2,4-D及6-BA对何首乌叶片愈伤组织诱导影响毕业论文.doc

2,4-D和6-BA对何首乌叶片愈伤组织诱导的影响摘 要何首乌不仅是传统中药植物，在食用和保健方面也具有很高的使用价值。随着人们对何首乌的研究不断深入，传统的繁殖方法已经不能满足市场的需求。采用组织培养快速繁殖繁技术不仅可以保护品种的遗传性，而且不受外界条件影响，可以在较短时间内繁育出上百万株种苗。很多研究学者已对何首乌的茎、叶等通过组织培养获得再生植株。本次研究取何首乌的幼嫩叶片为外殖体，以MS为基本培养基。通过调节培养基中2，4-D、6-BA的不同浓度，研究激素对何首乌叶片诱导分化的影响，结果表明外殖体的诱导分化以MS+2，4-D (1mg/L)+6-BA(0.5mg/L)+蔗糖30g/L+琼脂20g/L组合的培养基最佳，出愈率最高。关键词 何首乌，组织培养，愈伤组织ABSTRACTPolygonum multiflorum is not only the traditional Chinese medicine plants ，also has a high value in the food and health care，With the deepening of Polygonum, traditional breeding methods have been unable to meet market demand. Using tissue culture rapid reproduction of complicated technology not only can protect a variety of hereditary and not subject to external conditions, breeding hundred ten thousand seedlings in a relatively short period of time. Many researchers have fleece-flower root, stem, leaf tissue culture to obtain regenerated plants. This study to take Polygonum young leaves of the explants, MS medium，By adjusting the medium 2,4-D,6-BA with different concentrations to study the hormone induced differentiation of Polygonum multiflorum leaves, the results show that the induction of differentiation of the explants to MS +2, 4-D (1mg / L) +6-BA (0.5mg / L) + sucrose 30g / L + agar 20g / L, combination of best medium, the highest callus.Key words： Polygonum multiflorum, tissue culture, callus 目 录摘 要IABSTRACTII1 绪 论11.1何首乌11.1.1何首乌生物学特性11.1.2何首乌的分布与资源状况11.2何首乌的药理效应及其综合利用31.2.1何首乌的化学成分31.2.2何首乌的药理作用31.2.3何首乌的营养保健功能51.3实验理论基础71.3.植物细胞全能性71.3.2细胞分化、脱分化与再分化71.3.器官发生和胚状体发生81.4何首乌组织培养研究概况81.5本次研究的内容、目的和意义91.5.1 研究内容91.5.2 研究目的91.5.3 研究意义92 材料与方法102.1实验材料102.1.1 实验用品102.1.2 实验材料的采集102.2实验方案102.2.1外植体制备102.2.2培养基配制112.2.3 培养基灭菌122.2.4 接种和培养143 实验结果与分析163.1实验结果163.2 实验结果分析163.2.1实验结果出愈分析163.2.2实验褐化分析183.2.3染菌分析194 实验讨论214.1 实验结果讨论214.1.1外植体214.1.2培养基214.1.3接种224.1.4褐变224.1.4 染菌235 结论245.结论245.2建议24参 考 文 献25致 谢271 绪 论1.1何首乌1.1.1何首乌生物学特性何首乌为多年生草本。喜阳，耐半阴，喜湿，畏涝。要求排水良好的土壤，块根肥厚，长椭圆形，黑褐色。茎缠绕，长2-4厘米，多分枝，具纵棱，无毛。微粗糙，下部木质化。叶卵形或长卵形，长3-7厘米，宽2-5厘米，顶端渐尖，基部心形或近心形，两面粗糙，边缘全缘；叶柄长1.5-3厘米；托叶鞘膜质，偏斜，无毛，长3-5毫米。