微生物分子生态学技术在文物保护中应用的进展.doc

文物保护与考古科学SCIENCES OF CONSERVATION AND ARCHAEOLOGYVol 24，No 3Aug，2012第 24 卷 第 3 期2012 年 8 月文章编号: 1005-1538( 2012) 03-0108-04知识介绍微生物分子生态学技术在文物保护中应用的进展 王亚丽( 广东省博物馆，广东广州 510623 )摘要: 微生物分子生态学技术近年来在文物保护研究中得到了广泛的应用，已经成为控制文物被微生物侵害的一个不可或缺的工具。本研究较系统地总结了国内外利用微生物分子生态学技术进行文物保护研究的进展，为更有 效防治微生物危害侵蚀文物，进而长久的保存文物提供理论支持。关键词: 微生物; 分子生态技术; 文物保护中图分类号:K877; Q938 1;文献标识码:Q89A培养微生物，甚至取样分析也比传统的方法需要的样品量少，能够以可培养及不可培养的所有的微生 物为研究对象，以微生物的 DNA 研究为手段，揭示微生物群落结构及遗传多样性，并显示出微生物种 群的动态变化。为更好地研究和利用这些资源奠定基础。近年来，分子微生物生态学技术作为一种新 方法开始在文物保护中应用，并且受到越来越多国内外专家学者的重视，并取得了很多进展3 5。引言0微生物种类繁多，它们具有代谢能力强、代谢方式多样、易变异、繁殖快的特点，能够适应各种各样 的生活环境，因此广泛分布于自然界中，形成了独特的微生物生态系统。微生物直接或者间接地影响人类的生活，对文物也具有相当大的危害。无论是南 半球或是北半球，无论是密藏在地上或是深埋于地 底，都难逃微生物的侵害，至于暴露在地面的一些古建、石窟、壁画等文物被微生物侵害的现象更是屡见不鲜，因此微生物的防治工作一直是困扰文物保护 界的难点之一。只有详细鉴定微生物种属、了解不 同环境条件下的微生物种群结构、代谢方式，才能更有效地防治微生物的危害侵蚀，进而长久地保存文物，永传后世。早期主要是应用传统的微生物培养技术分离培 养损害文物的微生物，依据微生物的形态及生理生 化特征对其进行鉴别分类，然后进行防治修复。但 由于培养条件、营养限制、失去生态位等因素，微生 物在常规条件都是不可培养或难培养的，据估计能 培养的大约 只 占 1% 1，这也限制了文物 中 菌 种 的 分离鉴定研究。随着分子生物技术的飞速发展，科 学家们将分子生物学实验技术应用于微生物生态学 研究领域进而发展形成一门交叉学科分子微生 物生态学2，这种技术不需要利用传统的方法分离116S rDNA /18S rDNA 鉴定菌种在文物保 护中的应用基 于 细 菌 16S rDNA 和 真 菌 的 18S rDNA 的 高 度保守型，设计通用引物，扩增出特异性的片段，进 行微生物分类鉴定是现代研究中常用的微生物分子 鉴定方法。这种方法在分子微生物系统学、微生物 的分类鉴定等研究方面作出重要贡献。原理是微生 物中的 rRNA ( 小亚基核糖体核酸 ) 具 有 高 度 保 守 性，尤其是细菌中的 16S rRNA 和 真 菌 中 的 18S rRNA，因此常通过比较 16S rRNA /18S rRNA 的序列 差异来揭 示 菌 种 之间差异以及分类鉴 定6。由 于 rRNA 直接由 rDNA 转录过来，因此常用 16S rDNA /18S rDNA 序列两端非常保守的区域作为引物进行 PCR 直接扩增 16S rDNA /18S rDNA，可 以 达 到 同 样 的效果。一般认为，16S rDNA /18S rDNA 序列同 源 性小于 98% ，可 以 认 为属于不同的种，同 源 性 小 于收稿日期: 2011 -03 -20 ; 修回日期: 2011 -09 -28作者简介: 王亚丽( 1978 ) ，女，中国科学院南海海洋研究所博士毕业，专业环境微生物学，现于广东省博物馆从事文物保护研究工作。E-mail: gzmwyl 126 comelectrophoresis，DGGE) 能够把长度相同但是核苷酸序列不同的 DNA 片 段 分 辨 开，是 20 世 纪 80 年 代 初期 Lerman 等发明的一种检测 DNA 片段中点突变 的技术，分辨率可达到一个核苷酸。Myuzer11 等于1993 年首次将这项技术应 用于微生物的群落结构 93% 95% 可以认为属于不同属。这种鉴定方法可以从样品中直接提取、分析，比较其序列，进而做出 系统发育树，确定其在家族中的位置，克服了传统的 微生物只研究可培养微生物的局限性，并且快速、敏 感、特异性强( 图 1) 。研究，通过分辨不同核苷酸序列的 16S rDNA 片段，研究菌群的生态多样性。这项技术不需要分离培养微生物，直接提取微生物样品的总 DNA，然后用 16S rDNA /18S rDNA 的通用引物进行扩增，扩增的片段 通过 DGGE 电 泳 后，在凝胶中形成不同的条带，每 个条带代表一个菌种，并且条带的亮度代表这种菌 在群落中的丰度; 这种方法不需要培养分离菌种，可 同时分析多个样品，快速、方便，在揭示自然微生物 区系的微生物遗传多样性和微生物种群异化方面具 有独特的优越性，因此被广泛引用到分子微生物生 态学研究领域，尤其在微生物多样性检测、微生物鉴 定、微生物分子变异以及种群异化等方面得到广泛 的应用2。微生物 在文物表面形成一层生物膜，产 生 不 同的代谢 产 物，通 过 DGGE 技 术可以研究文物表 面或文物 的微生物群落多样性，分 析 文 物 表 面 的 微生物生 态 系 统，从而研究微生物对 文 物 的 生 物 腐蚀机理。