毕业论文--灰霉病菌s2p2核酸酶突变体的遗传互补及表型分析.docx

本科生毕业论文(设计)中文题目 灰霉病菌s2p2核酸酶突变体的遗传互补及表型分析 英文题目 Genetic complementarity and phenotypic analysis of the mutant of s2p2 nuclease of Botrytis cinerea 学生姓名 班级 821305 学 院 植物科学学院 专 业 生物技术（植物） 指导教师 职称 讲 师 目录中文摘要.iiAbstract.iii第一章 前言. 1第1节 灰霉病菌.1第2节 灰霉病菌的研究进展.2第3节 灰霉病菌相关致病因子.3第4节 核酸酶简介.4第5节 研究目的与意义.5第二章 实验材料.6 第1节 材料与设备. .6 第2节 相关引物.6 第3节 培养基及配方.7第三章 实验流程及步骤.8第四章 实验结果与分析.15第1节 构建cBcSPN2载体.15第2节 获得cBcSPN2菌株.18第3节 筛选及表型鉴定.19第五章 结论与讨论.21致谢.22参考文献.23i摘要灰霉病菌（botrytis cinerea）是一种坏死营养型真菌，可以在低温条件下生长发育，并产生大量的灰分生孢子传播，具有潜伏侵染、低温致病、遗传变异大、繁殖快和高适应性的特点。灰霉病是世界上最早有记载和研究的病害。由于快速及广泛地采用温室以及大棚种植技术，作物被灰霉病菌侵染也变得日益频繁，许多被灰霉病菌感染的植株具有珍贵的性状和商业价值，由此造成的经济以及研究上的损失十分严重。随着分子生物学的不断发展,人们对植物与病原之间的互作机制有了更进一步的了解，虽然目前对于灰霉病菌的生物防治过程中存在有许多尚未解决的问题，但生物防治仍具有有巨大的应用潜力。本实验通过对灰霉病菌突变体的回补分析其回补型的表型，进而验证灰霉病菌s2p2基因与灰霉病菌致病机制之间的联系。实验构建了s2p2基因的互补载体并将基因连接其上，利用农杆菌介导的遗传转化的方法，共培养将该基因导入突变体，最后对回补突变体的表型进行比较分析。结果表明互补菌株恢复了其致病性，且其致病力与野生型致病力相当。关键词：灰霉病菌；共培养；表型分析iiAbstract Botrytis cinerea is a kind of necrotic and nutritive fungus, which can grow and develop under low temperature condition and produce a lot of ash conidia. It has latent infection, low temperature disease, genetic variation, fast breeding and high adaptability sexual characteristics. Botrytis cinerea is the earliest documented and studied disease in the world. As a result of the rapid and extensive use of greenhouse and greenhouse cultivation techniques, crops are becoming increasingly susceptible to Botrytis cinerea infection. Many plants infected with Botrytis cinerea have valuable traits and commercial value, resulting in economic and research The loss is very serious. With the continuous development of molecular biology, the mechanism of interaction between plants and pathogens has been further understood, although there are many unresolved problems in the process of biological control of Botrytis cinerea, but biological control is still Has a huge potential for application. In this study, the phenotypic