牡丹籽油营养成分及功能作用的研究论文.pdf

原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独 立进行研究所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果 对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式标明 本声明 的法律责任由本人承担 一工y 论文作者签名 生茎 e l 期 墅建 三 圣圣 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留 使用学位论文的规定 同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论 文被查阅和借阅 本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名 立乏导师签名 l 中 山东大学硕士学位论文 目录 中文摘要 3 英文摘要 6 符号说明 9 前言 1 0 第一章牡丹籽油营养成分的测定 1 5 l 牡丹籽油中脂肪酸成分及含量的测定 1 5 2 牡丹籽油中维生素e 的测定 1 6 3 讨论 1 7 第二章牡丹籽油的安全性评价 1 9 l 实验材料 1 9 2 实验方法 2 0 3 实验结果 2 3 4 讨论 2 7 第三章牡丹籽油功能作用的研究 2 9 l 实验材料 2 9 2 实验方法 3 0 3 结果 3 2 4 讨论 3 4 结论 3 6 l l f 录 3 7 参考文献 4 9 致谢 5 4 攻读硕士期间发表的论文 5 5 山东大学硕士学位论文 c o n t e n t s c h i n e s ea b s t r a c t 3 a b s t r a c t 6 a b b r e v i a t i o n 9 i n t r o d u c t i o n 1 0 c h a p t e rld e t e r m i n a t i o no f p e o n ys e e do i ln u t r i e n t s 1 5 1d e t e r m i n a t i o no f p e o n ys e e do i lf a t t ya c i dc o m p o s i t i o n 1 5 2d e t e r m i n a t i o no f v i t a m i nei nt h ep e o n ys e e do i l 1 6 3d i s c u s s i o n 17 c h a p t e r2s a f e t ye v a l u a t i o no f t h ep e o n ys e e do i l 19 1m a t e r i a l s 1 9 2m e t h o d s 2 0 3r e s u l t s 2 3 4d i s c u s s i o n 2 6 c h a p t e r3r e d u c i n gl i p i da u x i l i a r i l ye x p e r i m e n t s 2 9 lm a t e r i a l s 2 9 2m e t h o d s 3 0 3r e s u l t s 3 2 4d i s c u s s i o n 3 4 c o n c l u s i o n 3 6 a p p e n d i x 3 7 r e f e r e n c e s 4 9 a c k n o w l e d g m e n t s 5 4 l i s to f p u b l i s h e dp a p e r s 5 5 2 山东大学硕士学位论文 牡丹籽油营养成分及功能作用的研究 研究生 王芸 导师 徐贵发教授 中文摘要 研究目的研究牡丹籽油的营养成分及含量 探讨牡丹籽油的安全性和功能性作 用 辅助降低血脂作用 开发新型食用油 牡丹籽油 为牡丹籽油开发为保健食 品 食品添加剂及药品等提供可靠的理论依据 研究方法 1 脂肪酸成分含量 维生素e 含量的测定采用气相色谱 质谱法测定牡丹籽油 中重要脂肪酸的含量 包括亚油酸 亚麻酸 油酸等的含量 采用高效液相色谱 