2006 年 墨 西 哥 的 McNamara12 从 石 质 文物中提 取 微 生 物 的 总 DNA，利 用 DGGE 电 泳 技 术研究玛 雅遗址中的微生物生态多 样 性，通 过 分 析石质表 面和内部微生物群落的差 异 性，为 玛 雅 遗址的保护提供了更为有效 的 理 论 依 据。这 种 方 法还被成功地应用到澳大利亚斯提 里 亚 赫 贝 尔 施 泰因城堡的凯瑟琳教堂的三个不同 的 壁 画 腐 蚀 的 研究中，利 用 DGGE 很 方 便 地 鉴定出双孢放线菌 属( Actinobispora) 、无 枝 酸 菌 属 ( Amycolata ) 、原 小 单 孢 菌 属 ( Promicromonospora ) 、红 色 杆 菌 属( Rubrobacter) 等 种 菌，尤 其 令 人 吃 惊 的 是 在 壁 画图 1 微生物传统培养鉴定法及 rDNA 鉴定法流程图Fig 1 Traditional microbial training methods and rDNA identification methodsRlleke 等7首先将这种技术引 入 到 文 物 保 护领域，利 用 微 生 物 的 16S rDNA ( RNA) 基 因 分 析 结 合，从古代壁画中鉴定出聚磷菌 ( Halomonas) 、芽 胞梭菌( Clostridium) 、弗兰克 氏 菌 ( Frankia) 等 多 种 微 生物。这些菌种都是首次从壁画中鉴定出来，不能采用传统的实验室微生物培养方法进行培养分离。 Pace，N R 8 和 Schabereiter-Gurtner 等9 利用此技 术分别从澳大利亚和德国的 壁画中鉴定出稀有的 Rubrobacter 菌。2003 年，Sara 在保护“Vasa 号沉船”的国际项目中，利用16S rRNA技术研究了 Vasa 船板 上的微生物 群 体，鉴别出本土异养菌、纤 维 素 分 解110文物保护与考古科学第 24 卷作者大大开了眼界，随着研究工作的不断开展，相信这些技术将在文物科技保护中发挥越来越重要的作 用。产甲烷古 菌 群 落的分子指纹图谱。发 现 现 代 水 稻土、商周时期古水稻土和新石器时期古水稻土中细 菌、古菌及产甲烷古菌群落的 DGGE 条带类型各不 相同，说明不同时期水稻种植活动可以引起特异性 的细菌、古菌与产甲烷古菌群落发育，而且不同的栽 培措施可能导致不同的优势种群，为研究古代农业 提供了理论支持15。参考文献:1 Amann R l，Ludwing W，Schleifer K H Phylogenetic identificationand in site dection of individual microbial cells without cultivationJ Microbiol Rev，1995 ，9: 143 -169 2 张惠文，张倩茹，周启 星，等 分子微生物生态学及其研究进展 J 应用生态学报，2003 ，14( 2 ) : 286 -292 ZHANG Hui-wen，ZHANG Qian-ru，ZHOU Qi-xing，et al Intoduc- tion and progress of molecular microbial ecology J Chin J Appl Ecol，2003 ，14( 2 ) : 286 -292 3 Cappitelli F，Principi P Sorlini C Bioderterioration of modern mate- rial in contemporary collections: can biotechnology help? J Trends Biotech，2006 ，24: 350 -354 4 Stomeo F，Gonzalez J M，Saiz-Jimenez C Analysis of the bacteria communities on painting and engravings in Doa Trinidad Cave ( Ardales，Malaga，Spain) J Coalition，2007 ，14( 7 ) : 24 -26 5 Gorbushina A A，Heyrman J，Thomas D，et al Bacterial and fungal diversity and biodeterioration problems in muraq painting environ- ments of St，Martins church ( Greene-Kreiensen，Genrmay) J Int Biodeter Biodergr，2004 ，53: 13 -24 6 Devereux R，HE S H，Doyle C L，et al Diversity and origin of Des- ulfovibrio species : phylogenetic definition of a family JJ Bacteriol，1990 ，172: 3609 -3619 7 Rlleke S，Muyzer G，Wawer C，et al Identification of bacteria in the biodegraded wall painting by denaturing gradient gel electropho- resis of PCRamplified gene fragments coding for 16 S rRNAJ Appl Envir Microbiol，1996 ，62: 2059 -2065 原位荧光杂交( FISH) 检测技术在文物保3护中的应用原位荧光杂交技术 ( Fluorescent in situ hybrid- azation，FISH) 1 发明于 20 世纪 70 年代，是根 据 已 知微生物不同分类级别上种群特异的 DNA 序列，以 利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，然 后进行原位杂交探测，可以在原位的状态下，检测该 特异微生物种群的存在与丰度，并可提供部分关于 形态、空间分布等信息。