phenotype of paecilomyces mutant was analyzed, and the relationship between s2p2 gene and pathogenicity of Botrytis cinerea was verified. The gene was ligated into the mutant by co-culture with agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation. Finally, the phenotypic phenotype of the mutant was analyzed. The results showed that the complementary strains recovered their pathogenicity, and their pathogenicity was similar to the pathogenicity of mutants.Key words:Botrytis cinerea; Co - culture; Phenotypic analysisiii第一章 前言在露地、保护地作物中常见的且比较难防治的一种真菌性病害就是灰霉病。随着保护地面积的逐渐扩大，灰霉病已经成为保护地栽培种的主要病害之一，它不仅危害叶片、花、茎、还严重危害果实，尤其是青果发病最重，严重影响了作物的产量和品质，目前灰霉病已经广泛引起了大家的重视。灰霉病菌是最早被记录和研究的植物灾害，科学家们在灰霉病菌的研究领域下进行了多种工作，取得了许多成果也进一步了解了有关灰霉病菌的结构，特性及实验方法，国内外对灰霉病的防治研究已取得了一定的进展。但是，目前生产上仍缺乏防治该病害的有效方法。因此对灰霉病菌继续进行分子生物学水平上的研究具有重大意义【1】。第一节 灰霉病菌葡萄孢属真菌都是腐植营养型病原菌，它们以坏死组织为营养，能杀死植物细胞，并在植物的坏死组织上生长发育，其寄主范围十分广泛，能够引起200多种双子叶作物和一些观赏花卉感染灰霉病【2】。灰霉病菌是葡萄孢属中的一个最大的类群，由于真菌种级划分标准一直没有统一的尺度，若进行PCR检测，则有可能区分出不同种或种下单位，或归为不同型种。灰霉病菌作为一个复合种，其种内不同菌株之间在生物学特性、致病性和抗药性上均存在较大差异。灰霉病菌能够在低温条件下(0)生长，靠产生大量的灰色分生孢子进行传播，与其它采后病原真菌相比，具有潜伏侵染和低温致病的优势。同时，其还具有繁殖快、遗传变异大和适合度高的特点【3】。灰霉病菌可使植株的花、果、叶、茎发病。果实染病，青果受害重，残留的柱头或花瓣多先被侵染，后向果实扩展，致使果皮呈灰白色，并生有厚厚的灰色霉层，呈水腐状。叶片发病从叶尖开始，沿叶脉间成“V”形向内扩展，灰褐色，边有深浅相间的纹状线，病键交界分明。灰霉病病苗色浅，叶片、叶柄发病呈灰白色，水渍状，组织软化至腐烂，高湿时表面生有灰霉。幼茎多在叶柄基部出现不规则水浸斑，很快变软腐烂，缢缩或折倒，最后病苗腐烂枯萎病死【4】。灰霉病菌以菌核、分生孢子及菌丝体随病残组织在土壤中越冬。有些地方，灰霉病菌秋天在枝蔓或浆果上形成菌核越冬，也可以菌丝体在树皮和冬眠芽上越冬，其抗逆性强【4】。翌年春季温度回升、遇雨或湿度大时从菌核上萌发产生分生孢子，或是其他寄主上的分生孢子借气流传播到花穗上。分生孢子在清水中几乎不萌发，在花器上有外渗物刺激时很容易萌发侵染，通过伤口、自然孔口及幼嫩组织侵入寄主，实现初次侵染。发病后又可产生大量分生孢子，借风雨传播蔓延进行多次再侵染，引起灰霉病【5】。 该病害是一种典型的气传病害，可随空气、水流以及农事作业传播。在实际病害防治过程中，难以采取有效措施彻底切断传染源；在病原菌侵入的情况下，也难以彻底消灭病原菌第二节 灰霉病菌的研究进展灰霉病最初只是流行于欧洲和美洲，自20世纪80年代才开始在中国发生蔓延。灰霉病在十几年前并不严重，但目前已经成为冬季日光温室种植所面临的一大问题，每年11月到来年3月前，是发病高峰期。而且几乎所有温室里面都会发生，有时候损失惨重【6】。虽然国内外对灰霉病的防治研究已取得了一定的进展。但是，目前生产上仍缺乏防治该病害的有效方法。农业防治只是在发病前起到预防作用，防效并不明显。化学防治具有防效明显、药效持久、使用方便和成本低等优点。但是，由于灰霉病病菌具有繁殖速度快、遗传变异大和适应性强等特性，因此，病菌可在较短时间内对药剂产生抗药性。生物防治具有对人、畜安全、不污染环境等优点，而且可以减少化学农药的使用，解决农药残留问题，延缓病菌抗药性的产生。