毕业论文(医学类)CTLA4 基因显子1的49位点基因多态性与T2DM.pdf

分类号 密级 u dc 论文编号 硕士学位论文 m a s t e rt h e s i s p p a r 5 8 7 t c 基因多态性与2 型糖尿病的 相关代谢指标关系的研究 于晓静 大连医科大学 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地 方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 膨 签字日期 宦竺 年 月监日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留 使用学位论文的规定 同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机 构送交学位论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授 权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位 论文 论文作者签名 指导教师签名 签字日期 葛垃 型年 月卫日 c t l a 4 基因外显子1 的4 9 位点基因多态性与t 2 d m 硕士研究生 指导教师 专业名称 顾雁 苏本利教授 内科学 摘要 背景糖尿病发病机制至今未明 l 型糖尿病和某些2 型糖尿病在临 床上很难区别 虽然t 1 d m 和t 2 d m 属于2 类疾病 但在d 细胞减退方 面可能存在共同机制 c t l a 4 参与了t 细胞免疫应答调控过程 c t l a 4 4 9 a g 虽然与自身免疫性糖尿病相关 目前尚缺乏该基因与2 型糖尿病发病的相关性研究 目的本实验之目的在于研究该c t l a 4 4 9 a g 基因变异与t 2 d m 发病的相关性 并比较了不同基因型的代谢特点 探讨是否该基因的检 出是否有利于从2 型糖尿病中发现更多t 1 d m 之可能 方法1 实验对象 随机选取于铁路医院或我院住院确诊为2 型糖尿 病患者l l l 例 诊断根据1 9 9 7 年美国糖尿病协会 a d a 提出的糖尿 病诊断标准 排除典型1 型糖尿病患者及继发糖尿病患者 正常对照 组为铁路医院或我院住院病人或体检者3 9 例 查餐后2 h 血糖以排除糖 耐量异常患者 排除糖尿病家族史者 无相关代谢疾病 2 常规空腹 8 1 2 d 时 抽取受试者外周静脉血 离心取血清 提取人外周血有核 细胞基因组d n a 用对该区域设计的特异引物进行p c r 扩增 用b b v i 酶酶切 用2 5 琼脂糖电泳区分不同的基因型 常规测定入选者胰 岛功能 b m i 收缩压 舒张压 t g c h o l h d l c f b g 等多项指 标 空腹去尿 短衣测量体重 身高 腹围 计算b m i 记录其病程 是否应用胰岛素治疗等 分组进行统计学分析 结果1 受试者基因分布情况 正常对照组a a a g 和g g 基因 型比例分别为1 0 3 5 1 3 和3 8 5 正常对照组分别a 和g 等位基因 频率分别为为0 3 5 9 和0 6 4 0 g g 基因型为多数基因型 本次实验结果 符合亚洲人的基因分布特点 2 分析t 2 d m 组基因型及等位基因频率 得a a 纯合子者占4 5 a g 杂合子占6 4 5 g g 纯合子占31 5 而 正常对照组a a a g 和g g 基因型比例分别为1 0 3 5 1 3 和3 8 5 而t 2 d m 患者中c t l a 一4 基因第l 外显子第4 9 位a 的基因频率为0 4 4 5 g 的基因频率为0 5 5 5 正常对照组分别为0 3 5 9 和0 6 4 0 各组之间均 无统计学差异 3 通过对糖尿病和非糖尿病组的临床和生化指标的分 析 糖尿病组的总胆固醇有下降趋势 4 9 士1 2v s 5 6 士1 3 v s 5 6 士1 3 p 0 0 4 1 在a a a g g g 组间有显著性差异 a a a g 组为 5 6 士1 3 g g 组为4 9 a 1 2 p 0 0 1 3 c t l a 一4 基因外显子1 的4 9 位点 g g 基因型有起病年龄相对更年轻的趋势 5 3 士1 2 1 v s 5 5 8 7 1 0 9 v s 6 2 6 5 1 3 5 和胰岛素应用比例更高的趋势 b m i 收缩 压 舒张压 t g 等指标相对较低 但无统计学意义 结论西班牙人和意大利人的结果不同 中国人g g 基因型为多数 基因型 而a a 基因为少数基因型 虽然本次实验c t l a 4 基因外显子 1 的4 9 位基因多态性分布与t 2 d m 发病无明显相关性 但g 等位基因仍 有可能是t 2 d m 的易感因素之一 关键词 c t l a 4糖尿病多态性 遗传学 t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc t l a 4 9p o l y m o p h i s m a n dt y p e2d i a b e t e s m a s t e rd e g r e ec a n d i d a t e g u y a n s u p e r v i