花序圆锥状，顶生或腋生，长10-20厘米，分枝开展，具细纵棱，沿棱密被小突起；苞片内具2-4花；花梗细弱，长2-3毫米，下部具关节，果时延长；花被5深裂，白色或淡绿色，花被片椭圆形，大小不相等，外面3片较大背部具翅，果时增大，花被果时外形近圆形，直径6-7毫米；雄蕊8，花丝下部较宽；花柱3，极短，柱头头状。瘦果卵形，具3棱，长2.5-3毫米，黑褐色，有光泽，包宿花被内。花期8-9月，果期9-10月。1.1.2何首乌的分布与资源状况何首乌为蓼科多年生缠绕草本植物,其块根为我国名贵的中药材,主要分布在广西、广东、贵州、四川、湖北、江苏、河南,此外,云、陕、陇、湘、赣、浙、闽等地也有分布。广西何首乌野生资源丰富,品种繁多,但是质量参差不齐,近几年来对野生何首乌掠夺性采挖现象非常严重,亟须进行人工栽培。何首乌在云南主要分布于昆明、曲靖、昭通、玉溪、楚雄、迪庆、丽江、临沧、思茅及红河、文山等地区。我国的主产区为河南嵩县、卢氏，湖北恩施、巴东、长阴、秭归、建始、咸丰，广西南丹、靖西，广东德庆，贵州铜仁、黔南，四川乐山、宜宾，江苏江宁、江浦等地。另外在我国华东、中南及河北、山西、陕西、甘肃、台湾等地也有分布。广东德庆何首乌的种植历史悠久，产量大，为何首乌的地道药材品种。常生于海拔16002800m的草坡、路边、山坡石隙及灌木丛中。何首乌味苦、甘、涩，微温。为补益类中药。唐代李翱的何首乌传载：治五痔腰膝之病，冷气心痛，积年劳瘦痰癖，风虚败劣，长筋力，益精髓，壮气驻颜，黑发延年。妇人恶血痿黄，产后诸疾，赤白带下，毒气入腹，久痢不止，其功不可具述。日华子本草载：“治一切冷气及肠风”。宋开宝本草载：“主瘰疬，消痈肿，疗头面风疮”。宋重修政和经史证类备用本草在上述用途基础上增补了“止心痛、益血气，黑须发，悦颜色，久服长筋骨，益精髓，延年不老，亦治妇人产后及带下诸疾” 。明代兰茂滇南本草载：“久服延年耐寒”，“入肾为君，涩精，坚肾气，止赤白便浊，缩小便，入血分，消痰毒。治赤白癜风，疮疥顽癣，皮肤瘙痒”等疾病。明代李时珍本草纲目载：“汉武时，有马肝石能乌人发，故后人隐此名。亦曰马肝石。赤者能消肿毒，外科呼为疮帚，红内消”。按中华人民共和国药典2000年版一部所述：何首乌性味归经为：苦、甘、涩，温。归肝、心、肾经。功能主治为：解毒，消痈，润肠通便。用于瘰疬疮痈，风疹瘙痒，肠燥便秘；高血脂。据本草及有关文献记载，古之“何首乌”药材有赤、白两种。经考证：赤者即现在全国使用的历版中华人民共和国药典一部收载品何首乌的干燥块根；其藤茎为中华人民共和国药典一部收载品首乌藤，又称夜交藤。白者即今我国北方各省习用的白首乌，其原植物为萝摩科鹅绒藤属植物白首乌的干燥块根。1.2何首乌的药理效应及其综合利用何首乌，是云台山盛产的药材之一，属蓼科多年生草藤植物，其性微温，微苦，甘，涩。具益气血、黑须发、悦颜色、久服长筋骨、益精髓、延年不老等诸多功效。李时珍的本草纲目称其为“地精”，为古今中医界公认的“抗衰老中药”。何首乌是中国特有药材，其药用历史悠久，在临床有着广泛的应用。1.2.1何首乌的化学成分化学成分：块根含蒽醌类化合物，主为大黄素（emodin），大黄酚（chrysophanol）以及大黄素甲醚（physcion），大黄酸（rhein），大黄酚蒽酮（chrysophanol anthrone）。又含芪类化合物：白藜芦醇（resveratrol），云杉新甙（piceid），2，3，5，4-四羟基芪-2-O-D-葡萄糖甙（2，3，5，4tetrahydroxystilbene2O-D-glucopyranoside）、 2，3，5，4-四羟基芪-2O-葡萄糖甙-2-O-没食子酸酯（2，3，5，4tetrahydroxystilbene2O-DglucoPyranoside2-O-monogalloyl ester）、2，3，5，4-四羟基芪-2O-葡萄糖甙-3-O-没食子酸酯（2，3,5，4-tetrahydroxystilbene-2O-Dglucopyrano-side-3-monogalloyl ester)。还含没食子酸（gallic acid），右旋儿茶精（catechin），右旋表儿茶精（epicatechin），3O-没食子酰（）-儿茶精3-O-galloyl(-）catechin， 3O-没食子酰（-）-表儿茶精3-O-galloyl(-)-epicatechin， 3O-没食子酰原矢车菊素（3-O-galloyl-procyanidin）B-2，3，3-二-O-没食子酰原矢车菊素（3，3- diOgalloylProcyanidin）B-2和-谷甾醇（-sitosterol），卵磷脂。1.2.2何首乌的药理作用（1）促进造血功能小鼠皮下注射首乌液0.2g，每日2次，连续给药3日，可使粒系祖细胞的产率明显高于生理盐水对照组。小鼠腹腔注射何首乌提取液50mg/kg连续给药3日，可使骨髓造血干细胞明显增加，还可显著提高小鼠粒一单系祖细胞产生率，并使骨髓红系祖细胞值明显升高。 （2）增强免疫功能何首乌对强的松龙和环磷酰胺引起的老年小鼠脾、胸腺抑制性改变有明显对抗作用，使脾巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数明显提高。饲喂首乌乙醇浸膏能明显提高老年大鼠外周淋巴细胞DNA的损伤修复能力。小鼠灌服制首乌 6g/kg，连续给药 7日，能明显提高腹腔巨噬细胞的吞噬能力，对强的松龙引起的吞噬指数下降，有明显的对抗作用。 （3）降血脂与抗动脉粥样硬化高脂血症大鼠每日灌胃何首乌 4g/kg，连续 10日，能较显著地降低大鼠血清总胆固醇（TC）及血清甘油三酯（TG）的含量。对于高脂血症鹌鹑，连续灌胃首乌4周，可明显降低血清TC含量和提高 HDL/TC比值。另有实验证明，高脂血症及动脉粥样硬化模型家兔，何首乌灌胃7日，不仅能降低TC含量，还能减轻动脉粥样硬化斑块形成。何首乌水提液 32g/kg喂养小鼠1个月，能明显提高 HDL- C水平。何首乌掺入到饲料中喂养大鼠，90日后，也可明显升高HDL-C，而TG和TC无明显变化，对脂蛋白有明显抑制作用。何首乌醇提取液给快速动脉粥样硬化鹌鹑灌胃，连续6周，血浆HDL-C/TC比值显著升高，大剂量组作用更为显著。各给药组均有延缓动脉粥样硬化的作用。何首乌降血脂与抗胆固醇作用的有效成分包括蒽醌类、二苯烯化合物以及卵磷脂等。 （4）保肝何首乌所含的二苯烯化合物对过氧化玉米油所致大鼠脂肪肝和肝功能损害，肝脏过氧化脂质升高、血清谷丙转氨酶及谷草转氨酶升高等均有明显对抗作用，并使血清游离脂肪酸及肝脏过氧化脂质含量下降。在体外能抑制由ADP、 NADPH引起的大鼠肝微粒体脂质过氧化。何首乌还有增加肝糖原作用。生首乌、黑豆汁制首乌和清蒸首乌水煎液对醋酸强的松所致肝脂蓄积有对抗作用，可降低 CCl4引起的肝肿大，使肝重系数降低。 （5）延缓衰老，现代调查有维生素E制止皱纹再生。何首乌水煎液喂服老年小鼠或青年小鼠，能使脑和肝中蛋白质含量明显增加，提高老年机体DNA修复能力。何首乌的醇提物及水提物能不同程度地增加老年大鼠胸腺胞浆蛋白和核酸含量。何首乌延缓衰老作用与抗氧化作用有关。老年小鼠灌服何首乌水煎浓缩液，能明显增强血中SOD活性。炮制对首乌抗氧化作用有一定影响，新法炮制品及老法炮制品均有明显提高小鼠全血及脑组织SOD活性作用，并能降低小鼠心、肝、脑组织中及血中LPO含量，生品对SOD和LPO无明显影响。首乌醇提液或水提提液均能不同程度地提高老年大鼠心、肝、脑的组织SOD含量和降低LPO含量。 （6）对内分泌的影响何首乌水煎浓缩液长期给小鼠灌胃，可使小鼠肾上腺重量明显增加。何首乌还有类似肾上腺皮质功能的作用，对摘除双侧肾上腺的小鼠，可使其应激能力明显提高，减少冷冻引起的小鼠死亡率。制首乌对去甲肾上腺素饥饿小鼠肝糖原积累，有促进作用，使肝糖原明显增加。何首乌对血糖的影响有一定的时效关系，给家兔口服首乌煎剂后30、60分钟内血糖升高达峰值，之后逐渐下降，6小时后血糖比正常低。大鼠肝胰岛素受体具有高亲和力低容量，及低亲和力高容量两种受体，老年小鼠结合容量显著降低，但亲和力无变化。何首乌对容量和亲和力两个参数均无明显影响。 （7）润肠通便何首乌生用，润肠通便作用强，其有效成分大黄酚可促进动物肠管运动。部分高脂血症病人服用后，出现大便次数增加和腹泻现象。 （8）其他药理作用曾有报道，何首乌各种炮制品（生首乌、酒蒸首乌、黑豆汁蒸首乌、清蒸首乌）水煎液体外对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、宋内氏痢疾杆菌、伤寒杆菌901.副伤寒杆菌从白喉杆菌、乙型溶血性链球菌等均有不同程度的。抑制作用，其中生首乌煎剂抗金黄色葡萄球菌作用比其他炮制品强，制首乌水煎剂对白色葡萄球菌，酒蒸首乌水煎剂和地黄汁蒸首乌水煎剂对白喉杆菌的抑制作用比其他首乌强。何首乌对流感病毒有一定抑制作用。此外，何首乌还有减慢心率、扩张冠脉、抗心肌缺血等作用。 综上所述，与何首乌补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨功效相关的药理作用是促进造血功能，提高机体免疫功能，降血脂，抗动脉粥样硬化，保肝，延缓衰老，影响内分泌功能，润肠通便等作用。何首乌功效作用的物质基础主要为磷脂、蒽醌类、葡萄糖苷类等成分。1.2.3何首乌的营养保健功能 ,据本草学记载白首乌是传统何首乌的正品之一，具有重要的送疗价值和食用价值，作为补益药，始于唐代并沿用至今，在国内外享有盛名。为进一步利用何首乌资源，验证白首乌的传统功效，全面评价其价值，中华全国中医学会于1986年召开了“全国白首乌学术讨论会”。会上汇集了许多专家、教授的研究成果，其结果表明白首乌含有人体必需的各种氨基酸、微量元素、无机盐、维生素和其他营养成分，其营养保健作用可以与人参、西洋参相媲美。大量的临床实践亦证实，白首乌具有养血益肝、固肾益精、强筋健骨、乌须发等功效，一直被视为延年益寿、摄生防老的高级滋补品，具有良好的开发前景。