但是，其防效较低，不稳定，且易受环境因素的影响【7】。而随着分子生物学、细胞生物学、基因组学和蛋白质组学的蓬勃发展，人们日益倾向于从分子的角度研究灰霉病菌的致病机制，开拓了防治新思路并取得了许多可喜的结果。2013年10月4日，美国加州大学河滨分校金海翎等人在出版的美国科学杂志上报告说，灰霉病菌除了会输送特殊蛋白质进入植物细胞内部，以抑制植物免疫防卫机制，从而达到有效侵染的效果外，还会利用一种叫做小分子RNA的分子进入植物细胞内部，从而抑制植物免疫系统，这也是首次发现有病原菌利用小分子RNA来达到有效侵染的效果【8】。同时，研究人员怀疑，除了灰霉病菌外，其他侵染力比较强的真菌同样拥有这种利用小分子RNA的侵染机制。这一研究不仅发现了新的致病机理，而且很有可能打开了一个新的研究方向。第三节 灰霉病菌相关致病因子灰葡萄孢菌与其他植物病原菌都具有一些保守的毒力因子，但也存在一些特异性和多变性毒力因子。在环境因子（温度、pH）的影响下，灰葡萄孢菌分泌许多胞外酶，一些酶负责识别宿主植物，一些酶参与降解宿主植物的细胞壁，在多种酶的协同作用下完成感染宿主的过程。同时灰葡萄孢菌在代谢过程中产生的次级代谢产物具有毒素作用，引起宿主植物代谢紊乱。另外信号转导途径在灰葡萄孢菌生长发育和毒性发挥方面具有重要作用，通过调控致病相关基因的表达，促进病原菌在宿主植物上的生长和繁殖。1.3.1 致病毒素1.3.1.1倍半萜类毒素植物病原真菌毒素是病原真菌在与宿主植物相互识别、相互作用的过程中产生的次生代谢产物，在致病过程中起决定因子的作用。植物病原真菌毒素可依据对毒素敏感的植物种类和毒素对寄主种或品种有无选择性，划分为寄主特异性毒素(HST)和非寄主特异性毒素(NHST)【9】。HST是由病原菌产生的一类仅对其寄主植物具有特异性生理活性和特异性作用位点的毒素。灰葡萄孢菌产生的灰葡萄孢毒素是非寄主特异性毒素。灰葡萄孢毒素基本骨架为异戊二烯倍半萜（图1）。倍半萜烯葡萄孢素（sesquiterpen botrydial）在灰葡萄孢菌侵染宿主的过程中产生，能够诱导枯黄病和细胞裂解，为病原菌的穿透和定植提供有利条件【10】。1.3.1.2 草酸 草酸也是一类非寄主特异性毒素，许多真菌在侵染植物的过程中都产生草酸。灰葡萄孢菌在侵染过程中分泌草酸为在其不同环境中的生存提供条件。草酸通过调节pH调控致病相关的胞外酶和细胞外基质成分分泌，促进病原菌对寄主植物的侵染作用，以保证病原菌获得充足的养分。草酸还能抑制与植物抗病性相关的酶活性，有利于病原真菌的侵入【11】。草酸与寄主组织细胞壁中的钙结合形成的草酸钙晶体破坏了细胞壁。此外，草酸还通过自身毒性作用，杀伤植物组织。1.3.2 与致病相关的酶和基因1.3.2.1细胞壁降解酶灰葡萄孢菌产生的胞壁降解酶也是一种重要的致病因子。与其他植物病原真菌相似，灰葡萄孢菌感染宿主植物需要各种胞壁降解酶的协同，与致病相关的细胞壁降解酶主要有果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，在降解植物细胞壁的过程中，各种酶相互协同，加速宿主植物细胞壁的降解【12】。其中果胶甲基酯是灰葡萄孢菌重要的毒力因子之一，该酶基因失活导致灰葡萄孢菌在几种宿主植物上的致病性严重减弱【13】。1.3.2.2致病基因进化基因组学揭示了21种与致病相关的阳性选择基因。其中灰葡萄孢菌促分裂素蛋白激酶基因BcOS4与其营养生长和孢子形成有关，BcOS4基因缺失突变体表现出营养生长和孢子形成严重受损，对渗透压、氧化压力及杀菌剂敏感性增强【14】。此外Western印迹分析表明突变体中BcOs4基因下游组分BcSak1处于非磷酸化状态时，对油菜籽和黄瓜叶片及葡萄果实失去侵染性，因此磷酸化的BcSak1也是致病因子【15】。在致病过程中，各种致病基因的协同作用对毒性的发挥也是非常重要的。第四节 核酸酶简介核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于 DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此统称为核酸酶（nuclease）【16】。根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶（endonuclease）。 1.4.1 核酸外切酶 有些核酸酶能从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸，所以称为核酸外切酶。只作用于DNA的核酸外切酶称为脱氧核糖核酸外切酶，只作用于RNA的核酸外切酶称为核糖核酸外切酶；也有一些核酸外切酶可以作用于DNA或RNA。