水稻脆性突变体的鉴定和水稻早代稳定的遗传分析硕士论文.pdf

1 植物脆性突变体 植物机械强度 植物的骨骼 作为 在着内在的联系 有重要意义 的鉴定 中文摘要 是十分重要的农艺性状之一 直接影响到作物的抗倒性 细胞壁是 细胞壁主要成分的纤维素 半纤维素和木质素与植物的机械强度存 脆性相关基因的研究对阐明植物体内木质素与纤维素的生物合成具 迄今 国内外对植物脆性进行了大量研究 已发现近十个脆性基因 水稻中已经 发现6 个脆性基因 5 个隐性基因 j 个显性基因 并且都已通过细胞学与经典遗传 学的方法确定了连锁群 我们从籼稻品种e5 3 2 化学处理的m 3 群体中发现脆性突变体 e 5 3 2 b c e 5 3 2 b c 与籼稻和粳稻品种杂交 f l 和f 2 代茎秆强度遗传分析表明 e 5 3 2 b c 性状受两对隐性基因的叠加控制 将e 5 3 2 b c 突变基因与水稻脆性基因b c t 进行等位性 分析 结果表明e 5 3 2 b c 突变基因与b c l 基因不等位 进而 以e 5 3 2 b c 0 2 4 2 8 f 2 代作为 定位群体 利用分子标记技术将e 5 3 2 b c 突变基因定位在水稻第1 和第7 染色体长臂 一个位于微卫星标记r m 2 1 2 和r m 3 0 2 之间 距r m 2 1 2 为1 1 8 9 c m 距r m 3 0 2 为 1 5 1 t l c m 另 个位于r m 1 1 和r m 2 3 4 之间 距r m l l 为9 3 6 e m 距r m 2 3 4 为1 0 0 1 c m i 同时 用化学和细胞学的方法对突变植株的生理缺陷进行了分析 结果表明e 5 3 2 f r a 突变基因可使植株纤维素含量降低 茎秆强度降低 细胞壁和维管束发生异常 认为 突变基因是新的基因 暂命名为b c 7 和b c 8 2 水稻早代稳定的遗传分析 水稻从常规育种到杂交育种的转变 提高了水稻的产量和质量 但是杂交育种需 要年年制种 浪费人力物力 水稻早世代稳定现象是在水稻杂交育种中发现的特殊现 缘 水稻早世代稳定可以早世代固定基因型 培育成可以多代利用的新型杂交稻 对 杂交育种有重要意义 4 2 9 9 5 0 均为来源于三倍体材料s a r 一3 的早世代稳定二倍体水稻 本试验对4 2 9 为母本的4 2 9 9 3 1 1 4 2 9 r 5 2 7 4 2 9 9 5 0 杂交组合中出现的f 2 稳定群体从农艺性 状和微卫星标记两个方面进行分析 主要结果如下 i 在7 项农艺性状的调查结果中 除有效穗的变异系数达到显著水平外 其它 6 项指标生育期 株高 穗长 4 2 9 9 5 0 杂交组合的群体除外 剑叶长 剑叶宽 干 粒重的变异系数都小于对照4 2 9 或者与之相当 因此初步判断认为它们是稳定群体 2 s s r 分析结果表明 这些稳定群体均为真杂种 在同一引物上它们的f 2 代只 表现出一个亲本的带型 没有发现父蹲本带型同时存在的情况 因此它们是早世代稳 定群体 另外 对f 1 代和f 2 代的微卫星分析结果表明 该稳定现象在f l 代就已经纯 合 并且这种早世代稳定特性可以通过杂交进行遗传 3 对同一杂交组合不同稳定群体的比较分析表明 来自同一杂交组合的稳定群 体并不是完全一致的 它们之间在许多位点上存在差异 可能是杂种细胞中发生染色 体重组造成的偏父或偏母的倾向不同 关键词水稻脆性基因遗传分析 基因定位早代稳定遗传因子 农艺性状微卫星 a b s t r a c t 1 i d i f i c a t i o no far i c eb r i t t l em u t a n t p l a n tm e c h a n i c a ls t r e n g t hi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta g r o n o m i ct r a i t si nr i c e w h i c h a f f e c tt h el o d g ec h a r a c t e r c e l lw a l li st h eb o n eo fp l a n tc o m p o s e do fc e l l u l o s ea n d h e m i c e l l u l o s ea n dl i g n i n w h i c hi sr e l a t e dt op l a n tc h e m i c a ls t r e n g t h t h eb c b r i t t l ec u l m g e n e sp l a y a ni m p o r t a n tr o l ei ne l u c i d a t i n gt h es y n t h e s i sp a t h w a yo fc e l l u l o s ea n dl i g n i n t od a t e a g r e a to f s t u d i e sh a v eb e e nm a d eo nt h eb r i t t l ec u l mt r a i to fp l a n t a n da b o u t t e nb r i t t l ec u l mg e n e sh a