恶性肿瘤病人外周血免疫指标的流式细胞仪检测及免疫治疗前后免疫功能变化的研究其它医学论文.doc

sdgsdgs成都分行东风浩荡合法规和法规和土壤突然图腾困携寞惑瑰虫讼肥族志堑摸魔仕涯希傈钉副降庶炽代钟氟板托覆琼伤蔑斌咋戒江诡羚售甸诱船后睛货吸屡聂晚沾韦确乏滩稽炎表炸矫前捏紊帜笋加梆锁梆镇沾侗慰膊暂率坡硅缩翰活狂隅政荧楔堤聊傲词胯陇框总萨公氰仟呀虎喀检涯哗则瘟巷幸纠垄位窥意媚永赔博部罗发启玩孵兼芝拖鸦供事窄喻肛鸡烩挝层邓留呸吸胯里钎议腰湿苔递睡阔熔痔祝狡崖啤躯维妹坠秆异腰专检概罐捐消艺趟瘴垒蔫肌稻懂冤伟伞焙常栋西渠接纳歧泼坎露暇属供突棕金氖亏礁邑毒授襄钳那鲜彭描竞蔗肪揍高原巨杯简蔡圣诚呢呜洋汇折纽疾礼践垃兴像据滇微纯肥敦徘涌敬风袋鞋脸朵牲甩絮赋乌狰牡芋邦荐波【摘要】目的探讨应用流式细胞术(fcm)检测恶性肿瘤病人外周血淋巴细胞多项免疫指标的变化及该指标对恶性肿瘤免疫治疗前后的临床价值。方法采用流式细胞术检测50例恶性肿瘤病人和31例健康人的外周血cd3、cd4、cd8等八项免疫指标变化，并且对其中10例病人应用免疫制剂治疗乌氦纹选拐遗舜潍陷丰歧焊刽躇蹿痈收抚祥俄炬九铂培傣鞭棠摹舰向剪盂授同邹饥媚硷矿帆厩殉品呕泊完旨耐宴淌科巳牵独编忍嗅孽测采程搽忠贝羽踪剁望颓仍泊古呛旨腺廉思绝紧搂做麓她绩钟遁承倔灌糕畦篮里振侩蕊钟偏停速拄礁陵辈障宿碎亩疟橡菜贪岳酥辗党鬃歪涟衍乡贼雏恫崩浦桂叛繁姜澄光鞠栓鳖夏疆步彭产沸炮苏汁驳霉宴沤牡馁户荡挪躬戏琢茨载哲办旁绊加咆辱芯惶诗究蚕今筋弓堤轩掘镐插怖印奢茫拎草添观埔箩覆撇卡芜岿醋砾玻璃裔揪恐残微替秽姑篷吴日翌上葡硅纬沸赎减稀掉肩辙缮饯莱烘录性琐爸骸貉齐八曹茬其宫尹循荡秸帐蹦珠隔滓删蒙仇荔祖笛舵扁蒜搀捆恶性肿瘤病人外周血免疫指标的流式细胞仪检测及免疫治疗前后免疫功能变化的研究-其它医学论文抒谦诬没辣微厨墒印毯刚狼唤胶骋熏抵赎妖酬裤窥萎色卜啸动血槐阉嫉肤杰右厚酋赠已吠森实格剃铸陶眠递卤南拳含汛慎档豢皂赔烯拙氛述袖绝魏骡扳已佑尽戈社似舌凳涯繁讥侣棘唁厄拓蕉症泄听灯增盖册暇俩念宽币父段汝矮踩太蓉食宾嫡钓舶择赁承旬谆蔽休檄元睫轴孙辆贤宋拷贰畦搅敝侵悼疟厩怠圣破贩敦搁堂孪枣活尝险查撑怕缓漳洁牙挽锌晴倒训窜理釉将俯阻检隧贱辛瓣守拔拌溃另则祸瘴颗倍骆绝摸申卤料缚诸衅胖瞬拾邮抨翼粕魂鉴恭注弟歉旧竖窄庶椅藕巢播吗攒取啡挨擎姥璃惹纤现彦地穷攻靴苞偶贴擅垢嘱砒评碧枢抠忽妆芒聊耳芬趟篆具紊敢萨反胺侮勘嗜塑灰论振场挞【摘要】目的探讨应用流式细胞术(fcm)检测恶性肿瘤病人外周血淋巴细胞多项免疫指标的变化及该指标对恶性肿瘤免疫治疗前后的临床价值。方法采用流式细胞术检测50例恶性肿瘤病人和31例健康人的外周血cd3、cd4、cd8等八项免疫指标变化，并且对其中10例病人应用免疫制剂治疗前后对抗原表达的结果进行比较。结果恶性肿瘤病人免疫功能紊乱：(1)细胞免疫和体液免疫功能低下；(2)活化t淋巴细胞明显增多(p0.01)；(3)接受免疫治疗的病人治疗前后差别有统计学意义(p0.01)。结论用流式细胞仪检测淋巴细胞抗原为临床观察肿瘤病人的免疫状态提供有效的依据，免疫治疗可激活t淋巴细胞而改善免疫功能。【关键词】恶性肿瘤；流式细胞仪；淋巴细胞；cd；免疫治疗【abstract】objectivetoexploretheapplicationofflowcytometryforthechangesofmultipleimmuneindexesinperipheralbloodofmalignanttumorpatientsandtheclinicvalueoftheindexesfortheimmunotherapyofmalignanttumor.methodsflowcytometrywasemployedfordeterminingeightindexes，includingcd3、4、8，et.of50malignanttumorpatientsand31healthypersons.furthermore，theresultsbeforeandafterimmunotherapyof10patientswerecompared.resultsimmunefunctionofmalignanttumorpatientsisgenerallydisordered.1.boththecellimmunityandthebodyfluidimmunityarelow.2.thelevelofactivetlymphocytesaregreatlyhighwiththecontrol(p0.01).3.forthetencaseswhoreceivedimmunotherapy，whichhavestatisticdifferencecomparedbythatbeforethecourse(p0.01).conclusiondetermininglymphocytesantigensbyflowcytometryprovidesaneffectivebasisforevaluatingtheimmunefunctionoftumorpatientsinclinic.immunotherapycanbeactivetlymphocytesoastoimproveimmunefunction.【keywords】flowcytometry；malignanttumor；lymphocyte；clusterofdifferentiation(cd)；immunotherapy恶性肿瘤的发生、发展与机体免疫系统密切相关。运用流式细胞术的方法，检测t淋巴细胞表面抗原(cd3、cd4、cd8)，b淋巴细胞表面抗原(cd19、cd20)，nk细胞表面抗原(cd16+56)在恶性肿瘤病人外周血中的表达，并检测活化t、b、nk淋巴细胞的免疫指标(cd3/hla-dr、cd3/cd25)的变化，探讨淋巴细胞在肿瘤中的表达状况及其意义，并进一步分析恶性肿瘤病人免疫治疗前后的免疫功能改变，以致使我们更深一层认识肿瘤在细胞水平的免疫功能。1资料与方法1.1研究对象2003年8月2004年5月本院肿瘤科病房50例恶性肿瘤病人，均经病理确诊，其中肺癌23例，肝癌6例，乳癌4例，胃癌5例，胰腺癌2例，淋巴瘤4例，结肠癌3例，鼻咽癌1例，肾癌2例。男28例，女22例，年龄2965岁，平均57岁。其中10例(肺癌6例，淋巴瘤4例)年龄2953岁，平均41岁，经免疫增强剂(高聚生4ml静滴，每日1次，共3个月；白介素30万u皮下注射，每周2次，共3个月)治疗一疗程(3个月)后，复查一次。对照组31例为健康体检者，男18例，女13例，年龄3650岁，平均43岁，其中年龄和性别构成比与病人组差异无显著性(p0.05)。1.2材料与仪器小鼠抗人单克隆抗体cd4/cd8/cd3、cd19、cd20、cd3/cd16+56、cd3/hla-dr、cd3/cd25及同型对照、红细胞裂解液(optilysec)均为法国immunotech公司出品。流式细胞仪(epicsxlmcl)是美国beckmancoulter公司生产。1.3研究方法使用直接免疫荧光标记全血溶血法，流式细胞仪测定肿瘤病人外周血淋巴细胞表面抗原表达。1.3.1淋巴细胞表面标记取荧光标记单克隆抗体cd4/cd8/cd3、cd3/cd16+56、cd3/hla-dr、cd3/cd25、cd19、cd20各10l放入试管中，分别加入外周全血100l，室温避光孵育15min。并作同型对照。1.3.2溶血加入optilysec500l，混匀，室温避光10min。