw e r es e r u m s t a r v e df o r2 4 h a n dal i n e a rw o u n dw a sc r e a t e di nt h ec o n f l u e n tm o n o l a y e ru s i n ga 2 0 0p l p i p e t t et i p t h ec e l lm i g r a t i o nd i s t a n c ew a sd e t e r m i n e db ym e a s u r i n gt h e w i d t ho ft h ew o u n d a h i g h e r m a g n i f i c a t i o nv i e w so 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