s o r p r o f e s s o rs ub e n l i m a j o r i n t e r n a lm e d i c i n e a b s t r a c t b a e k g r o u n dn ep a t h o g e n e s i so ft y p e2d i a b e t e si sn o tc l e a ry e t i t i sh a r dt oi d e n t i f yt y p ela n dt y p e2d i a b e t e si nc l i n i c a l a l t h o u g ht y p e1 a n dt y p e2d i a b e t e sb e l o n gt ot w ok i n d so fd i s e a s e s t h e r em a y b ee x i s ta c o m m o nm e c h a n i s mi nbe e l ld y s f u n c t i o n c t l a gp a r t i c i p a t e si nt h e c o n 仃o lc o u r s eo ftc e l li m m u n er e s p o n s e a l t h o u g hc t l a 44 9c l o s e l y r e l a t e dt ot y p eld i s e a s e t h e r ei sl a c ko ft h er e s e a r c ha b o u tt h ea s s o c i a t i o n b e t w e e nc t l a 4a n dt y p e2 d i a b e t e s o b i e c t i v e s e a r c ho nt h ea s s o c i a t i o nb e t w e e nc 1 1 l a 4g e n e v a r i a t i o na n dt h et y p e2d i a b e t e s c o m p a r et h em e a t a b o l i cc h a r a c t e ro f d i f f e r e n tg e n o t y p ea n de x p l o r ew e t h e ri ti sah e r i d i t ys u s c e p t i l i t yi n d e xt o i d e n t i f yd i a b e t e so fi n s u l i nl a c k t y p e2d i a b e t e s a n dd i a b e t e so fi n s u l i n r e s i s t a n c e t y p eld i a b e t e s m e t h o dr a n d o m l ys e l e c tl l1c a s e so ft y p e2d i a b e t e sp a t i e n t s d i a g n o s e d a st h ec r i t e r ao fa d a19 9 9 a n d3 9h e a l t h yp e o p l ea s c o n t r o l d i s p i t eo ft y p i c a lt y p e ld i a b e t e sa n ds e c o n d a r yd i a b e t e s n e c o n t r o lg r o u pi sd i s p i t eo ft h ep e r s o no fi g t o rw i t hd i a b e t e sf a m i l y h i s t o r yo rr e l a t e dm e t a b o l i cd i s e a s e a sa sw e l l a r e rr o u t i n e l yf a s t i n g8 1 2 h o u r s t h ep a r t i c i p a n t sw e r ea t t r a c t e db l o o df r o mp e r i f e r i a lv e n o u s t h e b l o o dw e r ec e n t r e dt ob et a k e ns e r u ma n dp i c k e du pg e n o m ed n af r o m n u c l e u sc e l lo fp e r i p h e r a lb l o o d t h eg e n o t y p eo fc t l a 一4 4 9w a sa n a l y z e d i np a t i e n t sw i t ht y p e2d i a b e t e s a n dc o n t r o l sw e r ea n a l y z e db yp o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s ma n a l y s i s w e d e t