微生物分子生态学研究方法进展.doc

宁波大学硕士研究生2009/2010学年第1学期期末考试卷考试科目： 实验生态学 课程编号： 07G13104A 阅卷教师： 陆开宏 姓名： 钱伟 学号： 0911091019 成绩： 90 微生物分子生态学研究方法进展摘要：现代分子生物学技术在生态学研究中的应用大大推动了微生物生态学的发展，导致了微生物分子生态学的产生。微生物分子生态学方法弥补了传统的微生物生态学方法的不足，使人们可以避开传统的分离培养过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构与环境的关系。微生物生态学研究中采用的分子生物学方法主要有核算探针技术、PCR扩增技术、rRNA序列同源性分析方法、梯度凝胶电泳方法等。这些技术方法的采用，取得了一系列重要的成果和微生物生态学研究中的突破，使得对某些微生物的研究成为可能，并在分子水平上阐述了生态问题的机制。关键词：微生物分子生态学；核算探针杂交；PCR；变性梯度凝胶电泳Development in Research Methods of Microbial Molecular EcologyAbstract：Application of the modern molecular biology technology in ecology greatly promoted the development of microbial ecology, leading to the microbial molecular ecology. Microbial molecular ecology compensated for deficiency of the traditional microbial ecology method making people avoid the traditional separation process and discuss the relationship between the population structure and environment directly. The application of molecular methods such as nucleotide probes hybridization, PCR amplification technologies, r RNA sequence homology analysis method and denaturing gradient gel electrophoresis, etc. the adoption of these techniques had a series of important achievements, making the study of certain microorganisms become possible and expound the mechanism of ecological problems under the molecular level.Keywords：microbial molecular ecology; nucleotide probes hybridization; PCR; denaturing gradient gel electrophoresis1 引言微生物生态学这门学科出现在20世纪60年代早期。之后，环境问题日益引起人们的关注。与此同时，微生物生态学得到了迅速的发展。20世纪末引入分子生物学技术之后，微生物生态学的研究得到了更深的发展。许多研究已经证实，通过传统的分离方法鉴定的微生物只占环境微生物总数的0.1%10%，远远不能满足微生物生态学研究的需要1,2。分子微生物生态学是分子生物学实验技术应用于微生物生态学研究领域而发展形成的一门交叉学科，在研究微生物生态系统的组成结构、功能的分子机理以及微生物与生物和非生物环境间的相互关系等方面显示了巨大的潜力。十几年来分子微生物生态学研究所取得的成就证明：分子生物学研究技术向微生物生态学领域的不断渗透，为微生物生态学研究领域注入了新的活力，尤其在微生物区系分子组成及变化规律、微生物多样性以及微生物系统进化研究方面取得了重大突破3。2 微生物分子生态学技术2.1 核算探针杂交技术核酸杂交技术能够灵敏地探测出环境微生物中特殊的核苷酸序列，并且用光密度测定法可直接比较核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。标记核苷酸探针可直接用来探测溶液中、固定在膜上、细胞或组织内的同源核酸序列。