法测定方法测定牡丹籽油中维生素e 的含量 2 安全性评价 1 小鼠急性毒性实验选择雌雄小鼠各2 4 只 体重为1 8 2 2g 实验前禁食 1 6 h ld 内给予牡丹籽油1 次 连续给予7 天 每日剂量为2 0 m l k g b w 的灌胃 量 给予受试样品后 观察小鼠的中毒表现及死亡情况 2 大鼠3 0 d 喂养实验体重7 0 9 0g 的断乳大鼠8 0 只 雌雄各半 随机分正 常对照组及牡丹籽油低 中 高剂量组 o 5 5m l 1 0 0g b w 0 7 5m l 1 0 0g b w 1 1 m l 1 0 0g b w 各组灌胃量按体重计 对照组采用蒸馏水 每天灌胃1 次 连续 3 0 d 第3 0 d 尾静脉取血 测血常规 之后禁食1 6h 腹动脉取血 进行血生化 测定 同时对脏器进行病理学检查 3 本实验分为低 中 高和对照组四组 本样品人体推荐量为6g 天 每人 按6 0 蚝体重计 相当于每日o 1g k g b w 按此计算设低 中 高三个剂量组 相当于人体推荐剂量的5 0 7 0 1 0 0 倍 剂量组的灌胃量分别为0 5 5m l 1 0 0g b w 0 7 5m l 1 0 0g b w 1 1m l 1 0 0g b w 体重计 对照组采用蒸馏水 实验期间观察孕 鼠情况 2 0d 处死 对胎鼠进行处理并观察各项指标 3 降血脂实验 3 山东大学硕士学位论文 将5 0 只健康成年雄性s d 大鼠 随机分为正常对照组 高脂模型组 牡丹 籽油低 中 高剂量组 o 5 4 1 0 8 3 2 3m l k g b w 正常对照组给予正常饲料 高脂模型组给予高脂饲料 其他3 个实验组在给予高脂饲料喂养的同时灌胃不同 剂量的牡丹籽油 3 5d 后观察大鼠血脂水平变化 结果 1 牡丹籽油中富含不饱和脂肪酸 包括亚麻酸 亚油酸 油酸 二十碳三烯酸 二十碳烯酸 十六碳烯酸等 占总油量的8 9 1 9 其中亚麻酸的含量高达3 7 8 4 亚油酸占2 5 7 2 油酸占2 1 4 1 此外 牡丹籽油中v e 含量也很高 为3 1 6 2 m g 1 0 0 9 2 安全性评价 1 急性毒性实验1 4d 内动物无中毒表现 且无死亡 该受试物对两种性别小 鼠的m t d 均大于2 0 o g k g b w 该样品属无毒级物质 2 大鼠3 0 d 喂养实验各实验组大鼠的胃 肠 肝 肾 脾和卵巢 睾丸组织 未见明显异常 血液学和血液生化学 组织病理学检查 各剂量组有少数组织标 本出现病理学改变 但程度较轻且无组间分布差异 不能说明实验组出现有意义 的病理学改变 3 致畸实验各实验组与对照组相比 孕鼠生长良好 体重无差异 胎鼠发 育各项指标 平均体重 平均身长 平均尾长等 和骨骼发育指标等均无统计学 差异 3 降血脂实验 实验过程中 各组动物生长 活动正常 与正常对照组比较 各组动物的体重 差异没有统计学意义 尸 o 0 5 与正常对照组比较 高脂模型组大鼠的血清总 胆固醇 t c 血清甘油三酯t g 明显升高 p o 0 1 与高脂对照比较 实验组 低 中剂量组大鼠血清总胆固醇 t c 水平降低 尸 o 0 5 高剂量大鼠血清总胆 固醇 t c 水平降低 p 0 0 1 中 高剂量大鼠血清甘油三酯 t g 水平均降低 p o 0 1 中 高剂量组高密度脂蛋白 h d l c 水平均增高 尸 0 0 5 c o m p a r e dw i t hn e g a t i v ec o n t r o l g r o u p h i g hf a tc o n t r o lg r o u p s e r u m t o t a lc h o l e s t e r o l t c a n ds e r u mt r i g l y c e r i d e t g w e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d 妒 0 0 1 c o m p a r e dw i t l ll l i 班f a tc o n t r o l t h es e r u m t o t a lc h o l e s t e r o l t c l e v e l so fl o wa n dm i d i u md o s eg r o u pw e r ed e c r e a