( 一)补肝肾，乌须发，益精血白首乌所含谷氨酸、天门冬氨酸等多种氨基酸有重要的生理活性，临床可用于肝炎、肝昏迷的治疗，精氨酸则有一定的强精作用。白首乌富含的磷脂类物质，可提高机体免疫能力维持生物膜结构的完整，时具有促进毛发生长和减少白发之功效，其有效成 分能抑制胆固醇合成，降低血清总胆固醇含量，因而可以防止动脉硬化和冠心病的发生。( 二 ) 预防癌症、肿瘤维生素是人体内必需的一类化合物。白首乌所含的维生素A、B、C、E不但是其兹补作用的物质基础之一，同时能有效地预防癌症。体外细胞培养实验和体内实验结果显示，白首乌有效成分儿对癌细胞有直接杀伤作用，总之其能激发机体抗癌的潜在能力。 1.3实验理论基础1.3.植物细胞全能性植物细胞全能性是组织培养的理论基础。一个活的植物细胞,只要有完整的膜系统和细胞核,他就会有一整套发育成一个完整植株的遗传基础,在一个适当的条件下可以通过分裂、分化再生成一个完整植株。从理论上讲,只要一个活的植物细胞,都有再生出一个完整植株的潜力,但实际情况并非如此简单。就目前所知,细胞的再生潜力与分化程度成负相关,就是说细胞分化程度越高其再生能力越低,但也有人认为细胞的再生能力与其分化程度无关,只是人们现在还没有完全掌握细胞分化的机制。虽然还没有完全从理论上揭示其原因,但事实是越老的细胞,其基因的表达就越受到严格的制约,或者说丧失功能或不表现基因的功能越多,所以应尽量选取幼嫩的植物组织作为培养的研究材料。同时,还应该考虑到,一定的基因型或外殖体的表现不同,高度分化的细胞或组织只要条件合适,也有产生再生植株的可能。1.3.2细胞分化、脱分化与再分化当把一个已经失去分裂能力,处于分化成熟和分裂静止状态的细胞置于特定的增殖培养基上时,它首先发生的变化是回复到分生性状态,这一状态包括由溶酶体的活动而将失去功能的细胞质组分降解,并产生新的细胞质组分,同时细胞内酶的种类与活性发生改变,蛋白质合成和细胞代谢过程也发生改变，最后引起基因表达改变，细胞的性质和状态发生了转变。由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞团即愈伤组织现象称为“脱分化”。经过脱分化的细胞如果条件合适，就可以长久保持旺盛的分裂状态而不发生分化。由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定功能的细胞团和组织，构成一个完整的植株体或植物器官的现象，叫做“再分化”。一个以分化细胞要表达出其全能性，就要通过脱分化和再分化的过程，这就是植物组织和细胞培养所要达到的目的。设计培养基和创造合适培养条件的主要原则就是如何使植物组织和细胞完成脱分化和再分化，培养的主要工作就是设计和筛选培养基，探讨和建立合适的培养条件。植物激素在调节细胞脱分化和再分化中起主要作用。植物对激素的反应十分敏感，培养基中生长素类物质和细胞分裂素物质的种类、相对比例和绝对量都能直接影响到细胞脱分化与再分化过程，组织培养中常常通过调节激素种类、浓度和相对比例来达到脱分化和再分化的目的。1.3.器官发生和胚状体发生培养的植物组织与细胞在经过脱分化和再分化再生成新的植物体过程中，特别是再分化时，可经过两个途径，一是由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽（或根），再在另一培养基上产生根（或芽），形成一个完整植株，因为芽和根都是植物的器官所以这一过程叫器官发生途径。另一个是在愈伤组织中产生一些与种子中胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗，由于这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相似，所以叫做胚状体发生或无性胚胎发生。组织培养中，植物走器官发生途径还是胚状体途径，随植物不同而不同，也随培养基的不同而变化，有时甚至同一种植物在同一种条件下，即存在细胞胚胎发生途径，也存在器官发生途径，这都是自然现象，是正常的，只是两种发育途径的频率随着基因型不同和培养条件不同而有显著的差异。何首乌作为古老的稀有物种和重要经济植物，需要得到很好的保护。真正要保护一物种，不是保护一定数量的该物种就达到目的，而是要尽可能多保护该物种的遗传变异。然而，对于何首乌的遗传变异水平和群落结构却一无所知，何首乌变异的研究仍停留在形态上的描述，要确定形态上的差异是由于生态条件造成的还是遗传性所决定的，就必须研究种内的遗传变异，分子生物学的方法将是有力的工具，如采用同工酶、RAPD技术等，只有在确定了遗传多样性和变异类型的基础上，才能有效而全面保护何首乌，同时，采用迁地保护的办法复壮那些频率低、稀有的基因。1.4何首乌组织培养在研究概况植物组织培养是20世纪发展起来的一门新技术.本世纪初(1902 年)，德国植物学家GHaberlandt 最早开始植物组织培养的研究，至今已有90余年, 随着生产和科学水平的提高，植物组织培养技术已达到了一定的精确度。