1.4.2 核酸内切酶 核酸内切酶催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。20世纪70年代，在细菌中陆续发现了一类核酸内切酶，能专一性地识别并水解双链DNA上的特异核苷酸顺序，称为限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）。当外源DNA侵入细菌后，限制性内切酶可将其水解切成片段，从而限制了外源DNA在细菌细胞内的表达，而细菌本身的DNA由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修饰，不被水解，从而得到保护【17】。 第五节 研究目的与意义 灰霉病菌具有多种感染模式和广泛的宿主范围，具有繁殖快、遗传变异大和适合度高等特点，故使用化学防治施加药剂易产生抗药性。目前,灰葡萄孢霉己对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、n-苯氨基甲酸酯类和苯胺基嘧啶类杀菌剂产生了不同程度的抗性【18】。 由于化学农药危害开始显露，人们开始寻找对环境没有危害的新型防治方法。20世纪开始，随着对生物科学研究的不断进行，尤其是对基因工程的研究，使得生物防治的概念不断进化，今天生物防治的定义为：利用自然或者经基因工程改造的生物来减少有害生物的作用【19】。生物防治在灰霉病防治上的研究越来越多也越来越细致。因此进一步对灰霉病菌继续进行分子生物学水平上的研究具有重大意义【20】。对灰葡萄孢菌致病相关基因、蛋白、毒素、环境因子、信号转导途径及与植物的相互作用等进行研究，尤其是近年对灰葡萄孢菌侵染不同时期基因的差异表达的研究，促进了对灰葡萄孢菌致病分子机理的认识，为灰霉病的有效防治提供科学依据【21】。 总之，在灰霉病菌的防治过程中，虽然有许多问题需要解决，但是前景仍是令人鼓舞的。相信随着分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、生物信息学等研究的不断发展【22】，我们终能够解开灰霉病菌侵染植株的机制，并对症下药找到最高效的防治方法。第二章 实验材料与方法第一节 材料及设备2.1.1 所用菌株 农杆菌菌株：AGL-1，大肠杆菌菌株：DH5，灰霉病菌野生型菌株：B05.102.1.2 所用载体pXEG:用于构建互补载体2.1.3 接种材料 成熟叶片、固体培养基2.1.4 实验试剂及药品限制性核酸内切酶、重组酶、引物、缓冲液、Taq DNA聚合酶、潮霉素、G418、质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒等。2.1.5 仪器与设备AIRTECH生物安全柜、AIRTHEC超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、PCR扩增仪、离心机、涡旋混合器、-80超低温冰箱、冰箱、27恒温振荡培养箱、37电热恒温培养箱、27摇床、37摇床、分子杂交炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、磁力搅拌器、微波炉、精准电子天平、pH计、移液器、真空抽滤泵、相机。第二节 相关引物2.2.1 互补引物C-S2-正向：5-GCTCGCAGATCTTCACTAGTTTGAGTGAGAATGGTGCTATG-3C-S2-反向：5-GAGCTCGAATTCCCACTAGTGGAAATCTGGAGGTGTTGTT-3S2菌落PCR引物（大肠杆菌）S2-S-F正向：5-ACTTTGGCTAAGCATGAGG-3S2-S-R反向：5-GTAACGCATCTGCTCCAT-32.2.2 农杆菌验证引物正向引物： 5-CTGGGCACAACAGACAATCG-3反向引物： 5-GCCTTGAGCCTGGCGAAC-3 第三节 培养基及配方2.3.1 PDA培养基马铃薯400g/2L葡萄糖40g/2L琼脂粉30-40g/2L注：液体培养基不添加琼脂粉2.3.2 LB培养基胰化蛋白胨20g/2L酵母提取物10g/2L氯化钠20g/2L琼脂粉30-40g/2L注：液体培养基不添加琼脂粉2.3.3 MM培养基硫酸铵1.00g/2L磷酸二氢钾4.10g/2L磷酸氢二钾2.90g/2L氯化钠0.30g/2L七水硫酸铁0.005g/2L六水氯化钙0.20g/2L七水硫酸镁1.00g/2L葡萄糖4.00g/2L注：葡萄糖另需过滤除菌后再加入至灭菌完毕的培养基中2.3.4 