s e d 尸 0 0 5 s e b l n lt o t a lc h o l e s t e r o l t c l e v e l so fh i 曲d o s eg r o u pw e r ed e c r e a s e d p o 0 1 s e l t l mt r i g l y c e r i d e t g l e v e l so fm i d d l ea n dh i g hd o s eg r o u pw e r ed e c r e a s e d 尸 0 o1 h i g h d e n s i t yl i p o p r o t e i n h d l c l e v e l so fm i d d l ea n dh i g hd o s eg r o u pw e r e i n c r e a s e d p 0 0 5 血液学结果显示 雌 雄性大鼠的各剂 量组之间的各指标与对照组比较差异均无统计学意义 p 0 0 5 血生化测定结 果显示 与对照组比较 低剂量组雄性大鼠的血糖显著降低 有统计学意义俨 0 0 5 其它各相关指标与对照组比较差异无统计学意义 p 0 0 5 实验结束时断头处死大鼠 检查各脏器状态 肝脏系数大小正常 表面光滑 无结节包块 颜色新鲜 边缘锐利 取出两侧肾和肾上腺 对准肾门 将肾以最 大剖面剖开 暴露肾盂 皮质和髓质 各部分的厚度 颜色正常 边界清晰 胃 肠粘膜未见出血 增厚 溃疡 淋巴滤泡增生等病变 脾切面马氏小体清晰可见 各实验组大鼠的胃 肠 肝 肾 脾和卵巢 睾丸组织 未见明显异常 与对照 组相比 肝 肾 脾 睾丸等器官的脏器系数差异均无统计学差异 尸 0 0 5 对照组和各剂量组雌 雄动物的肝 脾 肾 胃 肠 睾丸 卵巢等脏器迸行组 织病理学检查未见异常 镜下观察 也未见有意义病理改变 3 3 致畸实验 3 3 1 一般情况观察 各组动物生长发育 活动均正常 无中毒表现和死亡 3 3 2 一牌牡丹籽油对孕鼠体重的影响 三个剂量组大鼠实验期内体重增加与对照组无明显差异 p 0 0 5 见表1 口 n n o 0 钆v坟艟扑右螺求酞耥 丑罂鼎匪捉师鼎删徭谁 燃 卜象 n 1 on i n na 寸n 古h nhnt 埘 0匕d寸 寸 0斜fon n寸 n 峙菖卜 口寸n qn千0 n口寸 nn千on 寸n寸 千o nhn a 寸gn n n o h 心n h n 1 9负 o寸 n卜 an千0寸 寸岭n n fo 卜hn n foh 寸岔n o h喾n n n o i f0 一nn n 峪n o 06n 卜 0寸 o心n o 卜o 卜n f0 寸 n寸 n f00 寸n o n n fo 寸n a n n fon on 卜岔 岔n fo心 n卜n o 鼎删幂恒囊捌幂壬 鼎删幂警 匿靛 嚣一捌峰埝鲆贴 怅o n 爵 怅口 卧 怅n 爵 k 卜卧 帐 爵 一暑 删峰肇磁k 蒹鼎 一 刊r 一 蜃醴g槲故隧醉茛暴椠吠裂嬖l h 僻 仪秘迥扑 千隧扑k长r11 山东大学硕士学位论文 3 3 3 牌牡丹籽油对胚胎早期发育的的影响 三个剂量组与对照组比较 胚胎早期发育的各项指标差异均无显著性 p 0 0 5 见表2 表2 一牌牡丹籽油对胚胎早期发育的影响 x 士s 注 各剂量组与对照组相比 差异无统计学意义 p 0 0 5 3 3 4 牌牡丹籽油对胎鼠发育的影响 三个剂量组活胎鼠发育的各项指标与对照组比较 差异均无显著性 p 0 0 5 见表3 表3 一牌牡丹籽油对活胎鼠发育的影响 x 士s 注 各剂量组与对照组相比 差异无统计学意义 尸 0 0 5 3 3 5 牌牡丹籽油对胎鼠骨骼发育的影响 三个剂量组与对照组比较 活胎骨骼发育的各项指标无显著性差异 p 0 0 5 见表4 各组骨染色标本图见附录二 山东大学硕士学位论文 表4 牌牡丹籽油对胎鼠骨骼发育的影响 石士s 注 各剂量组与对照组相比 差异无统计学意义 p o 0 5 3 3 6 牌牡丹籽油对胎鼠器官发育的影响 一牌牡丹籽油对胚胎器官发育的的影响三个剂量组与对照组比较 对活胎 胎鼠器官的发育的影响无显著性差异 胗o 0 5 见表5 表5 牌牡丹籽油对胎鼠器官发育的影响 4 讨论 注 各剂量组与对照组相比 差异无统计学意义 p o 0 5 根据我国保健食品检验与评价规范推荐的检测方法 