该方法可鉴定和定量分析 微生物种群，并可对特异微生物跟踪检测，是目前在 分子微生物生态学领域应用比较广泛的方法之一。 意大利 Milan 大 学 的 Cappiotelli3 是 一 位 从 事 文 物 保护工作的微生物学家，在澳大利亚斯提里亚赫贝 尔施泰因城堡的凯瑟琳教堂的壁画的保护研究中， 她 和同事利用荧光原位杂 交，获得蓝细菌蓝藻 ( Cyanobacteria) 和太古 代 微 生 物 ( 嗜 盐 菌 所 属 的 种 类) ( Archaca) 在壁画样品中分布和丰度等信息，这 些研究为文物的微生物防治提供了有效的技术理论支持16。 :8 Pace N R New persperctive on the natural microbioal world molec-ular microbial ecologyJ AAM News，1996 ，62: 463 -469 9 Schabereiter-Gurtner C，Piar G，Lubitz W，et al An advanced molecular strategy to identify bacterial communities on art objectsJ J Microbiol Methods，2001 ，45: 77 -87 10 Abrusci C，Martin-Gonzalez A，Del Amo A，et al Isolation and identication of bacteria and fungi from cinematographic lmsJ Int Biodeter Biodegr，2005 ，56: 58 -68 11 Muyzer G，Waal E C de，Uitterlinden A G Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel elcectrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for16 S rRNAJ Appl Envir Microbiol 1993 ，59: 695 -700 12 McNamara C J，Perry T D，Bearce K A，et al Epilithic and endo-4结语分子微生物生态学技术的诞生是在传统微生物理论基础上的巨大进步，突破了传统培养的局限性， 使传统微生物生态学研究领域由自然界中可培养微 生物种群扩展到微生物世界的全部生命形式( 包括 可培养、不可培养、难培养的微生物及其自然界中环 境基因组等) 2，为更好地研究和利用这些资源奠 定基础。由上文综述，在近年来的文物保护中，已经应用 了一些微生物生态技术3 5，7 9，这些技术为文物保 护开辟了一个新的领域，利用这些分子生态学技术， 不仅可以研究损害文物的微生物种类，还可以研究 微生物对石质、壁画、木质、纸质甚至金属文物等的 腐蚀降解机理，为生物修复技术提供基础。但作为 一门崭新的文物保护技术，这些技术的应用在我国 只是单个的、零碎的、没有广泛的应用，更没有向体lithic bacterial communities in limestone from a Maya archaeologi-cal siteJ Microbiol Ecol，2006 ，51: 51 -64 13 Piar G，Saiz-Jimenez C，et al Archaeal communities in two dispa- rate deteriorated ancient wall paintings: detection，identification and temporal monitoring by DGGEJ FEMS Microbiol Ecol，2001 ，37( 1 ) : 45 -54 14 Astrid Michaelsen，Flavia P，Katrin R，et al Application of molec- ular techniques for identification of fungal communities colonising paper material J Int Biodeter Biodegr， 2006 ，58 ( 3 -4 ) :系化推进。尽管这样，这些技术的威力却让文博工133 -141 15 申卫收，尹 睿，林先贵，等 绰墩山遗址古水稻土细菌与古菌 群落 的 PCR-DGGE 分 析 J 生 态 学 报，2008 ，6 ( 28 ) :2916 -2924 SHEN Wei-shou，YIN Rui，LIN Xian-gui，et al PCR-DGGE analy- ses of bacterial and archaeal community diversities in ancient pad-dy soils discovered in Chundunshan Site ，Suzhou，ChinaJ ActaEcol Sinica，2008 ，6( 28 ) : 2916 -2924 16 Gonzlez J M，Saiz-Jim