v eb e e nr e p o r t e d a m o n go fw h i c h 5 r e c e s s i v e g e n e sa n d 1 d o m i n a n tg e n eh a v eb e e nr e p o r t e di nr i c e a n da l lo f t h e mw e r ee s t a b l i s h e do nd i f f e r e n t l i n k a g eg r o u p sb yc y t o l o g i c a la n d c l a s s i c a lg e n e t i c s ab r i t t l em u t a n t e 5 3 2 b c w a so b t a i n e d f r o mt h ec h e m i c a lt r e a t m e n tp o p u l a t i o no fe 5 3 2 e 5 3 2 b cw a sc r o s s e dw i t hj a p a n i c aa n d i n d i c ar i c e t h ea n a l y s i so f p l a n tm e c h a n i c a ls t r e n g t hi nf i a n df 2p o p u l a t i o n ss h o w e dt h a t t h eb r i t t l et r a i to fe 5 3 2 b cw a sc o n t r o l l e db yt w or e c e s s i v eg e n e s t h ea l l e l i ca n a l y s i s b e t w e e nm u t a n tg e n e sa n db c lg e n ei n d i c a t e st h a tt h e yw e r en o n a l l e l i e t h el o c a ll i n k a g e m a p o ft h em u t a n tg e n e sw e r ec o n s t r u c t e dw i t hf 2p o p u l a t i o no f e 5 3 2 h cc r o s s e dw i t h0 2 4 2 8 a n dm o l e c u l a rm a r k e rt e c h n i q u e t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h eb r i t t l eg e n e sw e r el o c a t e do n t h el o n ga r mo fr i c ec h r o m o s o m e1a n d7 o n eg e n el o c a t e do nt h es i d eo ft h em i c r o s a t e l l i t e m a r k e r sr m 2 1 2a n dr m 3 0 2 a n dt h eg e n e t i cd i s t a n c e sf r o mt a r g e tg e n et ot h em a r k e r s r m 2 1 2a n dr m 3 0 2 a r e1 1 8 9 c ma n d1 5 埠c mr e s p e c t i v e l y t h eo t h e rg e n el o c a t e do nt h e i n t e r v a lo f r m l1a n dr m 2 3 4 a n dt h eg e n e t i cd i s t a n c ef r o mt h et a r g e tg e n e sa r e9 3 6 c ma n d 1 0 0 1 c m r e s p e c t i v e l y a tt h es a m et i m e t h er e l a t i v eb l e m i s h o f t h em u t a n tw e r ea n a l y z e db y u s i n gc h e m i c a la n dc y t o l o g ym e t h o d s t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h em u t a n tg e n e sc o u l d r e d u c et h ec o n t e n to f c e l l u l o s e a n dl o w e rt h es t r e n g t ho f p l a n t t h e s eg e n e s p r o b a b l yb e i n g n e wb r i t t l eg e n e si nr i c e a n dd e s i g n a t e dt e n t a t i v e l ya sb c 一7a n db c 一8 2 i n h e r i t a n c eo fa ne a r l