本研究选取了急性毒性 实验 大鼠3 0d 喂养实验和致畸实验作为组合 判定牡丹籽油的安全性 急性毒性实验是指经口 吸入或经皮染毒 一次给予或2 4 h 内多次给予较 大剂量的受试物 观察实验动物在短时间内产生的毒性反应的一种试验方法 它 包括致死的参数指标和非致死的参数指标 本研究结果显示 在急性毒性实验期 间 小鼠未见明显中毒症状 无死亡情况 且两种性别小鼠对牡丹籽油的最大耐 受量均大于2 0 0m l k g b w 根据急性毒性分级标准判断 该样品应属于无毒级物 质 3 0d 喂养实验是指较长时期内饲喂不同剂量的受试物 检测各受试物对实验 动物引起有害效应的剂量 毒作用的靶器官及毒作用的性质 估计亚慢性摄入危 山东大学硕士学位论文 害性的实验方法之一 它包括一般观察指标 血液学指标 血液生化指标和一些 病理学指标等 实验结果显示 在亚急性毒性实验期间 牡丹籽油对实验大鼠不 产生明显毒性作用 对大鼠生长发育 体重增重 食物利用率和脏器系数等各项 指标均无明显影响 牡丹籽油对实验组血常规及血生化各指标的影响在正常值范 围之内 对实验组脏器的病理组织检查未见有意义的病理改变 因此可以得出 在上述染毒情况下 牡丹籽油对大鼠没有明显毒性作用 上述研究结果可能与一 些研究结果不同 这可能与大鼠种属 大鼠年龄 灌胃剂量 实验时间长短等有 关 致畸是指环境污染 受试物 等因素干扰胚胎正常发育 作用于胚胎发育的 不同阶段引发多种后果 如胚胎重吸收 死亡 流产或先天性畸形的现象 致畸 的作用机制和作用方式十分复杂 目前多数还不清楚 w i l s o m 1 9 7 7 提出了畸 形发生的9 种机制 包括突变 染色体断裂 有丝分裂改变 改变核酸完整性或 功能 减少前体或底物的补给 减少能源支持 改变膜特性 渗透压不平衡和酶 抑制作用 潜在的致畸物是否导致致畸取决于生物的活化机制 活性代谢物的稳 定性 通过胎盘屏障的能力 胚胎组织的解毒能力等 致畸作用是发育毒性中最 重要的一种表现 所以外源化学物发育毒性的评定 主要是通过致畸试验 在致 畸试验中除可观察到出生幼仔畸形外 也可同时发现生长发育迟缓和胚胎致死 传统常规致畸试验是评定外源化学物是否具有致畸作用的标准方法 多年来很多 国家和机构都采用和推荐这一方法 致畸实验结果表明 牡丹籽油各剂量组对孕鼠体重增长 对胚胎早期发育及 胎鼠的生长发育 对胎鼠的骨骼和内脏发育均无明显影响 经致畸实验结果表明 牡丹籽油对大鼠母体和胎仔均未表现出胚胎毒性和致畸效应 综合以上实验结果 可以认为牡丹籽油的食用具有安全性 本部分对牡丹籽油的安全性作了进一步证实 通过急性毒性 3 0 天喂养 实验和牡丹籽油的致畸性实验 确定牡丹籽油在不同剂量的长期摄入下 不会引 起毒性危害 不会对后代产生不良影响 在此基础上 我们可以根据食品安全相 关规定外推到人 为牡丹籽油的深入推广提供了科学依据 根据调查 山东菏泽 地区当地居民长久以来有食用牡丹籽油的习惯 因此更能证实牡丹籽油的食用安 全性 分析和探讨牡丹籽油的安全性评价 这将为牡丹籽油的开发应用提供安全 性参考 2 r 山东大学硕士学位论文 1 实验材料 1 1 主要仪器 第三章牡丹籽油功能作用的研究 t g l 1 6 c 台式离心机 上海安亭科学仪器厂 b s 2 2 4 s 型电子天平 德国 s a r t o r i o u s 公司 恒温水浴箱 上海医疗机械七厂 k q 一1 0 0 型超声波清洗器 昆 山市超声仪器有限公司 m a 电子天平 上海第二天平仪器厂制造 t 5 0 0 电 子天平 美国双杰兄弟有限公司制造 低速离心机 上海电子光学技术研究所 微量加样器 美国热电公司 7 2 2 型分光光度计 上海第三分析仪器厂 1 2 主要试剂 血清总胆固醇 t o t a lc h o l e s t e r o l t c 试剂盒 中生北控生物科技股份有限公 司提供 甘油三酯 t r i g l y c e r i d e t g 试剂盒 中生北控生物科技股份有限公司 提供 高密度脂蛋白胆固醇 h i 曲d e n s i t yl i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o l h d l c 试剂盒 中生北控生物科技股份有限公司提供 1 3 实验样品 一牌牡丹籽油 淡黄色油状液体 比重为0 