叶绿素及其衍生物的分析方法研究进展.pdf

收稿日期 2004 06 18修回日期i2004 09 14 基金项目 浙江省分析测试基金 03104 资助项目o 作者简介 李英华 1977 s 女s 博士生s 山东茌平人s 主要从事天然药物研究与开发o 叶绿素及其各种衍生物的定性定量分析 已经应用于各个领域 1 5 植物学中用来研究 叶绿素的种类和结构进行植物分类9 海洋学 中用来分析海洋中浮游植物的细胞丰度对海 洋赤潮的发生规律进行监测9 园艺学中用来 研究各种瓜果的成熟机理以及保存方法9农 学中用来研究光合作用机理9 食品行业中用 来分析叶绿素衍生物添加剂的含量以及食品 的色泽0 因此叶绿素分析方法的发展与这些 学科发展有着密切关系0 本文将对叶绿素及 其衍生物的各种定量定性分析方法进行综述 并加以分析比较0 叶绿素及其衍生物的结构和性质 叶绿素 chiolophyii 是一类结构为一个镁 和四个吡咯环上的氮结合以卟啉为骨架的绿 色色素的总称0 高等植物中主要含叶绿素a 和叶绿素d9 在褐藻 硅藻类中含叶绿素a c1 c29红藻中含叶绿素c等0 已经报道的叶 绿素相关分子高达50余种0叶绿素呈深绿或 墨绿色油状或糊状9不溶于水9微溶于醇9易 溶于丙酮和乙醚等有机溶剂和油脂类0对光 热 酸敏感9性质不稳定9遇酸时中心金属镁 被氢置换脱离成暗绿至暗褐色的脱镁叶绿素 pheophytin 0 从化学性质上讲9叶绿素是一 种双羧酸酯9 叶绿酸的两个羟基分别被甲醇 ch3oh 和叶绿醇 c20h38oh 酯化0 叶绿素a 和叶绿素d的结构如图1 20 叶绿素a和d 的分子中的镁离子易被铜 铁 钴等离子取代 而成为叶绿素衍生物 chiolophyiiin 0 目前市售叶绿素衍生物有叶绿素铜钠 盐 叶绿素铁钠盐 叶绿素铜钾盐 叶绿素锌 钠盐 叶绿素镁钠盐 叶绿素钾钠盐 叶绿素 铜钾钠盐等9其对光 热 酸 碱的稳定性大大 提高0 其铜钠盐或铁钠盐又分为二钠盐和三 钠盐0 结构如图3 40 叶绿素的盐类衍生物为 兰黑色至墨绿色的粉末9无臭或者略带氨臭9 易溶于水9微溶于乙醇 氯仿9不溶于油脂9耐 光性比叶绿素强9 酸性溶液中因钠脱离呈水 不溶性9在存有钙 镁离子情况下生成不溶性 盐0 叶绿素及其衍生物常见的分析方法 关于叶绿素分析方法的报道很多9 但关 于其衍生物分析方法的报道较少9 近几年有 增多趋势0 根据对样品的破坏程度分破坏性 叶绿素及其衍生物的分析方法研究进展 李英华s 吕秀阳s 任浩明s 吕丽丽 浙江大学 制药工程研究所9 浙江 杭州310027 摘要 介绍了叶绿素及其衍生物的基本结构和性质9综述了叶绿素及其衍生物的各种分析方法9并 进一步展望了叶绿素及其衍生物的分析方法发展方向0 关键词 叶绿素9 衍生物9 结构9 性质9 分析方法 中图分类号 to462文献标识码 a文章编号 0258 4069 2004 04 0001 05 科技专论 bulletin of sericulture 第35卷 第4期 2004年11月 voi 35 no 4 nov 2004 分析方法和非破坏性分析方法 目前得到报 道的破坏性的叶绿素分析方法有分光光度法 和色谱法 对植物研究的非破坏性分析方法 有透射性活体叶绿素仪和反射型活体叶绿素 仪 吸收光谱是一种鉴定混合物中主要色素 存在的比较简单的方法 可以反应共轭双键 系统的有机组成 从而可以构建色素相应的 指纹图谱 一旦经过鉴定 就可以通过某个特 定的方程估算它们的浓度 由于色素的环境如溶剂 温度或配基等 严重影响色谱形状 直接粗略地测定样品中 色素浓度无任何意义 因此测定前需特定溶 剂 叶绿素的分光光度法按所提取叶绿素的 溶剂不同 分为丙酮法 乙醚法 二甲基亚砜 法 二甲基甲酰胺法 无水乙醇法 丙酮乙醇 水混合液法和丙酮乙醇混合液法 6 丙酮法在 1941年由mackinney首先提出 1949年经 arnon解释和推导以后 丙酮法就作为arnon 法在国际上被广泛应用到现在 丙酮法的特 点是提取麻烦 工作量大 提取及提取液中叶 绿素易受光氧化破坏 使测定值偏低 测定大 量样品时更易造成测定误差 乙醚法由smith 