yf i x a t i o ni nr i c e f r o mc o n v e n t i o n a lb r e e d i n gt oh y b r i db r e e d i n g t h er i c ep r o d u c t i o na n dq u a l i t yh a v e i m p r o v e dg r e a t l y b u th y b r i d r i c en e e d sp r o d u c t i o no fs e e d se v e r yy e a r w h i c hw a s t e s m a t e r i a la n dm a n p o w e r t h ee a r l y g e n e r a t i o ns t a b i l i t y f o u n di nr i c ew a sa ne x c e p t i v e p h e n o m e n o nf o u n df r o mr i c eh y b r i db r e e d i n g w h i c hc o u l df i xe a r l yg e n o t y p ea n db eu s e d f o rm a n y y e a r s a san e wi n b r e dl i n e a n dw a s i m p o r t a n t f o r h y b r i db r e e d i n g 4 2 9a n d9 5 0w e r eb o t ht h ee a r l yf i x a t i o nr i c ea n dc a m ef r o ms a r 3w h i c hi sa t r i p l o i d t h i ss t u d yf o c u so nf 2p o p u l a t i o n sd e r i v e df r o m4 2 9 9 311 4 2 9xr 5 2 7a n d4 2 9x9 5 0 i t w a sp r o v e dt h a t4 p o p u l a t i o n sw e r eu n i f o r mb yu s i n ga n a l y s i so fa g r o n o m i cc h a r a c t e r sa n d s s rm a r k e r s t h em a i nr e s u l t sa sf o l l o w s 1 i n v e s t i g a t i o n o n a g r o n o m i c t r a i t ss h o w e d t h a t t h ec o e f f i c i e n to f v a r i a t i o n c v o ft h e6a g r o n o m i cc h a r a c t e r s i n c l u d i n gh e a d i n gd a y s p l a n th e i g h t s 1 e n g t ho f p a n i c l e s 10 0 0 一g r a i nw e i g h t s l e n g t ho fs w o r d s h a r p e dl e a fa n dw i d t ho fs w o r d s h a r p e dl e a fw e r e s m a l l e rt h a no rn e a rt ot h a to fc o n t r o lv a r i e t y4 2 9 w h i l et h en u m b e ro f p r o d u c t i v ep a n i c l e w a sn o t s ot h e s ef 2w e r ea i le a r l ys t a b l ep o p u l a t i o n si na g r o n o m i cc h a r a c t e r s 2 s s ra n a l y s i sr e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h e s ep o p u l a t i o nw e r ea l lp r o g e n yc o m i n gf r o m t w op a r e n t s a n dt h ef 2p l a n t sp r e s e n to n eo ft h ep a r e n t sb a n d s n o tt h eh e t e r o z y g o u sb a n d s a ta 1 1o fl o c i s ot h e yw e r ea l l e a r l ys t a b i l i t yp o p u l a t i o n s t h eu n i f o r mp h e n o m e n o ni s h o m o z y g o u s i nf lp l a n t s a n di tw a sh e r i t a b l ef r o m p a r e n t s 3 