9 3 1 4 高脂饲料 高脂饲料 由山东省疾病预防控制中心制各 7 8 8 基础饲料 l 胆固醇 1 0 蛋黄粉 1 0 猪油 0 2 胆盐 1 5 实验动物 s p f 级w i s t a r 雄性大鼠5 0 只 1 8 0 2 2 0g 山东大学实验动物中心提供 合 格证号为s c x k 鲁2 0 0 9 0 0 0 1 动物饲养条件为实验室环境温度2 2 2 空气 相对湿度5 0 生1 0 室内照明以自然光线为主 通风良好 保持环境安静 饲料 山东大学硕士学位论文 垫料均由山东大学实验动物中心提供 动物饲料营养成分符合营养需求 垫料经 过高压灭菌 每天更换 保持动物的清洁和干爽 饮用水为蒸馏水 2 实验方法 2 1 实验原理 用高胆固醇和脂类饲料喂养动物可形成脂代谢紊乱动物模型 同时给予动物 受试样品 可检测受试样品对高脂血症的影响 并可判定受试样品对脂质的吸收 脂蛋白的形成 脂质的降解或排泄产生的影响 2 2 实验步骤 以普通饲料饲喂大鼠 适应性喂养7d 后 然后取尾血 以血清总胆固醇 t c 甘油三酯 t g 高密度脂蛋白胆固醇 h d l c 为测定指标 根据血清总 胆固醇t c 水平和体重随机分为5 组 每组1 0 只 给每只大鼠染色编号 鼠笼 贴标签标明组别 人体推荐量为6g 6 0k g b w d o 1g 60k g b w d 按照人体推 荐量计算灌胃量 各组的分组情况和操作依次为 正常对照组 正常饲料 蒸馏水 高脂对照组 高脂饲料 蒸馏水 低剂量组 高脂饲料 牡丹籽油 0 5 4m l k g b w 灌胃 相当于人体推荐量的5 倍 中剂量组 高脂饲料 牡丹籽油 1 0 8m l k g b w 灌胃 相当于人体推荐量的 1 0 倍 高剂量组 高脂饲料 牡丹籽油 3 2 3m l k g b w 灌胃 相当于人体推荐量3 0 倍 每日1 次 在实验过程中 自由饮水 摄食 每周称量大鼠体重1 次 持续 喂养5w 第3 5d 禁食1 6h 后断头取血 用离心机3 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 分 离血清用于血脂分析 2 3 血清t c t g h d l c 的测定 山东大学硕士学位论文 2 3 1t c 醇检测 c o d c e p a p 法 一次性无色塑料 玻璃 试管中加入总胆固醇检测试剂l m 1 将待检血液充分混匀 取1 0p l 加入试管中 再充分混匀 放入3 7 恒温水 浴1 0 m i n 见附录三 2 3 2t g 检测 g p o p a p 法一次性无色塑料 玻璃 试管中加入甘油三酯检测试剂lm l 将 待检血液充分混匀 取1 0p 1j j i a 试管中 再充分混匀 放入3 7 恒温水浴1 0m i n 见附录四 2 3 3h d l c 检测 p t a m 孑 沉淀法一次性无色塑料 玻璃 试管中加入高密度脂蛋白检测试 剂lm l 将待检血液充分混匀 取2 5 肛l 加入试管中 再充分混匀 放入3 7 恒 温水浴1 0m i n 见附录五 2 4 结果判定 比较t c t g h d l c 变化情况 若实验组与正常对照组比较差异有统计 学意义 可判定血清t c t g h d l c 结果阳性 血清总胆固醇 甘油三酯两个指标阳性 可判定该样品辅助降血脂功能动 物实验阳性 甘油三酯鼹个剂量组结果阳性 或者 个剂量组结果阳性 同时 高密度脂蛋白胆固醇结果阳性 可判定该样品辅助降低甘油三酯动物实验阳性 血清总胆固醇两个剂量组结果阳性 或者一个剂量组结果阳性 同时高密度脂 蛋白胆固醇结果阳性 可判定该样品辅助降低血清总胆固醇动物实验阳性 严格 按照 保健食品检验与评价技术规范 卫生部2 0 0 3 版 的试验方法和操作要求 进行实验 5 2 1 2 5 质量控制 1 随机分组 剔除极值 根据体重和t c 水平随机分组 兼顾t g 和h d l 山东大学硕士学位论文 2 建立动物模型过程中 选择合适的动物品系 依照规定进行饲养和管理 保证基础饲料的必要营养成分 必要时自行配制饲料 3 实验前后撤食时间和 条件尽量保持一致 2 6 实验数据统计 采用s p s s l8 0 进行单因素方差分析和t 检验 实验数据用均数4 标准差 s 表示 p o 0 5 表示差异有统计学意义 尸 0 0 5 