研究的领域从植物生理学科逐渐扩展到细胞生物学、分子生物学、遗传学、园艺学、育种学等学科。特别是近20 年来，在理论与应用上的重要性日益显著发展到细胞器培养，原生质融合培养以及当前迅猛发展的DNA重组技术。从理论上可以研究探讨细胞生长、分化的机理及其有关的细胞生理学和遗传学等问题。同时,由于生产实践不断提出新的要求，又促使了理论研究与生产有机地结合起来，更使植物组织培养成为一项大有发展前途的技术。何首乌极高的药用、食用、保健医疗价值，引发人们滥采滥挖，以采集野生为主供应市场。盲目采挖之风使野生资源廖廖无几，难觅踪迹，几近灭绝，更显珍贵。近年何首乌市场价格一直稳中有升，供不应求，很多地方出现了有价无货的局面。因此，发展人工栽培何首乌前景看好。通过组织培养等手段进行何首乌的栽培与繁殖，能达到快速繁殖的目的，以满足市场上的需要。1.5本次研究的内容、目的和意义1.5.1 研究内容本次研究取何首乌的幼嫩叶片为外殖体，通过调节培养基中2，4-D、6-BA的不同浓度，研究激素配比对何首乌叶片诱导分化的影响，以期能得到较优化的诱导分化培养基配方。1.5.2 研究目的本课题研究目的主要有以下几方面：（1）、通过对何首乌幼嫩叶片组织培养中不同浓度配比，得到最佳的诱导分化培养基配方。（2）、掌握组织培养相关知识，熟悉相关操作。1.5.3 研究意义何首乌，是云台山盛产的药材之一，属蓼科多年生草藤植物，是中药材中用量较大的品种之一，多年来一直是受关注的品种。鉴于其起源古老，在科学上具有重要研究价值及其重要的药用价值，被列为国家重点保护的稀有植物。何首乌传统用药的经验是用其块根，其功效有补肝、益脾、养血祛风，常用于肝肾阴亏，须发早白，血虚头晕等症，亦能治疮痒、疥癣等皮肤病。何首乌大部分为野生，由于该产品多为块根繁殖，是一种生长周期较长的草藤植物,一般需要34年才能采挖。近年来， 随着科学进步的不断发展，何首乌的用途迅速拓宽，该品不但被众多中成药企业看好，同时亦是化工和保健品的重要生产原料。据悉，目前市场上80%以上的洗发液、洗发膏均含有何首乌成分；50%以上的护肝、补肾中成药及保健产品含有何首乌原料。随着国内国际市场对何首乌的需求逐年增加，产区群众在利益的驱动下，一哄而起，连年采取地毯式的滥采滥挖，掘地三尺，甚至连幼根也不放过，使野生资源遭到严重破坏，野生何首乌的产量每年递减20%左右。何首乌产量的逐年下滑，库存空虚及市场需求的有增无减，使得“物以稀为贵”，造成何首乌价格暴涨。由于何首乌用量逐年增大，但资源却日趋枯竭，濒临绝迹。因此保护何首乌资源已迫在眉睫。而植物组织培养具有生长周期短，繁殖率高，成本低，利于工厂化等诸多优点，因此利用现代生物工程技术植物组织培养，能够很好的保护何首乌资源。2材料与方法2.1实验材料2.1.1 实验用品材料：初生23周何首乌幼嫩叶片；药品：硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA器皿和工具：刀，培养皿，锥形瓶，托盘天平，分析天平，烧杯，电炉，玻棒，试管，酒精灯，长柄镊子，贴标纸，记录笔，牛皮纸，细绳。主要设备：手提式不锈钢蒸汽灭菌锅 型号：YX280B 接种台 型号：DH-500AB 冰箱 型号：BCD-2425 2.1.2 实验材料的采集2011年3月底，在攀枝花学院生物与化学工程学院植物园采集何首乌叶片。选取靠近叶稍的幼嫩叶片，叶片生长23周，叶片颜色刚开始由浅绿转深绿为最好。采集回来的叶片用清水冲洗后放入冰箱备用，准备实验。2.2实验方案2.2.1外植体制备在超净台上，将叶片放入广口瓶中，先用75%的乙醇将叶片浸泡10-30s，并不时摇动玻璃瓶。然后倒出酒精，注入无菌水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，如此反复数次。然后再加入浓度为0.1%HgCl2溶液，使叶片完全浸没在溶液中，盖上盖，并不时摇动玻璃瓶，待8分钟后倒出溶液，加入无菌水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，如此反复数次。在超净台上按无菌操作要求（超净台先用紫外灯灭菌30min），用70%酒精棉球擦手与器具外壁。逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。用解剖刀将叶片切成规整的5mm5 mm的小叶块，在完成一次切割后，将解剖刀和小镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一切割再用（弃去开始一片和最后一片）。2.2.2培养基配制本实验采用MS+2,4- D 的（不定）mg/L+6-BA(不定)mg/L+蔗糖30g/L+琼脂20g/L培养基。培养基配制程序如下：（1）、玻璃器皿的清洗、消毒。先将器皿进行高温高压消毒，在用洗涤剂清洗干净，倒置于架子上晾干，然后转入烘箱中，在80140下烘烤2小时，最后转入防尘橱或直接使用。