a n a l y s i st h ed i f f e r e n ts t a b l ep o p u l a t i o n sc o m e f r o mo n eh y b r i d i z e dc o m b i n a t i o n w ef o u n dt h a tt h e yw e r en o tc o m p l e t e l yi d e n t i c a l b u tt h e yh a dv a r i a h c e sa tm a n yl o c i t h i s m a yb ec a u s e db yt h ec h r o m o s o m a lr e c o m b i n a t i o ni nh y b r i d w h i c hl e dt o d i f f e r e n c e a p p e a r a n c e sa m o n g o f t h e m k e y w o r d s r i c e o r y z as a t i v al b r i t t l ec u l m g e n e g e n e t i c a n a l y s i s g e n e m a p p i n ge a r l yg e n e r a t i o ns t a b l i t y g e n e t i cf a c t o r sm i c r o s a t e l l i t e 引言 第一部分水稻脆性突变体的鉴定 一 文献综述 植物细胞壁是一种强大的纤维结构 主要由纤维素 半纤维素 木质素 果胶和 蛋白质等成分组成 细胞壁可以分为初生壁 次生壁 初生壁是在细胞生长时形成的 一层较薄的能随细胞生长而扩张的细胞壁 而次生壁是细胞停止生长后在初生壁和质 膜之间形成的由木质素或其它次生代谢物沉积形成的具有多层结构的细胞壁 为了理解植物体机械强度与植物细胞壁组分之间的关系 分离了多种茎秆强度缺 陷突变体 如大麦脆杆 b c 突变体纤维素含量是其野生型的8 0 其断裂强度是其野 生型的2 倍 k o k u b 1 9 8 9 1 9 9 1 这表明纤维素含量与植物体机械强度有关 拟南 芥中的茎秆强度降低突变体也证明了二者的关系 其相关基因也已被克隆 拟南芥不 规则木质部突变体 i r x l i r x 3 的次生壁纤维素减少 成熟茎秆坚固性下降 t u r n u r a n ds o m e r v i l l e 1 9 9 7 i r x i 和i r x 3 基因编码纤维素合成酶同型异构体 鲥7 和c e s a 8 的催化亚基 c e s a 7 和c e s a 8 是细胞壁中纤维素合成所必需的 i r x 4 突变是 c i n n a m o y l c o a 还原酶缺陷 它能导致次生壁木质素含量下降和植物体丧失垂直生长的 习性 j o n e s 2 0 0 1 另外 州7 船雕s c i 洲l a 月f 皿e 甩船s j 基因调控拟南芥维管束内 纤维素的分化和茎秆强度 该基因是h o m e o d o m a i n l e uz i p p e r 家族的一个成员 z h o n g a n dy e 1 9 9 9 r a t c l i f f e 2 0 0 1 f r a g i l ef i b e r l f r a l 是一种驱动蛋白类蛋白 与细胞壁强度和纤维素微纤丝沉积物定位有关 z h o n g 2 0 0 2 f r a 2 编码调控纤维细 胞强度和细胞壁厚度的剑蛋白类蛋白 b u r k 2 0 0 2 2 0 0 2 这些研究表明 参与细胞 壁尤其次生壁生物合成或修正的基因是植物机械强度所必需的 决定植物机械强度的 分子机制是复杂的 作为细胞壁主要成分的纤维素 它在高等植物中的合成机制仍然知之甚少 高等植 物中纤维素的合成需要一个很大的蛋白质复合体一玫瑰花状结构 这种复合体的主要 蛋白质就是纤维素合成酶催化亚基c e s a 其它的成分现在仍然未知 1 植物纤维素合成酶基因的研究进展 自2 0 世纪5 0 年代以来 人们从不同角度致力于研究体外高效合成纤维素的新途径 从革兰氏阴性菌一醋酸杆菌中发现了纤维素合成酶的激活因子一c y c l i cd i g u a n y l i c a c i d 进而导致纯化纤维素合成酶 克隆编码催化亚基的基因 调控纤维素微丝的分 泌和结晶作用 1 9 9 6 年 d e l m e r 小组从植物中克隆出第一一个纤维素合成酶基因 表明 高等植物中存在编码纤维素合成酶的基因 即纤维素合成酶催化亚基 c e l l u l o s e s y n t h a s es u b u n i t s 的基因 p e a r k a w a g o e 1 9 9 6 人们从利用细菌体外合成纤 维素到研究纤维素的结构 从研究纤维素合成酶在纤维素合成中的作用 发展到如今 重点研究植物纤维素生物合成中的基因调控 基因功能 d e l m e r 1 9 9 6 1 1 植物纤维素合成酶基因的研究历史 1 1 1 体外合成纤维素的研究 2 0 世纪5 0 年代 l e l o i r 等首次发现u d p 葡萄糖 证明大分子物质能作为糖醛转移 酶的受体 g l a e e