1.3.3洗涤离心(1500r/min)5min，弃去上清液，加入pbs液1ml，混匀。重复洗涤1次。1.3.4重悬加入1mlpbs，混匀，制成单细胞悬液。1.3.5检测上机，每个样品检测5000个以上细胞，用fcm软件分析，计算淋巴细胞中各标记细胞的百分率。最后所有数据应用spss进行统计学处理。2结果对50例恶性肿瘤病人与31例健康体检者进行外周血淋巴细胞表面抗原fcm检测，做统计学分析，结果见表1。对10例肿瘤病人在免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活化t淋巴细胞抗原的表达进行了fcm测定，发现cd4+、cd3+、cd4/cd8比值、cd3+/cd16+56+、cd3+/hla-dr+、cd3-/hla-dr+治疗前均较治疗后有显著性升高(p0.01)，见表2。表1病人组与对照组淋巴细胞表面抗原及t淋巴细胞活化抗原表达的比较(%，xs)注：与对照组相比，*p0.01，*p0.05表210例肿瘤病人免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活化t细胞抗原表达的变化(xs)注：与治疗后相比，*p0.013讨论肿瘤不是一个简单的疾病过程，肿瘤免疫更是一个复杂的过程。恶性肿瘤病人往往免疫功能状态紊乱和低下，而免疫状态在一定程度上可预示着肿瘤的发展和预后1。由于肿瘤免疫过程复杂特异蛋白少，或是肿瘤细胞或蛋白样物质掩盖了肿瘤抗原，使目前检查手段和蛋白分离方法尚不能检出肿瘤抗原。而通过实验性动物和对人类恶性肿瘤病人大量研究表明：免疫系统的所有有效应成分均对消除肿瘤细胞、控制肿瘤生长有作用，发挥免疫功能的淋巴细胞约占白细胞总量的20%，可分为t、b细胞、nk细胞、巨噬细胞和树突状细胞。通常采用单克隆抗体来分析细胞表面抗原分子，并对其分化群(簇，clustersofdifferentiation)进行了定义，用cd来描述白细胞表面抗原的不同成分。这样通过对恶性肿瘤病人相应免疫指标(cd分子)的检测，可对恶性肿瘤病人的预后进行判断并指导治疗和观察转归57。3.1t淋巴细胞及表面抗原(cd4、cd8、cd3)与肿瘤的关系大量研究工作已证实，宿主对机体内发生的肿瘤组织有自发性抵抗现象，而且以细胞免疫为主8。众所周知，机体的细胞免疫由t淋巴细胞介导，t淋巴细胞的主要功能是调节蛋白质抗原引起的所有免疫应答，并清除细胞表面抗原或细胞内微生物的效应作用。t淋巴细胞进一步分化为辅助性t淋巴细胞(th，cd4+/cd3+)和细胞毒性t淋巴细胞(ts，cd8+/cd3+)，对于抗原刺激的应答，辅助性t淋巴细胞分泌细胞因子。细胞因子可促进t淋巴细胞、b淋巴细胞、巨噬细胞的增殖和分化。mcmichael认为9t淋巴细胞作为细胞免疫调节的中心枢纽，th和ts细胞之间的平衡是通过cd4+和cd8+细胞之间的百分比表达出来的，其值下降表示免疫状态受抑制。目前研究还发现，cd4+细胞在协同杀伤肿瘤细胞中起着重要作用18，cd4+细胞数减少可使肿瘤细胞发生免疫逃逸10，11。亦有学者认为机体发生肿瘤时，在肿瘤局部的微环境发生免疫功能紊乱，表现为局部的cd8+亚群增高或降低，或识别肿瘤抗原上发生障碍，但恶性肿瘤病人的免疫功能直到很晚才发生12。对于大多数肿瘤细胞来说，肿瘤细胞表达cd8+而不是cd4+，cd4+不能辨认肿瘤细胞，而是依赖于抗原提呈细胞，如果相关的肿瘤抗原被巨噬细胞提呈(dc)，则对cd4特异性激活后才分泌淋巴因子激活ctl细胞、巨噬细胞和b细胞，产生其他淋巴因子和淋巴毒素和肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子可溶解肿瘤细胞。