探针可以是长探针（100bp1000bp），也可以是短的寡核苷酸（1050bp）。杂交方式可以是狭缝杂交、菌落杂交或原位杂交35。荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, 简称FISH）是将DNA（或RNA）探针用特殊的荧光染料标记，然后将探针直接杂交稻生物样品的染色体或RNA上，以对某种基因或RNA进行定性和定位6。在微生物生态学研究中，常以微生物的核糖体亚基为靶标设计寡核苷酸探针，最常用的靶标基因是核糖体小亚基基因（SSU rRNA），也有时用核糖体大亚基基因（LSU rRNA, 23/28SrRNA）。针对核糖体亚基基因建立的FISH技术最早是由Delong及其合作者报道的（Delong, 1989），此后二十年来发展十分迅速，技术日趋成熟（Amann,1995）7，已广泛应用于湖泊，土壤及极端环境等多种多样复杂的生态环境及样品中微生物区系结构和种群多样性的研究8。 传统的纯培养技术在定量测定污水处理系统中微生物数量上存在着极大的偏差，而核酸探针杂交技术既弥补了传统方法不能进行原位测定的不足，又克服了免疫探针只能用于纯培养微生物以及絮凝物阻止抗体作用靶细胞的缺陷，而被广泛应用于污水处理系统中微生物生态学的研究。Wagner等首次利用核酸探针杂交技术对活性污泥中的微生物群落结构进行了分析，利用4种特异性核酸探针与活性污泥中的微生物进行全细胞杂交，通过落视荧光显微镜(epifluorescence microscope) 进行定量分析，结果发现活性污泥中处于支配地位的微生物分属于变形杆菌纲、和-亚纲，大约占活菌量的80 %。这是第一次在类群水平上对活性污泥中微生物群落结构进行原位分析。以16SrRNA、23SrRNA为探针的杂交技术在目前的许多研究中获得了成功，但是，对于某些特殊微生物群体，如低rRNA含量但具代谢活性的微生物和高rRNA残留量但不具代谢活性的微生物，就不起作用。因此，有人提出使用前16SrRNA作为探针进行杂交。Cangelosi 等的研究证实了使用大肠杆菌前16SrRNA为探针检测自然环境中细菌生长状况比16SrRNA探针更灵敏且可行，建议使用这种可以量化rRNA水平的探针前16SrRNA探针来检测细胞的生长活性。因此，Daniel等将该技术引入污水处理系统中的原位检测。他们选择了具有高效除磷效果的不动杆菌（Acinetobacter）为研究对象，报道了其前16SrRNA序列结构及特性，并设计了相应的核酸探针，以此作为污水处理系统中评价该方法的模式体系。他们分别用16SrRNA和前导16SrRNA为探针来监控纯培养条件下醋酸钙不动杆菌（A.calcoaceticus）的生长变化情况：发现前16SrRNA的水平在醋酸钙不动杆菌对数生长阶段的前期快速增长，末期开始下降；而16SrRNA的水平在对数生长阶段的中后期达到最高，下降趋势贯穿整个稳定期。这说明了前导16SrRNA 检测细菌生长变化的高灵敏性911。活性污泥法处理废水是今天环境保护中最重要的技术方法和工艺之一。但是，对其中的微生物共生体的群体结构和功能的相关性却知之甚少。活性污泥沉积物可以看作是固定化的生物膜，这个生物膜可共代谢很多有机化合物和环境污染物1214。网式探针杂交法(nested probe hybridyzation)正适合研究这个非常复杂的共生体：使用对不同分类单元特异性的探针进行从大至小过筛子似(Top-to-bottom)研究，第一轮杂交使用分别具有细菌域或古菌域特异性的探针，结果发现绝大多数细胞与细菌探针结合。第二轮用变形杆菌各亚纲（、）及其它谱系的探针进行杂交。结果发现每个探针都能探测几种形态类型。还应用相应的探针杂交用富营养琼脂富集样品得到的异养菌生长的平板。这表明，依赖培养的技术明显不适合分析活性污泥结构，因为原位杂交中大多数细胞只与亚纲探针杂交。第三轮杂交是用属的特异性探针杂交。结果发现，原位杂交的细胞只有1%10%的细胞与Acinetobacter的探针结合，而在营养平板上，则有30%60%的菌落与之杂交。这使人们认识到以前认为没有选择性的培养基实际上是有选择性的，传统的依赖培养技术方法不适于描述微生物群落结构。这样的一套探针可用来分析各种生态体系。用上述探针对饮用水管道中生物膜研究表明，生物膜的微生物的系统起源多样。 Holger等15为弥补以上不足之处，综合运用 FISH 法、CLSM和数字图像分析等方法，设计了一套半自动测定污水处理系统中氨氧化菌浓度的方案：向样品中加入不同浓度的大肠杆菌，并用特定的核酸探针对加入的大肠杆菌（E）和未加入大肠杆菌(UE)的样品进行荧光原位杂交；利用数字图像分析法分析不同的样品，然后算出其峰面积比；从UE样品的峰面积比中扣除E样品的峰面积比，然后将所得的各点绘制成双对数曲线图，并求出回归方程；根据公式将等价的大肠杆菌浓度换算成氨氧化菌的真实浓度。