和benitoz提出的 又叫smith benitez法 是 在丙酮法的基础上形成的 由于该法操作比 丙酮法还麻烦 难完成大量样品测定 一般很 少应用 二甲基亚砜法由hiscox于1979年 开始应用 是用二甲基亚砜直接浸泡测定高 等植物的叶绿素含量 从而简化测定手续 80 年代在我国也开始应用 但该法的缺点是二 甲基亚砜的叶绿素提取是在65 下提取 叶 绿素受高温破坏使测定值偏低 其提取液和 丙酮叶绿素提取液的吸收光谱也存在一定差 异 用丙酮法的公式计算不太好 而且二甲基 亚砜的气味难闻并且在低于19 时易于结 晶 使该法的应用收到限制 二甲基甲酰胺法 是1980年由moran等提出的 用二甲基甲酰 胺在室温下直接从完整的植物材料中提取叶 绿素 克服了二甲基亚砜法的一些缺点 无水 乙醇法是1981年由古川照雄提出的 该法提 取时间长 对某些植物特别是草本植物提取 不够完全 同研磨提取相比测定值低1 左 右 所以本法应用不是很普遍 陈福明在 1984年提出了丙酮乙醇水混合液法 用丙 酮 乙醇和蒸馏水按4 5 4 5 1的比例配成 混合液 在40 的黑暗条件下 直接浸泡提 取剪成细丝的植物材料 按照丙酮法公式计 算叶绿素含量 该法提取时间长 提取液不稳 定 易受光氧化破坏而使测定值偏低 到 1985年张宪政又提出了用丙酮和无水乙醇 等量混合而成的提取液 直接浸泡提取叶绿 素 按照丙酮法的公式计算叶绿素的含量 该 法比丙酮乙醇水混合液法 二甲基亚砜法的 叶绿素提取液稳定 不易受光氧化破坏 由于分光光度法只是对色素组分进行粗 略鉴定 色素混合物的分离鉴定需要用色谱 法 色谱法又分开管柱法 薄层色谱法 高效 液相色谱法以及超临界和亚临界高效液相色 蚕桑通报2004年 第35卷 第4期2 谱法 对于叶绿素的进一步鉴定需要近红外 和核磁共振光谱法 7 在开管柱中用来分离叶 绿素和胡萝卜素的常用的固定相有蔗糖粉 纤维素琼脂糖及微晶纤维素等 薄层色谱和 高效液相是常用的精确的分离色素的方法 薄层色谱法快速 有效而且成本低 但用硅胶 板或者是硅胶柱分离胡萝卜素和叶绿素的时 候 应先将硅胶洗为中性后再用以防止叶绿 素脱镁形成脱镁叶绿素 而且薄层色谱法多 用于定性分析 高效液相分析中 由于叶绿素 的疏水特性一般采用c18反相柱来进行分 离 而且在高效液相分离叶绿素时 柱温对分 离效果有很大的影响 目前高效液相用的高 效能的计算机系统和光电二极管检测器的大 范围的信号扫描大大提高了高效液相色谱的 灵敏度 可以进行叶绿素的定性定量分析 超 临界流体色谱在分离分析过程中可以最大程 度的降低色素的降解 从而使样品分析的准 确性更高 核磁共振色谱色谱目前用的是快 速原子轰击进行分析 其它还有用圆二色谱 法 酶法和dna检测等分析方法 但是分析 方法还不是很成熟 高效液相 超临界流体色 谱和核磁共振的缺点是耗时长 成本相对较 高 测定需要破坏被测物质的原样 非破坏性的仪器测定有透射型和反射型 的两种类型 透射性活体叶绿素仪是日本从 20世纪60年代开始研究的 我国从80年代 初的产品有hyl l型活体叶绿素仪 1984 年北京农业大学研究成功84 yi型数字叶绿 仪等 目前日本又有新型号gm 1型活体叶 绿仪 spad 501叶绿素仪等 活体叶片对 670 675 nm波长的光有一定的吸收高峰 其 吸收值与叶绿素含量成正相关 同时 在 600 700 nm波长范围内 类胡萝卜素等其它 色素对测定无影响 该方法应用时 由于各种 叶片的吸光系数不同 必须校正仪器 经校正 后就可以对生长状态的叶片进行非破坏性的 测定 反射型活体叶绿素仪是在20世纪80 年代以后发展起来的 主要是研究非接触式 远距离地测定植物的叶绿素含量 用于单叶 和作物群体的叶绿素含量测定 由于其结构 复杂 研究起步晚 仍处于研制阶段 并无实 际应用 叶绿素及其衍生物的分离分析研究 现状 目前叶绿素的分离分析主要以hplc分 离分析研究为主 研究柱温 流动相及固定相 对分离分析的影响 但也有部分柱色谱分离 和分光光度法分析的报道 杨振德 1996 利用分光光度法研究不同 提取液对叶绿素含量测定的影响 指出不同 提取液提取的叶绿素的吸收光谱相似 