e c tt h e i rb l o o dp r e s s u r e f i n s t g c h o l h d l c b o d yw e i g h t h e i g h t l d l ca n df b ga sw e l l c a l c u l a t eb m lw i t hb o d yw e i g h ta n d h e i g h t s t a t i s t i ca n a l y s i st h ed a t aw i t hd i f f e r e n tg r o u p s 3 r e s u l t s1 i nc o n t r o lg r o u p t h eg e n o t y p ed i s t r i b u t i o ni sa a 1 0 3 a g 51 3 a n dg g 3 8 5 w h i c hi sa c c o r d i n gt ot h e g e n o t y p ed i s t r i b u t i o nc h a r a c t e ro fa s c i a 2 t h ea l l e l ef r e q u e n c i e so f a ga n dt h eg e n o t y p ed i s t r i b u t i o ni np a t i e n t sw i t ht y p e2d i a b e t e sa n d c o n t r o lg r o u pa r e a a 4 5 v s 1 0 3 a g 6 4 5 v s 5 1 3 g g 3 1 5 v s 3 8 5 a 4 4 5 v s 3 5 9 g 5 5 5 v s 6 4 1 t h e r e w e r en o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t 3 d e t a i l e d a n a l y s i s o fc l i n i c a la n d b i o c h e m i c a lp a r a m e t e r sr e v e a l e dt h a tt h ec h o l e s t e r o li na a a gg r o u pi s s i g n i f i c a n t l yh i g nc o m p a r i n gw i t hg gc a r r i e r r 5 6 e 1 3v s 4 9 1 2 p 0 0 1 31 t h e r ei sat e n d e n c yo fg gc a r r i e rt o w a r dl o w e rc h o l e s t e r o l 4 9 a 1 2v s 5 6 a 1 3v s 5 6 a 1 3 p 0 0 4 t h e r ei sa l s oat e n d e n c yo fg g c a r r i e r a l a n i n e a l a n i n e t o w a r d sh i g h e rp o r t i o no fp a t i e n t s o ni n s u l i n y o u n g e ra g e a td i s e a s e m a n i f e s t a t i o n 5 3 l 1 2 1 v s 5 5 8 7 1 0 9 v s 6 2 6 5 m3 5 a n dl o w e rb l o o dp r e s s u r e l i p i d l d l ca n db b u tw i t h o u t s t a t i s t i cd i f f e r e n c e c o n c l u s i o nd i 氐rf r o me n g l a n da n ds p a n i s hp e o p l e t h eg g g e n o t y p ei s am a j o rg e n o t y p ew h i l ea ai sal i t t l e a l t h o u g hc t l a 4 g e n ea gp o l y m o r p h i s md o e sn o ta s s o c i a t e dw i t ht y p e2d i a b e t e s o b v i o u s l y i ti ss t i l lo n eo fs u s c e p t i b l eg e n eo ft y p e2d i a b e t e s k e yw o r d s c t l a 4 p o l y m o r p h i s m g e n e t i c st y p e2d i a b e t e s 4 c t l a 4 基因外显子l 的4 9 位点基因多态性与t 2 d m 硕士研究生 指导教师 专业名称 顾雁 苏本利教授 内科学 前言 糖尿病是常见的多基因遗传性疾病 至今病因不明 遗传机制在 糖尿病发病过程中占有重要地位 t 2 d m 存在显著异质性 从胰岛素抵 抗显著伴1 3 细胞功能紊乱到1 3 