见表6 表6 牡丹籽油对大鼠体质量的影响 3 2 山东大学硕士学位论文 口初期体质基f g 口中期体质量 g j 图末期体质量纠 正常对照维高鹰对照组低剂量组 中荆量组 高荆量组 图1牡丹籽油对大鼠体质量的影响 3 2 实验前各组大鼠的血清t c t g 皿i 严c 水平 与正常对照组比较 各组大鼠的血清t c t g h d l c 水平差异没有统计 学意义 尸 o 0 5 见表7 表7 实验前各组大鼠血液t c t g h d l c 含量比较 石士s 3 3 实验后各组大鼠的血清t c t g i l c 水平 与正常对照组比较 高脂对照组大鼠的血清t c t g 均明显升高俨 o 0 1 表明高血脂模型成立 与高脂对照比较 实验组低 中剂量组大鼠t c 水平降低俨 o o s 高剂量大鼠t c 水平降低俨 0 0 1 中 高剂量大鼠t g 水平均降低 尸 o 0 1 中 高剂量组h d l 水平均增高 p o 0 5 见表8 的 的 的 的 o s 4 4 3 3 2 2 l l 山东大学硕士学位论文 表8 实验后各组大鼠血液t c t g h d l c 含量比较 士s 注 尸 0 0 1v s 正常对照组 p 0 0 5 v s 高脂对照组 p 0 0 1v s 高脂对照组 3 5 0 l b t cc m m o 3 0 0l 4 讨论 正常对照组高脂对照组 低剂量组中剂量组高剂量组 图2 实验后各组大鼠血液t c t g h d l c 含量比较 本实验研究结果表明 每天给予高脂大鼠不同剂量的牡丹籽油可降低高血脂 大鼠血清t c t g 并升高血清h d l c 尸 o 0 5 说明牡丹籽油有辅助降血脂的 作用 牡丹籽油的辅助降血脂功能可能与其所含的营养成分 尤其是不饱和脂肪酸 有关 亚麻酸能降血脂 降低胆固醇 并促进脂肪代谢 对高脂血症和动脉硬化 有一定影响 可以起到一定的预防作用 此外 亚油酸对血小板凝聚 血粘稠度 血栓和癌症也有影响 亚油酸还有抗炎症 抗氧化 调节免疫系统 减少疼痛等 作用 此外 牡丹籽油中还含有维生素e 植物甾醇 多酚类物质等多种物质 v e 可以抑制血小板粘附及聚集作用 抑制体内胆固醇合成限速酶的活性 降低 的 驺 辨 2 2 l 1 o 山东大学硕士学位论文 血浆胆固醇水平 减少脑梗死和卒中的危险性 植物甾醇等植物固醇类 可以抑 制胆固醇的吸收 在一定作用上有效降低h d l c 水平 起到抗癌 抗氧化 抗 动脉粥样硬化的作用 因此推测牡丹籽油的降血脂作用可能与其含有维生素e 植物甾醇和多酚类化合物也有关联 牡丹籽油辅助降低血脂功能的作用机理及构 效关系目前尚未完全清楚 有待进一步研究 本研究第三部分以雄性大鼠为研究对象 建立高脂血症动物模型 在给予高 脂饲料的同时给予不同剂量的牡丹籽油 在实验后期取血 测定血清总胆固醇 t c 甘油三酯f i g 高密度脂蛋白胆固醇 h d l c 三项指标 实验结果显示 牡丹籽油有辅助降低血清t c t g 的作用 对于h d l c 也有一定的升高趋势 血脂异常是心血管疾病的重要危险因素之一 而多不饱和脂肪酸与血脂的关 系一直以来就存在争议 但大多数实验研究都支持p u f a 具有降血脂的作用 认 为p u f a 能够降低t c 和l d l 而不能降低h d l 水平 或使l d l 下降较多而 h d l 下降较少 5 3 5 5 1 牡丹籽油中含有大量多不饱和脂肪酸 结果也支持p u f a 能降低血清t c 和t g 对h d l c 在一定剂量范围内有一定升高趋势 血脂异常与膳食 生活方式有一定相关因素 因此从膳食结构等途径调节血 脂在防治心血管疾病上具有重要意义 研究显示 各种食用油对于控制胆固醇上 升的强弱效果是不同的 在同样使用量的基础上 食用不同食用油对于血清胆固 醇下降的比例各不相同 有人曾做过实验 5 6 5 7 1 食用橄榄油 玉米胚芽油对于降 低血清胆固醇效果更好 从成分上分析 牡丹籽油对于降血脂应该也有良好的成 效 目前 人们已经采用混合不同食用油比例 以调节人体血清胆固醇 维护人 体健康 牡丹籽油含有大量的亚油酸可以跟其它油脂混合 以生产出更高品质的 食用油 我国牡丹籽产量丰富 出油率高 成本低 无毒副作用或者说毒副作用极小 具有潜在的开发和利用价值 所以极其有望成为一种广泛食用油 更期望牡丹籽 