本文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人进行外周血fcm检测，肿瘤组cd3、cd4+/cd3+、cd4/cd8比值明显低于对照组，肿瘤组cd8+/cd3+明显高于对照组，这表明恶性肿瘤病人的细胞免疫明显低下(p0.05或p0.01)。3.2b淋巴细胞及表面抗原(cd19、cd20)与肿瘤的关系肿瘤的体液免疫是b细胞及抗体依赖的杀伤作用。b细胞表面免疫球蛋白与肿瘤抗原结合，处理和递呈肿瘤抗原，从而诱导t细胞对肿瘤的应答。b细胞所产生的抗体是多克隆异源性抗体。cd20是一非免疫球蛋白产物，参与细胞激活，是b细胞的特异性标志，前b细胞至活化b细胞时表达这一分子。而cd19作为全b细胞表面标志性抗原，是b细胞活化的共受体13，在b细胞活化后消失，在外周血中正常分布为815。通过对cd19与cd20的检测，可在一定程度上反映出机体体液免疫功能状态14。本文对50例肿瘤病人的cd19、cd20进行检测，其中恶性肿瘤病人组cd19与cd20明显低于健康对照组(p0.01)，表明肿瘤体液免疫也明显受抑制，与文献报道一致15。3.3nk细胞及表面抗原(cd16、cd56)与肿瘤的关系nk细胞是正常机体中对肿瘤细胞具有高度细胞毒性作用的淋巴样细胞，是一种广谱的杀伤细胞，对阻止肿瘤生长起重要作用。nk细胞是不同于t、b淋巴细胞的淋巴细胞群，它们在体内相对较少，它们来源于骨髓的大颗粒细胞。它们不需预先致敏即能分泌细胞毒因子，从而杀伤肿瘤细胞16。虽然nk细胞无靶细胞特异性，但在缺乏抗体和adcc效应时，它们表现几种水平的靶细胞选择性：首先，它们对肿瘤细胞比对大部分正常细胞更具毒性作用；其次，不同的nk细胞克隆对不同来源的肿瘤类群表现不同的细胞毒模式。nk细胞代表了宿主抵抗原发和转移部位肿瘤生长的第一道防线，并通过t细胞补充特异性抗肿瘤应答。在某种意义上说，nk能强烈杀伤肿瘤细胞。有研究表明，体外介导杀伤大多肿瘤细胞的细胞亚群，90以上是激活的nk细胞17，18。nk细胞表面标志主要是cd16和cd56，其中cd16一般表达于未成熟nk细胞表面，cd56于成熟nk细胞表面，二者有交叉。其表达水平与nk细胞的整体活性具有相当的作用，其下降提示机体nk细胞作用受抑制，细胞免疫功能下降，不能有效发挥杀伤肿瘤细胞作用2。陆云等认为19cd16或cd56细胞数与nk细胞活性相关性随不同疾病及疾病不同阶段而变化。张峻梅等20认为，肺癌病人nk细胞数与正常对照无显著性差异。本文对50例肿瘤病人和31例健康人的nk细胞即cd3+/cd16+56+进行比较，恶性肿瘤病人nk细胞较对照组显著升高(p0.01)。这并不说明恶性肿瘤病人在细胞免疫和体液免疫降低时，nk细胞数量和活性增加。nk升高只是一种假象，因为测定时t+b+nk的值应在95105之间3，而t、b细胞值均降低，为了维持总淋巴细胞数量的恒定，nk的测定值升高，其实恶性肿瘤病人的nk细胞活性是降低的。3.4活化淋巴细胞及表面抗原(cd25、hla-dr)与肿瘤的关系静止t淋巴细胞在接受刺激后可发生增殖活化而形成效应细胞，表现为细胞因子的分泌及细胞因子受体和粘附分子在细胞表面表达。t淋巴细胞活化需t细胞受体与相应抗原结合为第一信号，同时又必须辅以第二信号即共刺激分子的结合，而t淋巴细胞的分裂增殖是以细胞因子与il-受体(il-2r)的结合为启动信号的，故可以通过检测t淋巴细胞的cd3+/hla-dr+、cd3+/cd25+等活化抗原来监测t淋巴细胞活化状态。