细胞功能异常为主伴不同程度的胰岛素 抵抗不同状态 针对胰岛自身免疫相关的自身抗体测定在t 2 d m 中有相 当的阳性率 但有人发现具有高滴定的抗体的个体并不代表1 3 细胞功 能减退的速度 近来研究也发现t 细胞功能异常更可能是b 细胞损伤的 本质 甚至也有人提出不宜区分t 1 d m 和t 2 d m 在t l d m 和t 2 d m 中都存在胰岛1 3 细胞凋亡 导致胰岛素绝对或相 对不足 在t 1 d m 这种凋亡源于自身免疫 在t 2 d m 这种凋亡源于高糖 饱和脂肪酸 脂肪分泌因子和先天免疫系统的慢性激活 在这两种糖 尿病中 内生的胰岛的炎性介质似乎激发了共同的1 3 细胞凋亡途径 1 研究表明c t l a 4 基因多态性与t 1 d m 密切相关 c t l a 4 是t 细胞 表面激活分子 有抑制t 细胞增生 活化和诱导t 淋巴细胞耐受 参与 自身免疫性疾病的发生 发展 c t l a 4 基因多态性与g r a v e s 病等t 细 胞介导的自身免疫性疾病密切相关旺 6 在t 1 d m 发中细胞免疫可能占 主导地位 因此c t l a 4 基因变异会导致t 细胞功能异常 从而介导了胰 岛1 3 细胞免疫损伤 t 细胞介导的胰岛1 3 细胞胰岛素分泌缺陷是决定糖 尿病是否发生的关键因素 鉴于c t l a 4 在t 细胞免疫调节中的重要作 用 它是否也参与了t 2 d m 的发生昵 当前尚缺乏c t l a 4 基因变异在 t 2 d m 发病中的作用的研究 为此 我们研究该基因变异在t 2 d m 发病 中的作用 并探讨该基因变异是否可作为区分胰岛素缺乏型 1 型 和胰 岛素抵抗型 2 型 的遗传易感性指标 材料和方法 1 研究对象 随机选取于铁路医院或我院住院确诊为2 型糖尿病患者1 1l 例 诊 断根据1 9 9 7 年美国糖尿病协会 a d a 提出的糖尿病诊断标准 排除 典型1 型糖尿病患者及继发糖尿病患者 正常对照组为铁路医院或我 院住院病人或体检者3 9 6 4 查餐后2 h 血糖以排除糖耐量异常患者 排 除糖尿病家族史者 无相关代谢疾病 常规空腹8 1 2 d x 时 离心取血 清 提取人外周血有核细胞基因组d n a 用对该区域设计的特异引物 进行p c r 扩增 用b b vi 酶酶切 用2 5 琼脂糖电泳区分不同的基因 型 常规测定入选者胰岛功能 b m i 收缩压 舒张压 t g c h o l h d l c f b g 等多项指标 空腹去尿 短衣测量体重 身高 腹围 计 算b m 记录其病程 是否应用胰岛素治疗等 2 主要试剂与仪器 2 1 主要试剂 1 g e n o m ed n a e x t r a t i o nk i t 购至宝生物工程 大连 有限公司 2 p c r 上下游引物 由大连宝生物公司合成 3 t a q 聚合酶 d n t p m g c l 2 1 0xp c r 缓冲液 m a r k e r 琼脂 糖 漠化乙锭 购至p r o m e g a 公司 4 10 xn eb u f f e r2 购至n e w e n g l a n db i o l a b si n c 5 bbvi 限制性内切酶r 0 1 7 3 v 购至n e we n g l a n db i o l a b s i n c 2 2 主要仪器 1 p c r 仪g e n e a m pp c rs y s t e m9 7 0 0 2 u v pc h e m s y s t e m 3 d y y 2 c 型电泳仪 北京六一仪器厂生产 4 t g l 1 6 c 台式离心机 上海安亭仪器厂生产 5 d k 8 d 型温育箱 6 7 0 低温冰箱 7 4 普通冰箱 8 恒温水浴箱 9 电子天平 1 0 微量移液器 规格分别为1 0 u l 2 0 0 u l 1 0 0 u l o 2 u 1 3 研究方法 3 1 基因组d n a 提取 1 取e d t a 抗凝静脉血4 m l 充分混匀 室温下2 0 0 0 r p m 离心2 0 分钟 可见位于血浆与红细胞层之间的白细胞层 用吸管将白细胞层 移入离心管中 8 0 保存 2 取冻存自细胞1 0 0 山 加入g e nt l es o l u t i o n10 5 m l 立即混匀 室温放置1 0 分钟 1 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟 3 除去上清液 加入g e nt l es o l u t i o n l il m l 轻轻颠倒2 3 次 1 2 0 0 0 r p m 室温离心5 分钟 4 除去上清液 加入g e nt l es o l u t i o n l i io 5 m l 混匀1 0 秒钟 1 2 0 0 0 r p m 室温离心5 分钟 5 将上清液移入新离心管中 与等量的异丙醇充分颠倒混合 1 2 0 0 0 r p m4 离心5 分钟 6 除去上清 7 0 乙醇清洗2 次 简单干燥 加入t e5 0 9 l 溶解 3 2 紫外分光光度法测定d n a 含量与浓度 取1 0 9 ld n a 溶液稀释5 0 倍 于2 6 0 n m 和2 8 0 n m 两个波长下读 数 以o d 2 6 0 o d 2 8 0 估计d n a 浓度 