油开发为辅助降血脂的保健食品 3 5 山东大学硕士学位论文 结论 本研究通过对牡丹籽油营养成分含量的测定和动物实验研究 探讨牡丹籽油 的各种营养成分及功能作用 证实了牡丹籽油的食用安全性和降血脂作用 1利用气相色谱 质谱法和高效液相色谱法测得出 牡丹籽油中富含不饱和脂肪 酸 其中亚麻酸占3 7 8 4 亚油酸占2 5 7 2 油酸占2 1 4 1 牡丹籽油中v e 含量为m 6 2m g 1 0 0 9 2 牡丹籽油急性毒性实验表明 该样品属无毒级物质 大鼠3 0 d 喂养实验表明 各剂量组指标都在正常范围内 致畸实验的实验结果证实 牡丹籽油无致畸作用 3 降血脂实验表明 牡丹籽油降低了低 中 高实验组的血清胆固醇水平 同 时也降低了中 高剂量实验组的血清甘油三酯水平 对中 高剂量组高密度脂蛋 白 h d l c 水平均具有增高的作用 山东大学硕士学位论文 附录 附录一 v e 的国标测定 l 范围 本标准规定了用液相色谱法测定维生素a d e 的方法 本标准适用于各种婴幼儿配方食品和乳粉中维生素a d e 的测定 2 方 法提要 样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离 经 用 石油醚萃取后 用 高压液相色谱 紫外检测器定量测定 3 仪器 所有试剂 如未注明规格 均指分析纯 所有实验用水 如未注明其他要求 均指三级水 3 1 高峰氏淀粉酶 t a k a d i a s t a s e 3 2 异丙醇 色谱纯 3 3 焦性没食子酸的乙醇溶液 1 5 l 3 4 氢氧化钾溶液 质量比为1 0 0 5 0 3 5 石油醚 沸程3 0 6 0 3 6 甲醇 色谱纯 3 7 正己烷 色谱纯 3 8 环己烷 色谱纯 3 9 维生素a e 标准溶液 3 9 1 维生素a 标准贮备液 含维生素a 1 0 0 1 l g m l 的甲醇溶液 称取1 0 m g 的维生素a 用甲醇定容于1 0 0 m l 容量瓶中 3 9 2 维生素e 标准贮备液 含维生素e 4 0 0 1 t g m l 的甲醇溶液 称取4 0 m g 的维生素e 用甲醇定容于1 0 0 m l 容量瓶中 3 9 3 维生素a e 标准工作液 其中维生素a 的浓度为2 p 咖l 维生素e 的浓 度为2 0 p g m l 取l m l 维生素a 标准贮备液 3 9 1 和2 5 m l 维生素e 标准贮备液 3 9 2 于 3 7 山东大学硕士学位论文 5 0 m l 容量瓶中 用甲醇溶解 3 1 0 维生素d 标准溶液 3 1 0 1 维生素d 标准贮备液 含维生素d 1 0 0 9 9 m l 的甲醇溶液 称取1 0 m g 的维生素d 用甲醇定容于1 0 0 m l 容量瓶中 3 1 0 2 维生素d 标准贮备液 含维生素d 1 0 0 i i 的甲醇溶液 33 9 m l 称取1 0 m g 的维生素d 用甲醇定容于1 0 0 m l 容量瓶中 3 3 1 0 3 维生素d 标准工作液 其中维生素d 维生素d 0 0 质量浓度均为l g g m l 取维生素d 标准贮备液1 m l 维生素d 标准贮备液1 m l 于1 0 0 m l 容量瓶中 用甲 醇定容 4 仪器 常用实验室仪器及 4 1 平底烧瓶 2 5 0 m l 4 2 分液漏斗 5 0 0 m l 4 3 旋转蒸发器 4 4 高压液相色谱仪 具有可变波长的紫外检测器 数据处理系统或记录仪 5 操作步骤 5 1 样品处理 5 1 1 含淀粉的样品 准确称取1 0 9 样品 放a 2 5 0 m l 平底烧瓶中 加入l g t a k a 淀粉酶 3 1 再加入 3 0 m l a 5 5 0 c 的蒸馏水 混合均匀后 用氮气排除瓶中空气 盖上瓶塞 置4 5 c 烘箱内3 0 m i n 5 1 2 不含淀粉的样品 准确称取l 吧样品 置于2 5 0 m l 平底烧瓶中 力1 3 0 m l 蒸馏水 5 2 测定液的制备 5 2 1 于上述处理的样品溶液中加入1 0 0 m l 的没食子酸乙醇溶液 3 3 充 分混匀后加5 0 m l 氢氧化钾溶液 3 4 在蒸汽浴上连续回流3 0 m i n 后 立刻冷 却到室温 5 2 2 将皂化液转入一5 0 0 l i l l 分液漏斗中 用1 0 0 m l 水分几次冲洗平底烧瓶 