IM培养基100 mM AS（乙酰丁香酮）4m/2LMES17.08g/2L甘油10g/2L磷酸氢二钾4.10g/2L磷酸二氢钾2.90g/2L氯化钠0.30g/2L七水硫酸镁1.00g/2L六水氯化钙0.20g/2L七水硫酸铁0.005g/2L硫酸铵1.00g/2L葡萄糖4.00g/2L琼脂粉30g/2L注：液体培养基中不添加琼脂，葡萄糖经过滤除菌后再加入2.3.5 DCM培养基yeast nitrogen base without amino acids3.4g/2L天冬酰胺4g/2L硝酸铵2g/2L葡萄糖20g/2L琼脂40g/2L注：用磷酸氢钠溶液将其pH调至6.0第四章 实验流程及步骤2.4.1 提取质粒1） 取2ml菌液，离心后弃上清，将沉淀的菌体物收集于1.5mlEP管中；2） 加125ul裂解液，将EP管置于涡旋震荡器上充分震荡，使菌体全部处于悬浮状态；3） 配置裂解液II（0.2N NaOH+1%SDS），现配现用；4） 加125ul裂解液II，加入后轻柔翻转EP管10次，静至1min；5） 取出冰箱中保存的溶液III，加175ul至EP管中，翻转数次后出现白色沉淀，12500rpm离心10min；6） 另取1.5mlEP管收集上清液，向其中加入等体积氯仿/异戊醇，加完轻柔翻转EP管30次，混匀后12500rpm离心10min；7） 另取1.5mlEP管收集上请，向其中加入约两倍体积的无水乙醇（无水乙醇需事先在-20冰箱中冷却一段时间），加完轻柔翻转EP管，混匀后12500rpm离心10min；8） 弃上清，加0.5ml 70%乙醇，加完轻柔翻转EP管，混匀后12500rpm离心5min；9） 弃上清，将EP管置于无菌处吹30s使沉淀物干燥；10) 从冰箱中取含RNAase酶的双蒸水，于冰盒上融化后取200ul加入干燥后的沉淀中，降解其中的RNA，反应完毕后即可上样电泳或于-20处储存。2.4.2 PCR（多聚酶链式反应）2.4.2.1体系10Buffer10LdNTP4LDMSO4LDNA模板5L正向引物2L反向引物2L双蒸水补至100L2.4.2.2反应程序 96 （预变性） 3min 94（变性） 30s 50-60（复性） 30s 循环25-35次 72（延伸） 1min 72 8min 4 10min注：其中循环的延伸时间取决于PCR片段的大小(一般1kb为1min)。循环结束后的产物应置于冰箱4处储存。2.4.3 胶回收验证2.4.3.1凝胶电泳法回收DNA片段1） 切割含有目的片段的凝胶并在电子天平上称重，记录数据；2） 加入缓冲液（约四倍胶块重量）后在50水浴锅中水浴4-5min以溶解凝胶；3） 将溶解后的凝胶液用移液器吸取至吸附柱，12500rpm离心59s并弃上清；4） 添加500ul 洗液后继续12500rpm离心59s，弃上清；5） 重复四步骤一次；6） 空甩吸附柱60s；7） 空甩后放置在新的EP管中，在吸附膜中滴加20ul 的双蒸水到沉淀的DNA片段中，用移液器吸打几次使其充分溶解；8） 溶解完毕后静置EP管5min，离心；9） 离心后的产物于-20处储存备用。2.4.3.2乙醇沉淀法回收DNA片段1）酶切后即在65水浴锅中水浴15-20min,使体系中酶完全失活，并添加双蒸水将体系补至200ul；2）向体系中加入3M NaAc（pH=5.2）20ul和500ul的无水乙醇，翻转使其混匀；4）将EP管冰浴15-30 min后12500rpm离心8-10min，弃上清；6） 再向体系中加入70%酒精1.6ml；7） 12500rpm离心4-5min，舍弃上清液；8） 空甩60s，吸出残余液体后置于风口风干（注意不能太干，保持一定湿度）；9） 加入适量的双蒸水（10ul左右）将DNA片段溶解。2.4.4 酶切反应2.4.4.1体系10Buffer10L质粒或片段12LBSA10L(选加)限制性内切酶12L双蒸水补至100ul2.4.4.2反应步骤 将配置好的体系于37培养箱中静置反应2至3h，达到充分酶切的目的； 对酶切后的产物进行回收。注：为了使酶切效率达到最高，需要将体系放至于限制性内切酶能够发挥出最高活性的温度下（一般是37）进行酶切反应，同时还需选用最适合该反应的酶切缓冲液。反应完毕后需要对酶切后的产物进行回收，一般多采用凝胶电泳或乙醇沉淀这两种方法进行。2.4.5 重组连接反应2.4.5.1体系（冰水浴中配置）5重组Buffer20L插入片段扩增产物XL线性化克隆载体XL酶10L双蒸水补至100L注：X即最适使用量，其具体数值=0.02DNA片段碱基对数ng。为避免剧烈操作破坏体系，配置完成后的体系仅使用移液器枪头轻柔吸打混匀。