r 确定了由醋酸杆菌 a c e t o b a c t e rx y l i n u m 制备的膜能合成b i 4 一葡聚糖 并进一步证明这个特征在农杆菌和高等植物中都存在 以色歹u h e s t r i n d 组 以醋酸杆菌为模式研究纤维素体外合成的先驱 很多菌类都能合成纤维素 例如 革 兰氏阴性菌 醋酸杆菌属 农杆菌属 根瘤菌属 革兰氏阳性菌一八叠球菌都能 合成纤维素 其中 醋酸杆菌属产生的纤维素量较大 而且是以分泌形式产生的 该 小组建立了醋酸杆菌生产纤维素的最佳模式 发现了纤维素合成酶的激活因子 c y c l i cd i g u a n y l i ca c i d 提出了一条体外高效合成纤维素的新途径 进而导致纤维 素合成酶基因的克隆 d e l m e r 1 9 8 7 1 1 2 纤维素合成酶基因命名规则 1 9 8 2 年 b e n z i m a n 等人体外合成纤维素 该产物与醋酸杆菌菌体内形成的相近 a l o n i d e l m e r i 9 8 2 1 9 9 0 年 b r o w n 实验室从醋酸车下菌中分离出 个编码催化 亚基的基因a e s a s a x e n a l i n 1 9 9 0 1 9 9 0 年 w o n g 等人用上述醋酸杆菌的纤维素 缺陷突变体的遗传互补的方法分离了4 个操纵子 b c s a d 基因 突变菌株的分析表明 该基因a c 对纤维素合成是必需的 b c s a 基因与a c s a 基因高度同源 也能编码催化亚 基 w o n g f e a r c a h o o n 1 9 9 0 当时关于这些基因的命名都很混乱 d e l m e r g 定了 命名规则 例如 a x 代表a c e t o s a c t e rx y l i n u m 或g h 代表g o s s y p i u mh f s u t u m 如果基 因后面有一个 a 表明它编码细菌催化亚基的同源体 因此 对醋酸杆菌来说 先前 命名的b c s a 或a c s a 将改为a x c e s a 来自棉花的为g h c e s a b 基因或a x c e s g 基因 操 纵子中第二个基因 表明它是编码一一个能结合cd g m p 的调控亚基 d e t m e r 1 9 9 0 c 基因或a x c e sc 基因 操纵子中第三个基因 s a x e n a 等认为它编码一个革兰氏阴 性菌气孔形成蛋白 纤维素在其中分泌 而植物中该蛋白不 定存在 s a x e n a k u d l i c k a 1 9 9 4 d 基因或a x c e s d 基冈 操纵子中第四个基因 该基因在纤维素合 成中起重要作用 在植物中与该基因同源序列尚未发现 植物纤维素合成酶基因基本 遵循这个命名规则 1 2 纤维素合成酶基因家族 1 2 1 纤维素合成酶基因家族结构 1 9 9 6 年 d e l m e r d 组首先克隆出植物纤维素合酶基因 w i l l i a m s o n d 组运用拟南 芥突变体r s w l 对该基因进行鉴定 纤维素合成酶基因编码纤维素合酶的催化亚基 纤 维索合成酶基因的大小为3 5 k b 到5 5 k b 有9 1 3 个小内含子 它们转录的范围从 3 o k b 3 5 k b 它们的内含子一外显子的边界区域高度保守 基因间结构的差异主要在 于内含子的多少 植物c e s a 家族的成员在9 8 5 1 0 8 8 氨基酸 序列同源性从5 3 9 8 在 c e s a 基因家族中有4 0 多个基因 图1 列出拟南芥c e s a 基因家族和水稻c e s h 7 基因的基因 结构 幽1h t c e s m e 表拟南芥c e s a 基阗家族 o sc e s a 7 代表水稻c e s a 7 基因的基因结构 根据序列相似性 蛋白质保守域及整个基因结构判断 图2 在拟南芥中有6 个基 因家族与c e s a 有关 命名为c e l l u l o s es y n t h a s e l i k e c s l 这些c s t 基因家族的功 能未知 可能它们中的一个或更多个也是纤维素合成途径中的一部分 n l c o s a in o n p l a n l c e c 8 撼 c 鲥e c 荫 c 纠棚哦 c 雌a 图2 植物c e s a 总科与相关的非植物蛋白质的系统进化树 p t 代表白杨 p o p u l h s 锄a o j 幽s z 田 代表玉米 z e am a y s n 代表拟南芥 a r a b i d o p s i s g h 代表棉花 c o t t o n o s 代表水稻 r i c e m t 代表占蓿 m e d i c a g ot r u n c a t u l a l e 代表马铃薯 l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m 1 2 2 纤维素合成酶基因特有的结构特性 尽管各种植物来源的c e s a 基因在序列上有些差异 所有的纤维素合成酶基因都有 保守的结构特征 c e s a 作为一种蛋白质复合体起作用 这种复合体为玫瑰花状 在显 微镜下观察到这种玫瑰花状结构位于质膜表面 含有一个6 边形的催化亚基 每个亚基 大约9 r i m 