（2）、MS母液配制。按MS培养基母液配制要求，配制MS大量元素母液（10倍），MS微量元素（1000倍）、MS有机母液（100倍）、MS铁盐母液（100倍）各1000ml(表一)，倒入磨口试剂瓶中，放在4冰箱中待用。注意的是MS铁盐母液应用棕色磨口瓶装，并使其在室温下充分反应后，再转入4冰箱中保存。（3）、激素母液（表二）配制。激素母液2,4-D（0.5mg/L,1.0mg/L,1.5 mg/L）扩大100倍各配制1000ml倒入磨口试剂瓶中放入4冰箱中待用；6-BA按使用浓度（0.2mg/L,0.5mg/L ,1.0mg/L）扩大100倍各配制1000ml，倒入磨口试剂瓶中，放在4冰箱中待用。注意2,4-D先用1mol/L氢氧化钠溶解，再用蒸馏水定容；6-BA先用少量1mol/L盐酸溶解，再用蒸馏水定容。（4）、培养基的配制。配制1L培养基主要包括以下五步：第一，用量筒量取700800ml蒸馏水，倒入1.5L烧杯中；第二，按比例依次加入MS大量元素母液（100ml），MS微量元素母液（1ml），MS有机母液（10ml），MS铁盐母液（10ml）。每加一种母液都要混合均匀，然后才加入第二种母液；第三，将烧杯再电炉上加热到70左右，将称好的琼脂（20g）、蔗糖（30g）依次加入，继续加热至琼脂全部融化；第四，按设计方案加入激素母液（表2）配制成实验所需的不同培养基。（5）、分装。待稍微冷却，按每瓶20ml培养基分装到锥形瓶内，再用耐高温高压的塑料膜或牛皮纸封口，最后用线或橡皮筋扎紧，准备灭菌。（6）、灭菌。将准备好的培养基装入高压灭菌锅2030min，然后取出平放在实验架上冷却。注意灭菌过程的安全，实验前腰仔细检查锅内水位、锅上的压力表、安全阀的是否正常。2.2.3 培养基灭菌实验室用的高压灭菌锅是手提式不锈钢蒸汽消毒器。高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。整个灭菌过程的具体操作步骤如下:（1）加水 高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水，使水面与底架平齐。（2）装料 将灭菌桶放回灭菌锅，装有培养基的锥行瓶和装有纯净水的锥形瓶瓶口向上竖放在灭菌桶内，实验用器具等清洗干净后用报纸包扎好后也一并放入灭菌桶内，物品之间要保留空隙，以利于通气。（3）密封 加盖，将排气软管插入灭菌锅的排气管内。以对角的方式，同时拧紧相对的两个紧固螺栓，以防止漏气。（4）排气 检查安全阀和排气阀是否关闭，接通电源，加热，当压力上升到一定程度时(49KPa左右)，打开排气阀放气，当压力降到0时，关闭排气阀。重复上述放气过程一次，以彻底排出锅内的冷空气。（5）升压 母种培养基和原种培养基灭菌时当锅内的温度上升到121，压力上升到0.103MPa左右时，保持20min。栽培培养基126（147.1kPa）保持150min。（6）降压 停止加热，让其自然降压。当压力降至0以后，打开排气阀，相隔一定时间后，拧开紧固螺栓，取出锥形、平板和试管。最后待将灭菌锅冷却后，把灭菌锅内的水排放干净。将灭菌处理后的锥形瓶一起放进无菌工作室。待试管冷却到50左右时，等到所有的培养基都凝固后，一并放入恒温培养箱，温度控制在37，放置2448小时，进行无菌检查。将经过灭菌后的纯净水密封好，保藏备用。表一:MS培养基母液配制成分分子量（g/mol）规定用量（mg/L）扩大倍数称取量/mg母液定容体积/ml配制1LMS培养基吸取量/ml大量元素KNO3101.21190010190001000100NH4NO380.04165016500KH2PO4136.091701700MgSO4.7H2O246.473703700CaCl2.2H2O147.024404400微量元素KI166.010.83100083010001H3BO361.836.26200MnSO4.4H2O223.0122.322300ZnSO4.7 H2O287.548.68600Na2MoO4.2 H2O241.950.25250CuSO4.5 H2O249.680.02525CoCl26H2O237.930.02525铁盐Na2.EDTA372.2537.31003730100010FeSO4.7H2O278.0327.82780有机物质肌醇1001005000100010甘氨酸2.0100盐酸硫胺素Vit.B10.15盐酸吡哆醇Vit.B60.525烟酸0.525蔗糖30000琼脂20000pH 5.8 根据实验理论基础，为更好的分析2,4-D和6-BA对何首乌愈伤组织诱导的影响。查阅资料后，得出两种激素的使用范围和大致的最佳浓度，根据查阅数据将激素配制成不同的培养基类型。