混匀后的体系置于37水浴锅中水浴半小时，立即取出，冰浴冷却10-15min后取出，置于-20中储存将重组后的产物。2.4.5.2反应步骤1） 载体线性化酶切处理；2） 使用PCR扩增仪分别扩增插入片段及重组片段；3） 配置体系，调节最适反应条件进行重组连接；4） 储存重组连接产物。2.4.6电击法转化农杆菌1） 从冰箱中取出合适尺径的电击杯；2） 将-80冰箱中的电击感受态取出并放置于冰盒上，待其融化；3） 将3ul待转化的质粒及融化的感受态农杆菌转移至电击杯中；4） 调整电击设备参数，擦净电机杯上残留水珠，准备电击；5） 电击完成后取出电击杯，并立即向电击杯中添加适量培养基，使用移液器枪头多次吸打，将在电击杯底部沉淀重悬；6） 将电击杯中的混合液吸取至新的EP管中；7） 将EP管置于28振荡箱中振荡培养2-3h，复苏菌体；8） 将复苏完毕后，将菌液12500rpm离心60s；9） 在无菌环境中倒掉部分上清液，使用移液器枪头多次吸打使菌体重悬；10）筛选成功转化的菌株：将重悬菌液用平板涂布的方法涂布至含有抗生素的培养基上，培养箱中静置，培养至长出菌落。2.4.7 热击转化大肠杆菌1） 取出-80超低温冰箱中的感受态于冰盒中，使其融化；2） 取20ul的重组连接产物加入解冻过的感受态中，轻柔操作使其混匀，混匀后再将其放置在冰盒中半小时；3） 取出冰盒中的大肠杆菌，置于42水浴锅中热击转化90s；4） 热击后立即取出，于冰盒中冷却1-2min后加入1.4ml的LB液体培养基；5） 为使菌体充分复苏，把体系置于37恒温震荡培养箱中进行震荡培养；6） 取出复苏后的大肠杆菌悬液，离心60s，在无菌坏境中倒掉一半上层清液之后使菌体重悬；7） 将重悬后的菌液均匀涂布在选择培养基上，涂布后置于37培养箱中培养，挑取经选择后能够生长的菌落。2.4.8 提基因组DNA（电钻法）1） 从恒温培养箱中取出生长了4-5天的灰霉病菌培养平板，刮下菌丝并将刮下的菌丝小心转移置灭过菌的EP管中；2） 向含有菌丝的EP管中加入100ul CTAB提取缓冲液和石英砂，电钻研磨；3） 研磨1min左右待菌丝呈糊状后，再向管内加入300ul CTAB提取缓冲液；4） 水浴锅调至65，加入缓冲液后立即水浴，水浴1h；5） 水浴后的菌丝悬浮液在离心机中离心10min（12500rpm）,离心后收集上清液；6） 向上清液中加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），轻柔翻转EP管35次，使其混合均匀后再次离心，12500rpm，10min，收集上清；7） 重复上一步骤一次；8） 从-20冰箱中取出预冷的无水乙醇，取约两倍上清体积的剂量，加入上清中，轻柔翻转混合后，放入-20冰箱中静置1h；9） 取出静置冷却的EP管，放置在离心机上，离心机调至12500rpm，离心10min，并舍弃上清液；10） 从-20冰箱中取出预冷的70% 乙醇，向沉淀中加入500ul，再次离心，离心机调至12500rpm，离心5min并舍弃上清；11） 离心机调至125000rpm，空甩1min，取出后将EP管置于无菌处吹干；12） 从冰箱中取出含RNase的双蒸水，融化后向吹干的EP管中加200ul,吸打使其完全溶解；13） 将EP管放到37恒温培养箱中反应一段时间，使其中的RNase充分水解DNA中的RNA；14） 反应完毕后可立即上样跑胶，或于-20处存储备用。2.4.9 灰霉病菌分生孢子与农杆菌共培养得转化子2.4.9.1 灰霉病菌的活化和产孢活化：将B05.10菌株接种至PDA固体培养基，并于恒温培养箱中使其活化并生长。产孢：活化并生长了三至四天后的灰霉病菌产菌丝，用载玻片挑取其菌丝后接种到新的PDA固体选择培养基上，该PDA培养基另添加了链霉素和头孢霉素，接种后于25恒温培养箱中无光线培养一段时间，当可观察到其菌丝生长到培养皿边缘时即转移至20培养箱黑暗培养3-5d，即可产孢。2.4.9.2 农杆菌的活化从-80超低温冰箱中取出农杆菌菌株，用平板划线的方法将其接种于含有利福平、卡那霉素和氨苄霉素的LB固体培养基上，划线后于28恒温培养箱中培养2-3d，用移液器枪头将生长出的单菌落挑取出来，将挑取的菌落连同枪头一并打入含有MM液体培养基的EP管中，震荡培养3d，即完成AGL-1菌株的活化。2.4.9.3 共培养前对农杆菌的诱导1） 取2ml活化培养后的AGL-1菌株悬液，转移至离心管中，4000rpm离心4min；2） 舍弃上清并加入4ml IM液体培养基，使用旋涡混合器，震荡使菌株重悬；3） 重悬后菌液再次以相同转速及时间离心；4） 加入1ml IM液体培养基，并使用旋涡混合器，震荡再次使菌株重悬；5） 向重悬菌液中加入1ul100ug/ml 的乙酰丁香酮，上下颠倒10次混合；6） 28恒温震荡培养箱中培养过夜，即完成对AGL-1菌株的诱导。