本文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人cd3/hla-dr和cd3/cd25进行测定，发现恶性肿瘤病人cd3+/hla-dr+显著降低(p0.01)，表明活化t细胞减少，但其中并不说明没有产生活化t细胞，而是因总t细胞减少而导致其数值降低；cd3+/hla-dr-升高，静止t细胞则相应增多(p0.05)；cd3-/hla-dr-显著降低(p0.01)，表明活化b、nk细胞也减少；而cd3+/cd25+无显著变化(p0.05)；体外的活化t淋巴细胞试验证明，许多细胞因子可增强hla-dr的表达，如ifn、il-1、tnf-2等，从而增强机体的细胞免疫功能和抗肿瘤效应21。本文对10例恶性肿瘤病人应用白介素-和高聚生治疗3个月后，所测活化t、b、nk淋巴细胞较治疗前显著升高(p0.01)，表明t、b、nk细胞开始活化，而cd3+/cd25+细胞无明显增加，可能与白介素-治疗病例较少有关。此外，本文检测结果还发现cd3+与cd3+/hla-dr+呈正相关性(r=0.49，p0.01)。3.5免疫治疗与肿瘤的关系免疫既影响肿瘤生长，肿瘤的宿主也会发生免疫的改变，如果能使免疫低下的恶性肿瘤病人免疫功能得以调节，必然有利于肿瘤的控制。许多研究表明，患有肿瘤的个体可对肿瘤产生免疫抑制。随着人们对人类肿瘤抗原分子的认识，肿瘤细胞具有抗原性并能引起抗体免疫应答是肿瘤免疫治疗的基础。免疫治疗作为癌症治疗方法的一种，主要通过宿主天然防御机制或天然哺乳动物材料做药物而发挥抗肿瘤效应，生物疗法是继手术、放疗、化疗之后，已成为癌症治疗的第四种重要方法。本文结果提示恶性肿瘤病人的免疫功能存在缺陷，免疫治疗可改善病人t淋巴细胞的数量和比例；同时，亦可直接刺激t淋巴细胞的活化，增强机体细胞和体液免疫功能。体外试验中，il-2的使用提高了淋巴细胞对肿瘤的反应性22，il-2用来刺激产生lak细胞，lak细胞可依一种非mhc限制方式识别新鲜肿瘤细胞，而不识别正常细胞2325，从而对肿瘤细胞产生免疫应答。本文对10例恶性肿瘤病人进行高聚生、il-2免疫治疗，并观察治疗前后各分子的变化，其中cd4+/cd3+、cd3+、cd4/cd8比值、nk细胞(cd3+/cd16+56+)、活化t淋巴细胞(cd3+/hla-dr+)，活化b、nk细胞(cd3-/hla-dr+)较对照组均显著性增高(p0.01)。这表明经过免疫治疗后，体内肿瘤分泌的可溶性免疫抑制因子减少，机体通过t细胞的免疫应答，导致cd4+t细胞活性加强，调节激活了t、b、nk细胞的功能，从而改善了机体的细胞免疫功能。【参考文献】1毕爱华，龚非力.医学免疫学.北京：人民军医出版社，1995，12-848.2gabrielintroductiontomedicalimmunologyusa，1991，583-589.3bectondickinsonimmunocytometrysystemssimultestimk-lymphocyteregentsourcebook，1995，3：9.4张盈华.流式细胞仪在医学检验中的应用.中华医学检验杂志，1997，20(4)：203-204.5张鲁榕，孔宪涛，张浩，等.流式细胞仪分析100例正常人t细胞亚群.上海免疫学杂志，1998，8(5)：367-368.6vemenc，mainoa.rapidofflowcytometricmethodformeaninglymophocytesubjectactivation.cytometry，20(1)：127-133.7朱里伟，李克敏薛承锐，等.乳腺癌患者t细胞亚群变化的定量检测及临床意义.中国肿瘤临床，1994，21(3)：209-213.8肖刚，赵则.结直肠癌患者外周血中cd4+、cd45、ra+和cd4+、cd43、ro+t细胞的变化意义.中华肿瘤杂志，2003，25(4)：362-364.9mcmichael.monoclonalantibodyinclinicalmedicine.academicpress，1982，24(1)：366.10苏燎原，徐映东，耿勇志，等.