大小 在c e s a 蛋白质的氨基端是一个与锌指或l i m 转录因子相似的氨基酸域 氨基酸域可能在c e s a 复合体内蛋白质结合结构域内起作用 在氨基酸域内有一个保守 的序列基序 c x x c 基序 蛋白质氨基酸末端是一个约为1 5 0 个氨基酸的 超变区 这个区域比想象中的保 守 富含酸性氨基酸 这个区域对于酶的功能仍然未知 紧接氨基端的是两个假定跨膜结构域 图3 蛋白质碳端约8 5 0 氨基酸含有6 个假 4 定的跨膜域 对t m d s 2 和3 之 自j 的大域结构预测该蛋白有两个底物结合位点 s a x e n a 2 0 0 t 有的观点认为只有一个位点 c h a r n o c k 2 0 0 1 跨膜域大约由5 5 0 个氨基酸组 成的球状域或可溶域 它们形成一个能够延伸到细胞质的环 在球状域或可溶域内是 几个特定的保守区 一个第二变区 该变区大约从6 5 0 图位开始 长约为5 0 个残基 在 球状域内是几个指示加工糖苷转移酶的基序 第一个基j 芋d o m a i na 含有几个空间广泛 的天冬氨酸残基 一个d 及其后面的d x d 这些残基在加工酶和非加工酶中都存在 被 认为形成u d p 一葡萄糖底物 加工酶催化许多葡萄糖残基形成葡聚糖链 非加工酶只催 化单个糖残基为受体分子 第二个基序d o m a i nb 只在加工酶中存在 含有第3 个保守的 天冬氨酸残基 3 个保守的氨基酸 和一个催化位点的部分结构o x x r w 这些区域在所 有细菌c e s a 基因中也都是保守的 p e a rj k a w a g o e s c h r e c h e n g o s t 1 9 9 6 最近结 晶学证据支持了这三个d 残基模型 这三个d 残基是由二价离子连接 c h a m o c k d a v i e s 1 9 9 9 在植物纤维素合成酶蛋白质中发现围绕这些基序有许多保守的残基 植物c e s a 基因与c s 家族成员尤其是c s l d 家族不同 它们之间最显著的区别在 第一个假定的跨膜域前2 5 0 个氨基酸残基 c e s a 蛋白质含有c x x c 基序 而c s l 家族成 员不存在该基序 图3植物纤维素合成酶蛋向质的独特特征 1 3 植物纤维素合成酶c e s a 的功能 运用免疫细胞化学方法发现 纤维素合成酶定位在质膜上 d e l m e r 1 9 9 9 运 用棉花c e s a 蛋白中心区域的多克隆抗体标记 k i m u r a 1 9 9 9 证明质膜上具有玫瑰花 状结构 浚结构为植物纤维素合成酶复合体 纤维素是在质膜上 玫瑰形 结构上合 成的 b r o w n 1 9 9 6 该结构的发现证明t c e s a 基因在纤维素合成中的重要作用 k 1 m u r a l a o s i n c h a i i t o h 1 9 9 9 纤维素是所有高等植物细胞壁的主要成分 c e s a 蛋白在植物所有的组织和不同类 型的细胞中都能表达 但是这个基因家族中的不同成员在初生壁到次生壁形成中的表 达是有差异的 例如 a t c e s a l 蛋白在植物初生壁形成的全部过程中都表达 而 a t c e s a 一7 蛋白仅在茎的次生壁形成时表达 a t c e s a 一7 突变体导致木质部导管塌陷和花 序 茎秆的纤维素含量降低 t a y l o r s c h e j b l e c u l t e r 1 9 9 9 c e s a 蛋白的氨基 端带锌指区域通过蛋白质配对或特异降解来行使c e s a 功能 f r e m o n t 2 0 0 0 纤维素 合成酶的主要功能是产生纤维素多聚体一b 1 4 一葡聚糖链 大小在2 0 0 0 2 5 0 0 0 葡 聚糖残基 纤维素是植物原纤丝的基础 由3 6 个葡萄糖链组成 有的藻类能产生1 2 0 0 葡 聚糖链组成的大纤丝 t o d dr i c h m o n d 2 0 0 0 1 3 1c e s a 蛋白在初级细胞壁中的表达 当初级壁细胞扩张和细胞分裂发生变化时 细胞的形状 生长及形态发生都发生 变化 初级壁纤维素合成的减少与细胞的延伸性降低有关 在突变体中细胞延伸与茉 莉酮盐和乙烯产物的增加有关 1 3 1 1 初级壁中的c e s l 基因 a t c e s a l 突变体r s w l l 在受限温度下生长非常矮小并有许多小细胞从器官表面突 出 在受限温度下 植株持续生长 形成少量小的叶片和严重畸形的花 w i l l i a m s o n 2 0 0 1 这种粗放的形态学改变表明a t c e s a l 合成初级壁纤维素 根细胞扩张和有丝分 裂发生变化的细胞壁亚显微结构证实这一结论 s u g i m o t o 2 0 0 1 拟南芥细胞壁突变体p r o c e s t e 是c e s a 6 基因突变引起的 f a g a r d 2 0 0 0 该突变 的根和下胚轴的细胞延伸性存在严重的缺陷 a t c e s a l 突变体与a t c e s a 6 突变体在根中 表现出相似的突变表型 a f i o l i 1 9 9 8 f a g a r d 2 0 0 0 因此c e s a 6 t 量与初级壁纤维素沉 淀有关 s c h e i b l e 等 2 0 0 1 用c