表2.2： 2,4-D 和6-BA的配制的培养基类型培养基类型2,4-D（mg/L）6-BA(mg/L)10.50.220.50.530.50.841.00.251.00.561.00.871.50.281.50.591.50.82.2.4 接种和培养 培养基经配制和灭菌后，便可进行接种。为避免接种过程中污染杂菌，接种工作要在无菌室或接种箱中进行。无菌室的体积要求不宜过大，一般68立方米，能供一、二人操作即可。室内装有紫外线杀菌灯，门窗关闭后里面的空气能与外界隔绝，经消毒就能造成无菌条件。 无菌室和接种箱的灭菌方法，常用的有下列几种： 1.紫外灯灭菌 用于空气中灭菌，30瓦紫外灯距桌面1米照射15分钟或30分钟。 2.化学药品灭菌 所用化学药品的种类甚多，主要的是： （1）70酒精 用于接种针以及接种人员的手和玻璃器具的表面杀菌。 （2）5石碳酸 用于空间喷雾灭菌。 （3）0.1升汞水 用于分离材料的表面消毒。 （4）甲醛溶液 用于空间熏蒸灭菌，可将福尔马林放在瓷器中，直接加热使其蒸发，或于容器中先加入高锰酸钾，其用量为福尔马林重量的10以上，然后倒入福尔马林，使其蒸发，一般每一立方米体积用10毫升福尔马林即可。 3.火焰灭菌 用于接种针或其他金属用具的灭菌，可直接在酒精灯火焰上烧红。此外，在接种过程中，将试管口，菌种瓶口等采用通过火焰的方式也可达到灭菌的目的。 培养基经灭菌之后，在无菌室或接种箱中，接种前，穿好工作服，待好口罩，先先用消毒液喷洒在实验室消毒除菌，在使用工作台之前先用紫外灯照射3060min，再用70%酒精或消毒液擦洗工作台。接种用的两套接种工具（剪刀、镊子），没使用一次都要在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌。接种后用记号笔在标签纸上写好培养分类标签，并且贴在相对应的三角瓶上。接种后的放在培养室中培养，培养室的大小要适当，过大保温比较困难。四周墙壁用砖砌，石灰粉刷，地面铺水泥，设有通气窗，最好有调温调湿装置，并严格做好消毒灭菌。温度保持在2326之间，培养一个月左右，待愈伤组织长出后观察30天。3 实验结果与分析3.1实验结果在相同的培养条件下，不同激素浓度对愈伤组织的产生和生长影响不同。在实验培养20天左右，实验愈伤组织长势稳定后，根据实验现象数据得出整个何首乌叶片的组织培养研究外殖体中的实验数据如下表三表三 实验结果统计培养基类型整个过程外植体（个）出愈数（个）出愈率（%）污染数（个）污染率（%）褐化数（个）褐化率(%)112637.5850212.5212850.0008503121487.500212.5412318.75425956.25512743.75425531.25612956.2500743.75712212.54251062.5812318.75850531.25912637.5425637.5总计1085840.273222.225437.53.2 实验结果分析3.2.1实验结果出愈分析本次试验较为成功，不同激素搭配的培养基类型都有愈伤组织（图3.2）的产生。在这些愈伤组织中许多长势较好，愈伤组织结构疏松，颜色为浅绿。部分愈伤组织的长势一般，颜色为白色或灰白色。也有较少数的愈伤组织的生长很差，在长出愈伤组织一朵时间后，愈伤组织没有继续成长，而是慢慢的褐变死亡。总的来说实验还是成功的。根据实验结果统计（表3.1）得到实验愈伤组织的出愈率，根据数据绘制图3.1。通过对图3.1的观察比较得出在本次试验中，不同激素搭配的培养基类型的出愈率情况。图3.1 不同类型培养基何首乌叶片的出愈率37.55087.518.7543.7556.2512.518.7537.50102030405060708090100123456789培养基类型出愈率（%）通过对图3.1分析比较得出：（1）在整个研究中第3组培养基出愈率最高，达到87.5%。第7组培养基出愈率最低，只有12.5%。（2）每一组培养基都有愈伤组织的产生，但是愈伤组织的出愈率普片较低，大多数度低于50% 。（3）由图3.1看出，实验成果的出愈率在图中分布呈三部分，每部分的出愈率是由低到高。（4）实验出愈率可分成三部分，看出每部分的处于率之间的梯度差异基本相对较小，但第3组与其他两组之间的梯度差异性较大，由图分析，第3组实验结果存在偶然性。图3.2 何首乌叶片愈伤组织在攀枝花室温环境下，2，4-D和6-BA对何首乌叶片愈伤组织的诱导实验中。由实验结果知，第3组实验的出愈率最好，与其他几组的实验结果相差较大。且第三组实验愈上组织长势最好。故，用第3组的实验结果数据即2,4-D 1mg/L和6-BA 0.5mg/L最为最佳激素浓度。实验结果与查阅的资料数据进行比较，何首乌组培得出的结论有很大的差别。在查阅的资料中，大多数诱导何首乌叶片的激素配比中2，4-D和6-BA的最佳浓度分别是1mg/L和0.5mg/L，出愈率最高，生长得也最好。3.2.2实验褐化分析褐化又称为褐变，是指培养材料向培养基释放褐色物质，致使培养基逐渐变褐，培养材料也随之变褐甚至死亡的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。