2.4.9.4 共培养1) 待灰霉病菌产分生孢子后，将其刮取其并转移至新鲜培养基中，过滤除菌丝；2) 在显微镜中计数并稀释菌液，使分生孢子达到一个较适宜的浓度；3) 将诱导后的AGL-1菌株与分生孢子按1:1比例加入到一个全新的EP管中，上下颠倒混合，准备共培养；4) 取混合均匀的EP管中液体100ul，使用平板涂布的方法将该混合液涂布于贴有微孔玻璃膜的IM平板上，涂布后于28处静置培养两天；5) 两天后取出IM平板并除去微孔玻璃膜，将粘有混合菌体的玻璃膜转移至含有潮霉素、头孢霉素以及链霉素的PDA固体培养基上，转移完毕后继续放置于28处静置培养两天，注意使培养箱处于黑暗状态下；6) 两天后拿去玻璃膜，继续放回无光线处使混合菌生长至长出。2.4.10 筛选转化子为了将灰霉病菌回补突变体筛选出来，需要将突变体的分生孢子和转入了互补载体的农杆菌共培养，共培养后进行两至三轮筛选，具体是在含有200ug/ml 草铵膦的DCM培养基上进行。将共培养的产物涂布在DCM培养基上，挑选出能够生长的回补突变体，再次接种并挑取可生长的菌落，完成筛选。第三章 实验结果与分析第一节 构建cBcSPN2载体3.1.1 获得基因：cBcSPN2（目的片段：3310bp）3.1.1.1 PCR扩增后产物电泳验证设计引物：C-S2-正向：5-GCTCGCAGATCTTCACTAGTTTGAGTGAGAATGGTGCTATG-3C-S2-反向：5-GAGCTCGAATTCCCACTAGTGGAAATCTGGAGGTGTTGTT-3琼脂糖凝胶电泳： 制备凝胶后冷却至65左右倒胶，选取合适梳子，待胶体凝固后拔出梳子，放入水平电泳槽内，准备点样。向PCR小管中按DNA样品与加样缓冲液4：1的比例，加入缓冲液，混合均匀，取适量加样于点样孔中，同时点1kbDNA Marker标准样品。打开电泳仪，设置时间、电压。结束后取出胶块放入EB溶液中染色20min，注意不要裸手操作，EB具有一定致癌性。染色结束在紫外灯下观察。荧光条带即为DNA条带。（图1-1） 4344bp 3000bp 目的片段 （3310bp）图1-13.1.1.2 胶回收目的片段按照试剂盒说明书操作，回收后吸取适量进行电泳，验证回收结果。3.1.2 pXEG载体线性化 3.1.2.1酶切载体 使用上文中的酶切反应体系，冰上配置，在酶切反应体系中，buffer要根据所用限制性内切酶查找说明选择最合适的buffer。于在37保温箱中，反应2至3小时。3.1.2.2 乙醇回收酶切产物 酶切反应结束后，于65水浴处理20min，使内切酶完全失活。回收的DNA产物溶于适量双蒸水中，电泳验证，保存待用。（图1-2） 空载体 10549bp 8300bp CK M CK M 图1-23.1.3 重组转化 步骤在前文中有详细介绍。 注意事项：冰上操作，热击冷击时间需准确。复苏后在生物安全柜中涂布平板，玻璃棒需喷酒精高温灭菌后冷却，避免高温杀死菌体。涂好的平板在37培养箱中倒置培养。3.1.4 菌落PCR验证转化平板隔夜培养后，进行菌落PCR验证。设计引物： 正向引物：5-ACTTTGGCTAAGCATGAGG-356bp 反向引物：5-GTAACGCATCTGCTCCAT-354bp 于无菌操作台内，用灭菌后牙签挑取长出的单菌落，在PCR小管中轻沾。并保存，标号记录。PCR后产物进行电泳，根据电泳结果，确定转化是否成功。若出现目标条带，则转化成功，若无目标条带，则转化不成功。（图1-3） 1 2 CK M 750bp 500bp 632bp图1-33.1.5 摇菌扩增并酶切验证选取电泳条带正确的菌落，挑取菌落摇菌，在LB液体培养基上（添加G418），于37，220rpm摇菌16h。所得质粒酶切验证，用Spe酶切（图1-4），将得到2810bp、499bp、大片段三种长度的片段。 CK M大片段2810bp499bp图1-43.1.6 测序 酶切产物回收，测序。（如图1-5）图1-5第二节 获得cBcSPN2菌株3.2.1 载体转入农杆菌通过电击转化法，将回补载体转入农杆菌AGL-1感受态细胞中，复苏后的菌液离心，在超净工作台中倒掉部分上清液，保留约200L，用手弹EP管，使沉淀菌体重新悬浮起来，均匀涂布于含G418的LB培养基上。置于28培养箱中，倒置培养。注意涂布平板时，玻璃棒于酒精灯上着稍后，冷却一段时间，避免过烫杀死菌株。