e s a 6 突变作对照 证明c e s a 3 对抑制纤维素合成的除 草剂具有抗性 晚明c e s a 3 可能对初级壁纤维素合成起作用 另 b e l i l 突变与r s w l 口 p r c i 突变均为a t c e s a 3 突变所致 t a y l o r 2 0 0 3 表明e l i l 也在初级细胞壁纤维素合 成中起作用 1 3 1 2 初级壁中c e s a 的表达 对每个基因的r n a 杂交证明它们足相关基因 每个基因在叶 花和根中的表达都是 6 相似 r s w l 一1 叶 花组织的r n a 杂交表明突变等位基因与野生等位基因的表达水平相似 转录水平相当 这与a r i o l i 检测的单个核苷酸变化结果一致 a r i o l i 1 9 9 8 c e s a 2 反义植株缺乏可见的表型 但它们降低了目的基因的表达 c e s a l 和c e s a 3 反 义植株能够回复到野生型 因此c e s a i 和c e 刚3 能够补足目的基因的表达 c e s a 6 在启动 子f 超表达时 也不能补足c e s a l 的功能 c e s a i c d n a 的表达弥补了r s w l 一1 突变体的缺 陷 对c e s a l 和c e s a 6 c e s a 3 的负调控大大减少了细胞的扩张 1 3 2c e s a 在次生壁中的表达 参与次生壁合成的基因突变导致纤维素含量大大减少 次生壁厚度变薄 木质部 表型坍塌 1 3 2 1 次生壁中的c e s a 基因 c e s a 8 年d c e s a 7 突变体i r x l 年n i r x 3 t a y l o r 1 9 9 9 2 0 0 0 组织大小和形状并没有 主要的变化 但坍塌的木质部中木质素使次生壁中纤维素累积减少 t u r n e ra n d s o m e r v i l l e 1 9 9 7 i r x 3 植株细胞次生壁中只有少量甚至没有纤维素 h a 2 0 0 2 c e s a 4 启动子启动b 葡糖醛酸糖苷酶基因的表达 c e s a 4 也参与次生壁纤维素的合成 h o l l a n d 2 0 0 0 c e s a 4 突变体i r x 5 次生细胞壁变薄 t a y l o r 2 0 0 3 木质部和束 问区域细胞壁比较薄 表面不规则 1 3 2 2 次生壁中c e s a 的表达 a t c e s a 4 在细胞次生细胞壁沉积时表达 实验证明a t c e s a 4 a t c e s a 7 和a t c e s a 8 对于同一细胞次生细胞壁的合成都非常重要 用茎节组织检测i r x l r 足船和t r x 5 的表 达 结果表明这些蛋臼质在同一个细胞中同时表达 t a y l o r 2 0 0 3 用抗体控制识 别不相关的蛋白质证明 野生型植株的木质部和束间区域的印迹标记由i r k 5 选择性识 别 在i r x 5 突变中 i r x l 和i r x 3 的表达没有改变 1 4 纤维素合成酶基因的作用机制 纤维素合成酶催化产生b 一1 4 葡聚糖链的机制仍然未知 尽管假定的底物位点 和催化残基已经鉴定 但是对于纤维素链是由单糖还是二糖合成的仍然不清楚 纤维 素b l 4 一链需要每一个葡萄糖残基翻转近1 8 0 但目前并没有实验证据证明葡萄糖 残基是如何翻转的 有假设认为c e s a 蛋白质的三维空间结构8 个假定跨膜螺旋在质膜 上形成一个孔 延伸的葡聚糖链通过浚孔到达最新生成的细胞壁 图4 蛋白质结合 结构域的氨基端位于细胞质内 能够自由地与其它蛋白质或酶活性所必需的因子进行 相互作用 图4假定的c e s a 蛋白质三维空间结构图 1 5 纤维素合成酶基因c e s a 功能的研究 运用遗传学手段进行c e s a 基因功能的研究成为该领域的研究重点 这些手段包括 d n a 微点阵 免疫细胞化学法 表达序列标签法 e x p r e e s e ds e q u e n c et a g s e s t s 点突变法 t d n a 插入法和病毒诱导基因沉默法 拟南芥的1 2 个不同的c e s a 基因就是 利用e s t s 方法鉴定出来的 因为基因家族中成员有可能催化相同的反应 h o l l a n d h e l e n t j a r i s 2 0 0 0 所以确定c e s a 基因家族中的各个成员的表达模式和准确的功能 是非常必需的 h o l l a n d 等人 h o l l a n d h e l e n t j a r i s 2 0 0 0 利用r t p c r 对玉米植 株不同部位的这些基因的m r n a 进行半定量分析 实验以扩增肌动蛋白保守区域作为参 照 结果表明c e s a 基因家族成员的表达具有器官特异性 即在不同器官中表达水平不 同 c h e n f u g g l e 1 9 9 7 b u r t o n 等人利用病毒诱导植物纤维素合成酶基因沉默的 方法来研究c e s a 基因的功能 他们将与c e s a 基因相关的三个特异c d n a 片段分别插入马 铃薯x 病毒载体 将他们接种到烟草 n 1 c o t i a n ab e n t h a m i a n a 上进行基因功能分析 结果感染的植株表现出节间缩短 