比值在1 6 1 8 之间者以o d 2 6 0 x 5 0 x 5 0 l m 1 计算原d n a 浓度 比值低于1 6 者 与原d n a 溶液中 加入s d s 直到终浓度为o 5 重复抽提到纯度达到标准为止 3 3 聚合酶链反应 p c r 1 根据文献 7 设计p c r 引物 4 9 a g 多态性上游引物5 一 c c a c g g c t t c c r r t c t c g t a 一3 下游引物5 a g t c t c a c t c a c c t t t g c a g 一3 产物片段长度为3 2 8 b p 2 以基因组d n a 为模板 用聚合酶链反应 p c r 扩增c t l a 4 基因外显子1 包含第4 9 位多态性位点 反应在p c r 扩增仪中进行 具体操作程序如下 在2 5 u l 扩增体系中 基因组d n a 2 u l d n t p 2 u l 5 p m o l l 上游引物 下游引物各l u l 1 0 m mm g c l 22 u l 1 0x 缓冲液2 5 u l t a q d n a 聚合酶 l u l 加去离子水至2 5 u 1 将上述反应液轻弹混匀 短暂离心以集中反应 液于管底 依据设计的循环参数进行扩增 9 4 预变性5 分钟后 9 4 c 变性4 5 秒 5 5 退火4 5 秒 7 2 延伸4 5 秒 循环3 5 周后于7 2 延伸5 分钟 反 应结束后 短暂离心 3 制备2 的琼脂糖凝胶 1 电子天平上秤取2g 的琼脂糖粉末 2 移液器吸取5 0 t a e2 m l 入量筒内 加蒸馏水至1 0 0 m l 3 充分混匀后 将量筒内液体到入装有琼脂糖粉末的椎形瓶 4 置于微波炉内至熔融 5 取出后 加入e b1 0u l 6 将熔融液体到入胶板 同时避免气泡的产生 7 冷却至不烫手为宜备用 4 水平电泳并确定扩增的产物 1 将制备好的胶板放入水平电泳槽内 2 取出5 0 t a e 液 稀释至1 t a e 液 到入电泳槽至稍高 出胶面为宜 3 吸取5ul 扩增产物 余置于4 c 保存备用 并加入1 2u l6 加样缓冲液 轻弹混匀 短暂离心 然后上样于2 琼脂糖凝胶 电泳 同时上样阴性对照 未加模板d n a 而用灭菌去离子水替代 阳性对照 多次重复所获得的稳定的p c r 产物 同时选择合适分 子量d n a 标志物 m a r k e r 水平电泳 4 通电 稳压5 0v 可见阴极端有大量的微小气泡产生 电 泳时间为2 5 3 0 分 5 电泳结束后 取出凝胶 紫外灯下与m a r k e r 跑出的条带相 比较 可判定扩增片段长度为3 2 8 b p 3 4 限制性酶切反应 用限制性内切酶b b v l n e we n g l a n db i o l a b si n c 对p c r 扩增产 物进行酶切 具体操作程序如下 向p c r 产物中加入2 5 倍体积的无水乙醇 l 1 0 体积的3m o l l n a a c p h5 2 充分混匀置 2 0 6 0m i n 离心1 5 r a i n 1 20 0 0 r m i n 弃上清 室温下干燥后加入2 0 u l 酶切反应液 0 5 u lb b v i 酶 2 u l1 0 n e 缓冲液 1 7 5 u l 灭菌蒸馏水 将上述反应液短暂离心以集中反应液于 管底 3 7 水浴中过夜进行酶切反应 然后上样于2 5 琼脂糖凝胶 制 备过程同2 琼脂糖凝胶 只是琼脂糖粉取2 5 9 同时上样阴性对照 同前 阳性对照 多次实验确定的稳定的g g 纯合子的酶切产物 选择合适分子量d n a 标志物 m a r k e r 产物经溴化乙锭染色 2 琼 脂糖凝胶电泳 紫外灯下观察结果 c t i a 一4 基因外显子1 的4 9 位点a g 突变会形成b b v i 酶的酶切位点 因此a a 基因型的酶切产物为 3 2 8 b p l 个片段 a g 基因型为3 2 8 b p 2 4 4 b p 军1 8 4 b p3 个片段 g g 基因型 为2 4 4 b p 和8 4 b p2 个片段 注 1 a g 基因型 2 4 g g 基因型 3 从基因型 a a 基因型 3 2 8 b p a g 基因型 3 2 8 b p 2 4 4 b p 8 8 b p g g 基因型 2 4 4 b p 8 8 b p 采用聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性技术分析t 2 d m 患者和健康对照组的c t l a 一4 基因外显子1 的4 9 位点基因型 3 5 统计学处理 用h a r d y w e i n b e r g 平衡规律检测样本代表性 医学统计软件s p s s 12 0 对所有数据进行处理 样本构成比的比较采用卡方检验 样本均数 间的比较采用方差分析 对于t 2 d m 患者各基因型间的各项生化及临床 指标等计量资料比较采用t 检验 显著性检验水准为0 0 5 结果 4 1 糖尿病与非糖尿病临床特征比较 结果见表1 表l 显著性差异 4 2 糖尿病和非糖尿病组不同基因型的分布情况 为了考察资料的可靠性 对对照组c t l a 4 基因型频率进行了 h a r d y w e i n b e r g 平衡检验 