但对 叶绿素的得率及稳定性影响比较显著 随着 提取液中含水量得提高 叶绿素的提取速度 效率及叶绿素提取液稳定性显著下降 各种 提取液中 叶绿素d均较叶绿素a性质稳定 含水量为零的体积比为2 1丙酮 无水乙醇 的混合提取液效果较好 8 乔淑文等 1997 报 道了分光光度法测定叶绿素铜钠盐的方法 用723型分光光度计在330 700 nm范围内 扫描发现吸收光谱中只有一个吸收峰 在 402 nm处峰形较好 并指出 水溶液中该物 质在4 60 1范围内与波长402 nm处的吸 光度成直线关系 15 纪平雄等 2001 利用 a1203层析柱建立了三种脱镁叶绿酸a的分 离与鉴定方法 指出可利用体积比为4 1的 石油醚 丙酮液做洗脱剂分离出叶绿酸a 利 用酸水解制备脱镁叶绿一酸a 碱水解制备 脱镁叶绿二酸a和叶绿三酸a 利用薄层层 析方法对三种脱镁叶绿酸a进行分离 10 杨 建虹等 2002 利用较大的deae sepharose cl 6b和sepharose cl 6柱层析从菠菜叶 中分离出大量叶绿素a和叶绿素d 他首先 用二氧六环 蒸馏水沉淀法快速获得叶绿素 a和叶绿素d的混合物 然后用sepharose cl 6进行柱层析 用体积比20 l的己烷 异丙醇洗脱叶绿素a 用体积比为l0 l的 李英华 等 叶绿素及其衍生物的分析方法研究进展3 己烷 异丙醇洗脱叶绿素bo 并且指出在洗出 叶绿素a和叶绿素b后 层析柱上端残留的 黄绿色物质用体积比l0 3的丙酮 甲醇淋洗 可以完全除净 这样可以使柱子再生使用 ll o koichi等 l995 利用常液洗脱和ods odp 柱转换技术来分离叶绿素及其衍生物oods 柱用来分离疏水性强的叶绿素a b及脱镁叶 绿素a和脱镁叶绿素b odp柱用来分离疏 水性不是很强的叶绿素cl和叶绿素c2及其 脱镁衍生物 l2 o 叶绿素分离分析方法的前景展望 由于分析化学技术的发展 特别是各种 联用技术的发展 使叶绿素的分离分析更加 快速和精确o 叶绿素的分离分析的方法的发 展使得各种叶绿素衍生物得分离成为可能 可以加速叶绿素各单体药理药效方面的研 究 同时可以促进建立更加科学的叶绿素标 准 使食品和药品中叶绿素及其衍生物的定 量更加精确o 今后的叶绿素标准的建立可能 会将理化参数和生物学活性结合o圆二色谱 循环伏安仪以及近红外等技术的应用可能会 让叶绿素及其衍生物的分离分析更加精确 快速o 叶绿素衍生物的配位化学的研究逐渐 引起科研工作者的兴趣 随着配位化学的深 入研究 配位色谱应用于叶绿素衍生物的纯 化使得产品质量标准更易指标化o 研 究 内 容色谱条件文 献 叶绿素及各种降解产物 柱温125 柱规格1单晶rp cl8柱 l00 4 6mm o 流动相1a是甲醇 b是l 98g l的嘧啶溶液 超纯水配 醋酸调ph至5 00 c是丙酮o 洗脱程序180 20的a b到80 20的a c梯度洗脱持续三分钟 然后是80 20的a c 等梯度洗脱持续2 min 分析结束时马上将洗脱剂b换成洗脱剂co 流速14 mi mino jose等 2003 l3 东北天蚕茧绿色素 水溶性黄萃取液1cl8 ods色谱柱 流动相1体积比90 l0的甲醇 水混合液 紫外检 测波长220nmo 氯仿层萃取液1紫外检测波长275nm 流动相1体积比75 25的甲醇 水混合液o 刘莉萍等 l996 9 碱处理后叶绿素的 系列降解产物 反相离子对高效液相色谱1ods柱 5 m 250 40mm 采用梯度洗脱 流动相a是体 积比为l l 8的水 离子对试剂 甲醇 流动相b是体积比为l l的丙酮 甲醇混合液o 离子对试剂是0 05m的醋酸四丁铵 lm的醋酸铵溶液o 正相薄层色谱1硅胶gf254 流动相为体积比l0 4 l的石油醚 丙酮 二乙胺o 反相薄层色谱1硅胶cl8 流动相为体积比为20 4 3的甲醇 丙酮 水o isabei等 l995 l4 叶绿酸铁盐 结构见图5 6和7 洗脱剂160 40乙腈 磷酸缓冲液 ph为2 内含0 0lm的氯化四甲铵tmacl o 为防 止分析过程中氧化或降解加入氯化亚铁 柱温35 o 分析柱1 250 30mm 5 m 