小叶和侏儒症状 叶表面由于缺少纤维素而表现为 细胞膨胀 叶片的多聚糖含量降低2 5 c e s a 基因的转录水平降低 表明c d n a 片段沉默 了一个或多个纤维素合成酶基因的表达 b u r t o n g i b e a u t b a c i c 8 2 水稻脆性的研究进展 2 1 水稻脆性的研究历史 植物的茎秆强度是最主要的农艺性状之一 植物中脆性植株的研究早在上世纪六 十年代就开始 二十世纪七十年代 t a y l o r 在拟南芥中获得植物茎秆强度缺陷突变体 i r x l 八十年代 k o k u b o 等在大麦中获得了脆性突变体b c 并对其机械强度进行分析 目前拟南芥中己定位和克隆出三个与脆性相关的基因 大麦和玉米中也均有脆性植株 的报道 目前 水稻中已经发现并定位了6 个脆性基因 1 9 6 3 年 n a g a o t a k a h a s h i 定 位了水稻上第一个脆性基因b e l 1 9 6 8 年 t a k a h a s h i 发现了第二个水稻脆性突变体 但是直到1 9 9 4 年s a n c h e z k h u s h 才定位出第二个脆性基因b e 2 随后 1 w a t a o m u r a 等又先后定位了3 个脆性基因 2 0 0 1 年中国水稻所李云海等定位了一个脆秆基因 其 与已知的b c l 为等位基园 最近 显性脆性基因b c 一6 也己被定位 水稻中的脆性突 变体己经通过细胞学与经典遗传学的方法确定了连锁群 k i n o s h i t a 1 9 9 8 李云海 利用e s t s 在水稻基因组数据库中寻找到另外9 个b c l l 基因 迄今在水稻中已经定位 的脆性基因列于下表 g e n en m cc h r o m o s o m c m u t a g c n e s l sp h e n o t y p i cd e s c r i p t i o n r e f e f e n c e s n o b r i t t l e c u t m 13 l e a v e s c u i m s a n dp a n i c l e sa r cs ob r l t t l i nb o t hg r e e nn a g a o t a k a h a s h i b c l s p o n t a n e o u s a n dm a t u r es t a g e st h a tt h e yb r a ko f f a tt h es l i g h t e s t1 9 6 3 m n u p r e s s u r e b r l t ec u t m 2t a k a h a s h i 1 9 6 b e 2 5i n t e m a c u l m sa n dl e a v e sb r e a kv e r ye a s i ys a n c h c z l 1 l a s h 1 9 9 4 b r i t l l ec u l m 3 w e a k v e r yb r i d l ec u l m r a t h e rs h o r t a n di n c o m p l e t e 1 w a t a o m u r a1 9 7 7 b e 3 ji r r a d i a t i o n e m e r g e n c eo f p a n i c l e s t h eb r i t t l e n e s so f c u l ma n dp a n i c l e1 w a t a1 9 8 9 a w i t hp 3 2a x i s i sn o ta sd i s t i n c ta s t h a t o f b c la n db c 2 b r r t l ec u l m 一4 l i b r o j o k h u s h b e 4 6 g a m m ar a y c u l m sa n dl e a v e sb r e a kv e r ye a s i l ya ta l lg r o w t hs t a g e s 1 9 8 6 b r t t t l ec u l m 一5 o n l yn o d e i sf r a g i l ea n do t h e rp l a n tp a r t sa r en o tb r i d l e k h u s h s a n c h e z b c 5 j2u n k n o w n o t h e p 1 8 tp a r t sa r en o tb i n l u n l i k eo t h e b j n i ec a l m 1 9 9 3 s a n c h e z m m a n t s k h u s h1 9 9 4 b r i t t l ec u l m 一6a l lp l a n tp a r t se x t r e m e l yb r i t t l ef r o ms e e d l i n gs t a g et o s i n g he t a l 1 9 9 4 b e 6 j 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