3.2.2 菌落PCR验证 设计引物： 正向引物：5-CTGGGCACAACAGACAATCG-3 反向引物： 5-GCCTTGAGCCTGGCGAAC-3 M采用2.1.5菌落PCR体系即可。PCR产物进行电泳，于紫外灯下观察荧光条（图2-1） 750bp 500bp 100bp图2-13.2.3 共培养得转化子 准备工作：敲除突变体菌株cBcSPN2，MM液体培养基，PDA培养基，IM培养基（液体培养基、铺有玻璃纸的固体培养基平板），DCM培养基（含G418）。 取农杆菌进行诱导。获得敲除突变体菌株的分生孢子，定量后二者按照1：1比例混合，共培养。转膜后，挑取单菌落,获得转化子。(图2-2) 基因内部801bpG418 628BP 1 2 M图2-2图2-2第三节 筛选及表型鉴定3.3.1 观察致病叶片表型分别取野生型灰霉病菌WT、敲除突变体Bcatm2、互补突变体C-Bcatm2，在相同且适宜的条件下使其产孢，三天后分别将三种分生孢子取出并用培养基洗去菌丝，稀释孢子至一定浓度后，分别将其接种至发育程度相似的叶片上，叶片在接种盆中培养，将接种盆密闭后置于20环境中避光培养，1-3d后取出拍照记录其感染状态。实验结果表明：野生型菌株WT可以迅速侵染叶片，病斑扩散较大；Bcatm2敲除突变体几乎丧失侵染叶片的能力；而互补突变体C-Bcatm2的重新获得了侵染力。（图3-1）图3-13.3.2侵染垫结构观察与比较将野生型灰霉病菌WT、敲除后的突变体Bcatm2、互补突变体C-Bcatm2分别接种于PDA固体培养基上，在28恒温培养箱中让其生长一段时间，直至菌丝漫步至培养基的边缘。分别挑取出三种菌丝，用移液器将其打成圆形并接种于载玻片上，载玻片放置在接种盆里，一个片上接种两个圆形菌丝，接种后封闭接种盆，在20环境中保存，注意不能有光线，一天后揭开在显微镜下观察侵染垫结构。（如图3-2）图3-2图中显示，回补后的突变体重新形成了侵染垫的能力。第五章 结论与讨论本实验通过构建对灰霉病菌s2p2核酸酶的互补载体，并利用农杆菌介导的遗传转化的方式共培养将该基因导入其相应突变体，最后对互补突变体的表型进行分析鉴定。实验最后的结果显示，野生型菌株WT拥有其正常的致病力，而丢失了BcSPN2基因的Bcatm1突变体明显丧失其侵染力，而回补后的突变体C-Bcatm2则恢复了其侵染致病的能力，因此，BcSPN2基因是灰霉病菌致病的一个不可或缺的基因片段。以上实验初步为防治灰霉病菌感染植物造成病害提供了一些新的思路，后续仍旧需要一系列实验继续探索验证。致谢时光飞逝，转眼间四年紧张而又充实的大学生生活即将画上句号。在这四年的学习期间，我得到了很多老师、同学和朋友的关怀和帮助。在学位论文即将完成之际，我要向所有期间给予我支持、帮助和鼓励的人表示我最诚挚的谢意。 首先，我要感谢我的指导老师李桂华老师对我的指导。从论文的选题、构思、撰写到最终的定稿，李老师都给了我悉心的指导和热情的帮助，使我的毕业论文能够顺利的完成。李老师对工作的认真负责、对学术的钻研精神和严谨的学风，都是值得我终生学习的。 其次，我要感谢植物科学学院610实验室的师兄师姐和同学们，和他们一起度过的四年的实验室时光很有意义，在这里他们让我学到了许多实验室的知识，掌握了扎实的专业技能。 最后，感谢所有陪我一路走来的同学和朋友，有了他们的支持和陪伴，我才能在这里安心学习，顺利完成学业。 毕业在即，在今后的工作和生活中，我会铭记师长们的教诲，继续不懈努力和追求，来报答所有支持和帮助过我的人!参考文献及来源1 张彩凤；李喜燕；李明. 灰霉病的研究现状与发展趋势, 生命科学仪器.2013(06)2 曹剑波； 张静； 张蕾； 陈千思； 秦利鸿； 李国庆. 灰霉病菌侵染垫侵染油菜叶片的超微结构观察. 华中农业大学学报 , Journal of Huazhong Agricultural University, 2013(06) 3 金城. 灰葡萄孢产孢新基因的功能分析J. 微生物学通报. 2013(03)4 吴瑶；张世宏. 灰霉病菌Atg9基因的功能研究.吉林大学， 植物病理学， 2015， 硕士5 曹剑；,张静；张蕾；陈千思；秦利鸿；李国庆. 灰霉病菌侵染垫生长在不同介质表面上的超微结构J. 湖北农业科学. 2014(04)6 张为宏；朱廷恒；汪琨；崔志峰. 一株灰葡萄孢细胞壁完整性缺陷突变株的分子鉴定和表型分析J. 浙江农业学报. 2012(04)7 王璇；邢继红；赵斌；韩建民；董金皋. 灰葡萄孢分生孢子产生相关基因的克隆及功能分析J. 微生物学通报. 2013(03)8 高苇；王勇；张春祥. 番茄灰霉病拮抗细菌的筛选与鉴定，中国植保导刊,China Plant Protection