培养材料褐化所产生的醌类物质当扩散到培养基后，会抑制其他梅的活性，导致代谢紊乱，从而影响离体材料的培养。由表3.1得出实验的褐变率图3.3如下：（1）有图3.3知，在这次实验中，褐变（图3.4）现象比较严重，每个培养基类型中都有褐变的发生，且大部分的褐变率较高。（2）在实验中，培养的褐变率大部分都超过了30%，第7组最高，达到62.5%。综合图中其他几组比较得出，该褐变率偶然性较低。故这次实验的最高褐变率为62.5%。（3）实验的第1组和第3组的褐变率最低只有12.5%。图3.4 何首乌叶片褐变3.2.3染菌分析污染是组织培养最常见和首要解决的问题。所谓污染是指在组织培养过程中，由于细菌，真菌等微生物的侵染，再培养基的表面滋生大量的菌斑，造成瓶培养材料不能生长的现象。在试验中出现染菌现象，染菌实验瓶有部分出现褐色或者黑色的菌丝体，菌丝体为绒毛状，为真菌（图3.6）污染。也出现少数细菌（图3.7）污染，表现为白色，表面湿润光滑的粘稠物。实验中出现真菌污染和细菌污染，依据表3.1作图3.5对实验污染情况分析。有图3.5得，实验组有一半以上出现污染情况。只有第2、3、6三组实验培养基没有被污染。就实验组分析试验的污染情况严重，大部分实验组都有污染。在图3.5中，实验染菌的染菌率最高的有50%，第1组和第8组实验染菌率是50%。其他几组的染菌率只有25%。综合而言，这次实验的污染现象严重，然菌率没有超过50%。大部分实验组污染率低或者未被污染。 图3.7 何首乌叶片染菌图3.6 何首乌叶片染菌4 实验讨论4.1 实验结果讨论4.1.1外植体1 外植体是植物细胞组织培养的成败一个重要因素，为了使外植体适于在离体培养条件下生长，使组织培养工作顺利进行，有必要对外植体进行选择。2 外植体的预处理 外植体需要先进行预处理才能接种。对于以叶片作为外植体，带油脂、蜡质、茸毛，可用毛笔蘸肥皂水刷洗；较大叶片可剪成若干带叶脉的叶块，大小以能放入冲洗用容器即可。材料接种前必须进行表面消毒。由于材料带菌程度不同，而且材料对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样。所以，消毒剂的选择和浓度大小以及消毒时间的长短一定要有针对性，这样才有可能达到预期的消毒效果。作为好的消毒剂既要有良好的消毒作用，又要容易被无菌水冲洗掉或能自行分解。此外，还不会损伤材料，影响细胞的生长。目前使用的消毒剂的种类较多，实践中可根据情况从表4.1中选取12种。表4.1 常用消毒剂的使用浓度及消毒效果的比较灭菌剂使用浓度消毒时间/min去除的难易效果酒精70%75%0.52易好过氧化氢10%12%510最易好漂白粉饱和溶液530易很好次氯酸钙9%10%530易很好次氯酸钠0.7%2%530易很好氯化汞0.1%0.5%310较难最好抗菌素450mg/L3060中较好由上表3.2知，由于氯化汞虽然消毒效果最好，但其有很强的毒性，且不易去除，所以根据实际考虑，在本次研究中采用次氯酸钠作为灭菌剂。4.1.2培养基 1培养基的选择植物组织培养的培养基主要有MS培养基，B5培养基，N6培养基等。在本次实验中选用MS培养基为基本培养基。MS培养基是目前普遍使用的一种培养基。它有较高的无机盐浓度，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响离子间的平衡。这种培养基中的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，无须再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。与其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的明显特点。 2.培养基的灭菌培养基配制完毕后，应立即灭菌。培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内，在汽相120条件下，灭菌20分钟。如果没有高压蒸汽灭菌锅，也可采用间歇灭菌法进行灭菌，即将培养基煮沸10分钟，24小时后再煮沸20分钟，如此连续灭菌三次，即可达到完全灭菌的目的。根据实际条件，在本次研究中采用高压蒸汽灭菌。灭菌效果很好，在预培养中没有染菌情况出现。4.1.3接种将消毒的叶组织转入到铺有无菌滤纸的培养皿内，并用无菌滤纸吸干水分，然后将叶组织切成约0.5cm见方的小块或薄片，上表皮朝上平放或竖插在MS培养基上。在本次研究中，用平放的方式将外植体接种入培养基表面，外植体上表皮朝上。4.1.4褐变 实验褐变的影响因素主要有外植体、培养基、pH值、培养条件等。解决途径有选取适宜的外植体；选取适宜的培养基。琼脂量的减少、较低的pH值利于减少褐变。培养基中适宜的细胞分裂素浓度可以减轻或抑制褐变；选取适宜的培养条件。试验证明适度的低温21、初培暗光或弱光培养22可抑制酚类的氧化。总结