这一方案为污水处理系统中微生物数量的确定提供了一个既操作方便，简介，准确性高的途径10。2.2 基于PCR技术的研究方法PCR是1985年由Mullis发明的一种聚合酶链式反应技术，主要特点是短时间内在实验室条件下人为地控制并特异扩增目的的基因或DNA片段，使研究的目的基因及其环境样品中的微量微生物基因得到无限的扩增，为微量微生物种群的研究提供了保证。PCR技术的发明和不断完善，为分子生物学的发展以及微生物分子生态学的发展和分析技术的建立提供了有力的工具。2.2.1 PCR-RFLP方法末端限制性片段长度多样性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP）分析技术是一种新兴的研究微生物多态性的分子生物学方法，其原理是根据某个标识基因（通常是核糖体小亚基基因）的保守区设计通用引物，其中一个引物的5末端用荧光物质标记，以待分析样品的DNA为模板进行PCR扩增，所得到的PCR产物的一端就带有这种荧光标记，然后用合适的限制性内切酶消化PCR产物。将酶切产物用DNA测序仪进行分析16。由于样品中不同微生物的扩增片段内存在核苷酸序列差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生很多不同长度的限制性片段。但DNA测序仪只能检测到末端带有荧光标记的片段。因为不同长度的末端限制性片段代表不同的微生物，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况。T-RFLP还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积就越大17,18。近十几年来该技术已经成功应用于各种环境中微生物群落多样性及结构特征等方面的研究。现在很多研究人员利用16SrRNA来研究土壤微生物的多样性。该技术还可以用来监测因环境改变而引起的微生物种群的变化。耕作过的土壤中的微生物种群结构的变化越来越多的引起人们的重视，Buckley DH等人提取土壤中微生物的RNA，通过标记过的不同引物扩增，确定16SrRNA的丰度58。2.2.2 PCR-SSCP方法单链构象多态性研究（SSCP）方法本来是用于临床鉴定基因突变，近年来被应用到微生物生态学的研究中。SSCP方法包括5个步骤：样品DNA的提取；扩增16SrDNA的引物为真细菌通用的引物；将扩增后的产物变性，形成单链的DNA；用聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同的片断分离；回收DNA，测定不同条带的序列，同基因文库的16SrDNA序列进行比较，最后确定微生物的种属。Sabine Peters等人用该法研究群落的演替和菌种的多样性，并同传统的培养方法比较指出PCR-SSCP方法避免了传统培养的费时费力以及误差大的干扰，适合对微生物群落结构和演替的分析。Frank Schw ieger等人通过对根系微生物的分析表明PCR-SSCP可以很好的分析微生物群落的动态变化，并应用此方法研究了种植对土壤微生物群落的影响 19,20。2.2.3 PCR-DGGE方法PCR-DGGE分析技术也称指纹图谱分析技术，指纹技术是指PCR扩增过的标记序列通过一定的色谱、电泳等技术解析成具有特定条带特征的谱图，一般每个条带可以看作是一个微生物类群，条带的亮度可以反映这个类群的数量水平。目前，用于群落结构分析的指纹图谱技术很多，最常用的是16SrRNA或18SrRNA基因序列多变区的扩增与变性梯度凝胶电泳（DGGE）/温度梯度凝胶电泳（TGGE）的结合。梯度凝胶电泳就是指对使用一对特异性引物扩增微生物自然群体的16SrRNA或18SrRNA基因而产生的长度相同但序列不同的DNA片段混化物进行变性梯度凝胶分离的技术。其原理是，在包含有线性梯度DNA变性剂或线性温度梯度的聚丙烯酰胺凝胶上，各种DNA分子在达到各自的解链温度或变性浓度时进行解链，解链后的双链DNA分子在凝胶上的相应位置停止迁移，不同的DNA分子具有不同的解链温度或变性浓度，因此可以达到分离的目的。但是，一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域浓度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移，这些片段就不能被区分开来。