半制备色谱柱1 250 30mm l0 m o nonomula等 l996 l6 表l叶绿素及其衍生物的高效液相色谱分析条件 tabiel the hplc anaiysis conditions of chiolophyiis and theil delivatives 蚕桑通报2004年 第35卷 第4期4 a review on the analysis methods of chlorophylls and its derivatives li ying hua lu xiu yang ren hao ming l li li institute of pharmaceutical engineering zhejiang uniuersity hangzhou 310027 china abstract the molecular structures and characters of chlorophylls and chlorophyll derivatives were introduced and the status guo of analysis method were reviewed and the developing trends of analysis method were forecasted key words chlorophyll derivative structure character analyzing method 参考文献 1 李宝华 朱明远 南极长城湾潮间带叶绿素a的分布及 变化 j 黄渤海海洋 1999 17 2 38 42 2 张义科 张翠君 张雪松 等 白洋淀浮游植物的生物 量 叶绿素含量和生产量 j 河北大学学报 自然科学 版 1999 19 3 268 271 3 赖家业 杨振德 文祥凤 等 两种立地条件下蒜头果叶 绿素含量比较研究 j 广西植物 1999 19 3 272 276 4 benoit schoefs chlorophyll and carotenoid analysis in food products a practical case by case view j trends in ana lytical chemistry 2003 22 6 335 339 5 torsten bohn thomas walczyk determination of chlorophyll in plant samples by liguid chromatography using zinc ph thalocyanine as an internal standard j journal of charo matographya 2004 1024 123 128 6 苏正淑 张宪政 几种测定植物叶绿素含量的方法比较 j 植物生理学通讯 1989 5 77 78 7 benoit schoefs chlorophyll and carotenoid analysis in food products properties of the pigments and methods of analy sis j trends in food science technology 2002 13 361 371 8 杨振德 分光光度法测定叶绿素含量的探讨 j 广西农 业大学学报 1996 15 2 145 149 9 刘莉萍 张秀玲 王继红等 东北天蚕茧层色素研究 j 大连轻工业学院学报 1996 15 1 32 34 10 杨建虹 陶怡 大量分离叶绿素a和b的方法 j 植物生 理学通讯 2002 38 2 156 158 11 纪平雄 张廿六 陈芳艳 等 三种脱镁叶绿酸a的分离 与鉴定方法探讨 j 中国蚕业 2001 22 1 13 14 12 koichi saitoh izumi awaka nobuo suzuki determination of chlorophylls by 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