各基因型频率己达遗传平衡 具有群体代 表性 对1 1 1 例t 2 d m 患者和3 9 例非糖尿病患者c t l a 4 基因第1 外 显子a g 多态性进行基因分型 结果见表l t 2 d m 患者中c t l a 4 基因第1 外显子第4 9 位碱基为a a 纯合子者占4 5 a g 杂合子占 6 4 5 g g 纯合子占3 1 5 正常对照组a a a g g g 基因型比例 分别为1 0 3 5 1 3 和3 8 5 t 2 d m 患者中c t l a 4 基因第1 外 显子第4 9 位a 的基因频率为o 4 4 5 g 的基因频率为o 5 5 5 正常对 照组分别为0 3 5 9 和o 6 4 1 两者相比较均无显著性差异 p 0 0 5 结果见 表2 表2c t l a 4 4 9 基因型在d m 组与非d m 组中的分布情况 4 3d m 非i m 组不同基因型中特征比较 4 3 1d m 组不同基因型特征比较 根据在c t l a 4 4 9 基因型分组后总胆固醇在g g 基因组有下降 趋势 4 9 1 2v s 5 6 1 3v s 5 6 1 3 p 0 0 4 1 将a a 组与a g 组合并 后与g g 组比较 g g 组总胆固醇的降低有显著意义 4 9 士1 2v s 5 6 1 3 p 0 0 1 3 c t l a 4 4 9 g g 基因型组具有起病年龄相对更早的趋势 6 0 3 士1 0 5v s 6 3 2 1 0 4v s 6 7 6 士1 1 1 和应用胰岛素的比例相对高的 趋势 b m i 收缩压 舒张压 t g 等指标相对较低 但无统计学意义 结果见表3 和表4 表3a a a g g g 基因型t 2 d m 患者的临床资料比较 组别 例数 t g腹围l d l c i rh d l cf b s 表示有显著性差异 表4 胰岛素应用情况 4 3 2 非d m 组不同基因型特征比较 在正常对照组按a a a g 和g g 基因型分组后的临床资料比较 各组 间数据无统计学差异 结果见表5 表5 a a a g 和g g 基因型非糖尿病组的临床资料比较 4 4 糖尿病患者分组后的等位基因和基因型频率分布情况 根据糖尿病患者合并代谢情况分组的c t l a 4 4 9 等位基因和基 因型频率分布情况结果见表6 表7 和表8 以上结果显示糖尿病患者分 组后的等位基因和基因型频率分布情况经卡方检验p 0 0 5 无明显统计 学差异 表6 d m 组患者中h t 组与非h t 组等位基因和基因型频率分布情况 h t 组 6 6 4 6 1 4 2 6 3 6 2 0 3 0 3 5 0 3 7 9 8 2 6 2 1 韭婴堡笪 垡 墅i 型堂 坐 星 堕 盟 表7 d m 组患者中肥胖组与非肥胖组等位基因和基因型频率分布情况 肥胖组 6 6 4 4 2 4 3 4 4 8 1 9 5 1 5 k 3 8 6 8 1 6 1 韭 曼壁塑箜 堡 垄 丝 箜 鱼 壁塑 墅 鱼 室 望坚鱼璺耋 壹堕塑塑兰i 蔓 量堕壅塑笠鱼薹旦塑基里型塑里坌塑堕堡 组别 例数 基因型 等位基因 高血脂组 5 4 4 7 4 3 5 6 4 8 1 5 2 7 8 4 1 3 5 4 7 5 6 4 6 非高血脂组 5 71 1 8 3 6 6 3 2 2 0 3 5 1 3 8 3 3 3 7 6 6 6 6 注 肥胖的b m i 临界点为2 5 参考1 9 9 9 年的 亚太地区肥胖及其治疗的重新定义 高 血压的诊断符合我国高血压联盟制定的 高血压指南 的标准 高血脂以t g 1 7 h d l 0 9 男 h d l i 0 女 为标准 讨论 我们从实验结果看到大连人群非糖尿病组基因型分布为 a a 1 0 a g 5 1 g g 3 8 5 与总中国人群 日本人群 高加索人群 相似而与西班牙人群 意大利人群不同 符合大多数亚洲地区基因分 布特点 结果见表9 表9 世界各国各人群基因型分布 本研究发现t 2 d m 组因型及等位基因频率为a a 纯合子者占4 5 a g 杂合子占6 4 5 g g 纯合子占3 1 5 而正常对照组a a a g 和g g 基因型比例分别为1 0 3 5 1 3 和3 8 5 t 2 d m 患者中c t l a 一4 基 因第1 外显子第4 9 位a 的基因频率为0 4 4 5 g 的基因频率为o 5 5 5 正 常对照组分别为0 3 5 9 和0 6 4 0 各组之间均无统计学差异 此结果与 h a r a l dr a u 等对加索人群4 6 6 个健康人与3 0 0 个糖尿病患者病例对照 研究发现的结果相同 我们从这次实验的糖尿病患者的临床及生化分析看到 g g 组总胆 固醇有下降趋势 4 9 1 2v s 5 6 士1 3v s 5 6 i 1 3 p 0 0 4 1 g g 基因组与 a g a a 组相比胆固醇降低显著 p 0 0 1 3 这在h a r a l dr a u 等 对加索人群的研究中未被提及 我们在实验中看至i j g g 组起病年龄更早 的趋势 6 0 3 士1 0 5v s 6 3 2 1 0 4v s 6 7 6 士1 1 1 和胰岛素应用比例更高 的趋势 这也与h a r a l dr a u 等的发现相同 实验中看至i j g g 组糖尿病 患者有相对更低的血压 