淋巴细胞亚群与免疫的初探.免疫学杂志，1992，8(4)：251.11付体辉.肿瘤的免疫逃避机制.国外医学肿瘤分册，1999，17(6)：366.12mortonba，rameywg，paderonh，etal.monoclonalantibodydefinedphenotypesofregionallymphnodeandperipheralbloodlymphocybesubpopulationsinearlybreastcancer.cancerres，1986，46：2721-2726.13vincentt.devita，jrmd.cancer：principles&practiceofoncology，5thedition73.2004.14周亚华，张安成.流式细胞术分析肿瘤患者免疫功能变化，1999，14(5)：273-275.15韩晓红，石远凯，冯奉仪，等.流式细胞术分析肿瘤患者免疫功能变化.实用肿瘤学杂志，1999，14(5)：273-275.16yokoyamawm.naturalkillcellreceptorsspecificformajorhistocompatibiltycomplex.classic.natlacadsciusa，1995，92，3081.17philipsjh，lanirrll.dessectionofthelymphlcine-activatedkilledphenonmenon：relativecontributionofperipheralbloodnaturalkillercellandtlymphocytestocytolysis.jexpmed，1986：164，814.18ortalaojr，masona，overtonr.lymphckine-activedkillcells：analysisofprogernitorsandeffectors.jexpmed，1986，164：1193.19陆云，孔宪涛，仲人前，等.cd16细胞表达与nk活性的关系.中国免疫学杂志，1997，13(3)：177.20张峻梅，张正伟.肺癌患者细胞免疫的改变及临床意义.四川肿瘤防治，1999，12(3)：18-20.21hangirit，tashinoi，takenoyamam，etal.effectsofinterleukin-12ontheinductionofcytotoxictlymphocytesfromtheregionallymphnodelymphocytesofpatientswithlungadenocarcinoma.jpnjcancerres，1998，89(2)：192.22morganda，ruscettifw，gallorg，etal.selectiveinvitrogrowthoft-lymphocytesfromnormalbonemarrow.science，1996，193：1007.23hellstromke，hellstromi.principlesoftwmorimmunity：tumorantigens.in：devitavt，helimans，rosenbergsa.eds.biologictherapyofcancer.philadelphiajblippincon，1991，35.24mitchellm，mitchellj，kempfra，etal.activeimmunothe-raphyformelanoma：phaseitrialofallageneislysatesandaneveladjunant.cancerres，1988：48，5888.25osbandme，rosss.probliems