为防止这种情况出现，通常在DNA片段的一端加入一段富含GC的DAN片段，它的解链浓度很高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。所以可以根据DGGE电泳条带的多寡和条带的位置、强度可以可用于微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析、富集培养物及分离物的分析、核糖体RNA同源性的分析。但由于在PCR扩增过程中可能存在碱基插入的错误、不同微生物细胞破壁难易的不同等原因而造成分析结果的偏差21,22。Myuzer首先将DGGE技术应用到分子微生物生态学，以确定自然环境中微生物群体的遗传多样性。最近有人将DGGE方法扩大到分析富集微生物和微生物菌株的筛选上，从而避免了对多个无遗传差别或差别很小的菌株重复进行繁琐的各种表观特征研究，大大降低了工作量。目前国内尚未见这方面的报道23,24。张德民等使用DGGE方法对表型特征相似的24株 Rps. palustris - like 分离菌及3株相关标准菌的16SrDNA进行了遗传多样性分析。结果表明这些菌株共有5个不同的遗传类型：3个标准菌株代表3个各不相同的类型，24个分离株中有4个不同的遗传类型，其中有2个类型与标准菌株相同，而另2个类型则是新的遗传型。根据RDP和genebank数据库现有的16SrDNA序列针对紫色非硫光合细菌中的4个最常见属设计了4个特异性正向引物，分别与一通用反向引物组合,对12个自然样品及其富集培养物的总DNA进行PCR扩增，然后再对得到的PCR产物进行DGGE分析。结果表明，有些属的紫色非硫光合细菌在自然界中分布广泛，但含量较低，较易得到富集培养物；有些属则在自然界也同样分布广泛，也有较高的含量，但不易得到富集培养物，经富集培养后这些菌群反而丢失了25,26。基于PCR技术的方法解决了由于VNBC状态而导致大部分环境微生物不能被鉴定出来的状况，各个方法已经建立了比较成熟的技术。几种方法的应用大大推进了微生物生态学的研究，是当今该领域应用最为广泛的方法。3 微生物分子生态学的应用中国生态学会微生物生态专业委员会2009年年会在描述当前微生物生态学研究的热点时指出，随着微生物分子生态学的发展，利用分子生物学技术解决微生物起源和早期进化的问题，可以为生命起源的初期形式提供信息；微生物漫长的进化史造就了微生物的多样性，而其中近95 %99 %的微生物物种刚刚开始被人类所认识和了解，估计自然界中有近一百万种微生物存在，但是到目前为止仅有近五千种被描述。要揭示复杂世界的多样性，分子生物学研究技术将显示出巨大的潜力；不同生态环境对微生物区系的影响及其微生物对环境条件变化的响应规律；在退化生态系统和污染环境的微生物生物修复工程中，微生物及其工程菌的作用最具前途；外太空中是否有生命的存在？这是目前生物学界关注的热点之一，如果太空存在生命的话，估计最有可能的是微生物，而在我们尚未认识他们时，不可能有有效的分离方法。此时，利用微生物分子生态学的研究方法和策略，是最佳选择方案；以微生物分子生态学的观点重新审视参与自然界物质循环的微生物种群及其他们在其中的作用。4 展望传统微生物生态学的分析方法正受到日益发展的现代分子生物学技术的挑战，例如使用纯培养的细菌DNA和使用微生物群落总DNA分析得到的结果就存在差距，纯培养的多样性较小，说明实验室培养的分离物并非生态学的优势种。在研究和发展微生物分子生态学的过程中，应该注意分子生物学技术本身存在的不足之处及其在研究过程中的不稳定因素对实验结果的影响。因此，在利用分子生物学所取得的结果进行理论探讨时，应该充分考虑到方法的代表性和稳定性，只有这样才能加速微生物分子生态学的发展。随着新研究方法的灵活运用，这门学科必将有美好的未来。参考文献1 张洪勋,王晓谊,奇鸿雁.微生物生态学研究方法进展J.生态学报,2003,23(5):9879952 李玉英,梁子安,琴本玲.微生物分子生态学研究方法进展J.南阳师范学院学报(自然科学版),2004,3(6):45493 张惠文,张倩茹,周启星等.分子微生物生态学及其研究进展J.应用生态学报,2003,14(2):2862924 刘志培,杨惠芳.微生物分子生态学进展J.应用与环境生物学报,1995,5(Suppl):43485 张彤,方汉平.微生物分子生态技术:16SrRNA/DNA方法J.微生物学通报,2003,30(2):971016 Delong EF, Wickham GS and Pace NR. 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