腹围 b m i 和l d l c 等 但无统计学意义 我 们虽然没有发现t 2 d m 人群和非糖尿病人群间基因型分布有差异 但是 却发现g 等位基因的代谢紊乱相对较少 因此g 等位基因的差异可能参 与了t 2 d m 的发病过程 同时h a r a l dr a u 等的实验还发现g g 组糖 尿病患者基础c 肽水平更低 o 3 3 士o 0 7v s o 5 34 o 0 7 n m o l l 体重指 数更低 2 1 44 0 5v s 2 4 44 0 5k g m 2 p 0 0 4 2 a n n a 等采取p c r r f l p 技术对意大利8 0 例l a d a 患者 8 5 例正常对照人群进行c t l a 4 4 9 位点a g 二态性分析 得到l a d a 与 健康对照组相比 a g 杂合子为6 9 5 v s 8 5 p 0 0 2 3 o r 2 4 7 a a 纯合子在l a d a 与健康对照组相比为2 6 6 v s 4 7 p 0 0 2 8 o r 0 4 说明与t 1 d m 相似 l a d a 与c t l a 4a g 基因型正相关 细胞毒性t 淋巴细胞相关抗原c t l a 位于2 q 3 3 染色体长臂 它包 含4 个外显子 编码表达在激活t 细胞表面的共刺激分子 包含4 个 外显子和3 个内含子 至少3 个位点的多态性被广泛研究并引起很大 关注 1 位于第1 外显子 4 9 位a g 等位基因2 位于一3 1 8 位启动子位 置t c 等位基因3 位于第4 外显子3 非翻译区 6 4 2 位 a t n 重复序列 c t l a 4 对t 淋巴细胞有负性调节作用 作为协同刺激信号抑制t 细 胞增生 活化并诱导t 细胞耐受 向t 细胞提供抑制性信号 从而抑 制免疫反应 1 2 而且 c t l a 4 还可以介导抗原特异的t 细胞凋亡和 抑制自身反应t 淋巴细胞增殖 1 孙 在调节免疫系统的自身耐受发挥重 要作用 n c t l a 4 具有多个多态性位点 虽然第1 外显子 4 9 位a g 多态性在我们的研究中未发现与t 2 d m 发病无明显相关性 但其它位 点变异与t 2 d m 的关系尚有待研究 结论 与西班牙人和意大利人结果不同 中国人g g 基因为多数基因 而a a 基因为少数基因 虽然本次实验c t l a 4 基因外显子l 的4 9 位 基因多态性分布与t 2 d m 发病无明显相关性 但g 等位基因仍有可能 是t 2 d m 的易感因素之一 参考文献 1 i n ik k a v v o u r aa n dj o h npa i o a n n i d i s e t a 1 c t l a 一4g e n ep o l y m o r p h i s m sa n d s u s c e p t i b i l i t yt ot y p e1d i a b e t e sm e l l i t u s a mjo f e p i d e m i o l2 0 0 5 1 6 2 1 3 1 6 2 y a n a g a w at h i d a k ay g u i m a r a e sv s o l i m a nm d e g r o o tl j c t l a 4 g e n ep o l y m o r p h i s ma s s o c i a t e dw i t hg r a v e s d i s e a s ei nac a u c a s i a n p o p u l a t i o n jc l i ne n d o c r i n o lm e t a b1 9 9 5 8 0 4 1 4 5 3 k e m pe h a j j a nr a h u s e b y ee s p e t e r s o np u i b or i m r i eh p e a r c e s h w a t s o np f w e e t m a na p ae y t o t o x i ctl y m p h o c y t ea n t i g e n 4 c t l a 4 g e n ep o l y m o r p h i s mi sa s s o c i a t e dw i t ha u t o i m m u n ea d d i s o n s d i s e a s ei ne n g l i s hp a t i e n t s c l i ne n d o c r i n o l1 9 9 8 4 9 6 0 9 6 13 4 k o t s ak w a t s o np f w e e t m a na p ac t l a 一4g e n ep o l y m o r p h i s mi s a s s o c i a t e dw i t hb o t hg r a v e sd is e a s ea n da u t o i m m u n eh y p o t h y r o i d i s m c l i ne n d o c r i n o l1 9 9 7 4 6 5 5 1 5 5 4 5 h u a n gd g i s c o m b er z h o uy l e f v e r ta k p o l y m o r p h i s m si nc t l a 一4 b u tn o tt u m o rn e c r o s i s f a c t o r a l p h a o ri n t e r l e u k i n1b e t a g e n e sa r e a s s o c i a t e dw i t h w e g e n e r sg r a n u l o m a t o s i s j r h e u m a t o l 2 0 0 0 2 7 3 9 7 4 01 6 h u a n gd l i ul n o r e nk x i as q t r i f u n o v i cj p i r s k a n e nr l e f v e r t a k g e n e t i ca s s o c i a t i o no fc t l a 4t om y a s t h e n i ag r a v i sw i t ht h y m o m a j n e u r o i m m u n o l19 9 8 8 8 l9 2 一l9 8 7 张绍雏 丁丽等著 t 1 d m 患者及其父母细胞毒性t 淋巴细胞相关抗原4 基 因外显子1 a g 多态性的研究 见 中华医学杂志 2 0 0 5 年3 月 8 m i c h e l ep m a l t o n l e s l i ej r a f f e le t a 1 i n s u l i n d e p e n d e n td i a b e t e sm e l l i t u s t id m i sa s s o c i a t e dw i t hc t l a 4p o l y m o r p h i s m si nm u l t i p l eh u m a nm o l e c u l a r g e n e t i c sh u m a nm o l e c u l a rg e n e t i c s l 9 9 7v 0 1 6 n u m b e r8 p 9 1 2 7 5 1 2 8 2 9 m a t s u s h i t am t s u c h i y an s h i o t am e ta 1 l a c ko f a s s o c i a t i o no fc t l a 4e x o nl p o l y m o r p h i s mw i t ht h e s u s c e p t i b i l i t yt or h e u m a t o i da r t h r i t i sa n ds y s t e m i cl u p u s e r y t h e m a t o s u si nj a p a n e s e a na s s o c i a t i o ns t u d yu s i n gan o v e lv a r i a t i o ns c r e e n i n g m e t h o d t i s s u ea n t i g e n s 19 9 9 5 4 6 5 7 8 5 8 4 1 0 r a uh b r a u nj d o n n e rh e ta 1 t h ec o d o n17p o l y m o r p h i s mo f t h ec t l a 4g e n e i nt y p e2d i a b e t e sm e l l i t u s jc l i ne n d o c r i n o lm e t a b2 0 0 1 8 6 6 5 3 6 5 5 11 a n ac o s e n t i n o g i o c a n n ig a r n b e l u n g h e c t a 1 c t l a 4g e n ep o l y m o r p h i s m c o n t r i b u t e st ot h eg e n e t i cr i s kf o rl a t e n ta u t o i m m u n ed i 曲e t e si na d u l t s a n n a l so f 1 6 t h e n e w y o r k a c a d e m yo f s c i e n c e s9 5 8 3 3 7 3 4 0 2 0 0 2 1 2 许芝银著 治疗自身免疫性甲状腺炎6 5 例临床小结 见 河南中医 1 9 9 71 7 2 1 0 0 1 0 1 1 3 m i c h e l eem a r r o n l e s l i ej r a f t e l e t a 1 i n s u l i n d e p e n d e n t d i a b e t e sm e l l i t u s t id m i sa s s o c i a t e dw i t hc t l a 4p o l y m o r p h i s m si nm u l t i p l eh u m a nm o l e c u l a r g e n e t i c sh u m a nm o l e c u l a rg e n e t