洗涤液并入分液漏斗中 山东大学硕士学位论文 5 2 3 于上述分液漏斗中 加入1 0 0 m l 石油醚 3 5 盖好瓶塞 倒置分液 漏斗并剧烈振摇1 m i n 在振摇过程中 注意释放瓶内压力 静置分层 将水相放 入另一5 0 0 m l 分液漏斗中 重复上述萃取过程二次 合并醚液到第一个分液漏斗 中 用蒸馏水洗该醚液至中性 通过无水硫酸钠过滤干燥 在4 0 c 和氮气流下 于旋转蒸发器上蒸至近干 绝不允许蒸干 后 用石油醚转移至1 0 m l 容量瓶中 定容 5 2 4 从上述容量瓶中取2 m l 石油醚溶液放入试管a 中 再取7 m l 石油醚溶液 放入另一试管b 中 分别用氮气将试管a 和b 中的石油醚吹干 石油醚溶液放于a 中 j 1 5 m l 甲醇 用来测定维生素a e 试管b 中力1 1 m l 正己烷 用来测定维生素 d 5 3 测定 5 3 1 维生素a 和e 的测定 5 3 1 1 仪器条件 色谱柱 2 5 m m 4 6 m m o d s 柱或具等同性能的色谱柱 流动相 甲醇 流速 1 0 m l m i n 灵敏度 0 0 0 5 a i 小f v 波长 维生素a 3 2 5 n m 维生素e 2 9 0 n m 5 3 1 2 注射5 0 1 t t l 维生素a e 标样 3 9 3 和5 0 p 讲品溶液 5 2 4 试管a 中 得到标样和样品溶液中维生素a 和e 的峰高或峰面积 5 3 2 维生素d 的测定 5 3 2 1 测定的制备 a 仪器条件 色谱柱 3 0 c m x 4 m m 硅胶柱 流动相 环己烷 3 7 与正己烷 3 8 按体积比1 1 混合 并按体积分数0 8 加入异丙醇 3 2 流速 l m l m i n 波长 2 6 5 n m 柱温 2 0 3 9 山东大学硕士学位论文 灵敏度 0 0 0 5 a v m v 注射体积 2 0 0 l b 注射5 0 此维生素d 标样和2 0 0 p 样品溶液 试管b 中 根据维生素d 标样保留 时间收集维生素d 于试管c 中 将试管c 用氮气吹干 准确 n h o 2 m l 甲醇 3 6 溶解 5 3 2 2 测定步骤 a 仪器条件 色谱柱 2 5 c m x 4 6 m m c 或具等同性能的色谱柱 1 8 流动相 甲醇 流速 l m l m i n 柱温 2 0 波长 2 6 5 n m 灵敏度 0 0 0 5 a v m v 注射体积 5 0 p l b 注射5 0 此维生素d 标准溶液 3 1 0 3 注射5 0 l 样品溶液 试管c 中 得到标准和样品溶液中维生素d 峰面积或峰高 6 分析结果的表述 样品中维生素a i u l o o g 样品中维生素e i u l o o g 样品中维生素d i u l o o g c s 蕊a s c s d 一 4 式中 c 卜进样液是维生素a e 或d 的质量浓度 p g m l m 一样品的质量 g a s 进样液中维生素a e 或d 的峰高 或峰面积 a 广标样中维生素a e 或d 的峰高 或峰面积 山东大学硕士学位论文 c s d 标样中维生素a e 或d 的质量浓度 j t g m l 计算结果精确至小数点后一位 7 允许差 同一样品的两次测定值之差 维生素a 不得超过两次测定平均值的5 维生素d 不得超过两次测定平均值的1 0 维生素e 不得超过两次测定平均值的5 4 1 山东大学硕士学位论文 附录二 图一对照组 3 1 图三中剂量 图二低剂量 图四高剂量 4 2 山东大学硕士学位论文 附录三 血清总胆固醇测定方法 检验原理 血清中的胆固醇约1 3 为游离胆固醇 2 3 为与脂肪酸结合的胆固醇酯 胆固醇 酯在胆固醇酯酶 c e h 的催化下 生成游离胆固醇和脂肪酸 胆固醇在胆固醇氧 化酶 c o d 的氧化下 生成 4 胆甾烯酮和h 2 0 2 h 2 0 2 再经过氧化物酶 p o d 催 化 使4 氨基安替吡啉与酚 三者合称p a p 反应 生成红色醌亚胺色素 t r i n d e r 反 应 醌亚胺的最大吸收在5 0 0 r i m 左右 吸光度与标本中胆固醇含量成正比 反 应式如下 胆固醇酯 h o 马胆固醇 脂肪酸 胆固醇 0 2 吗 4 一胆甾烯酮 h o 2 h 2 0 2 氨基安替吡啉 4 一氯酚 型 醌亚胺 4 h 2 0 试剂组成 试剂准备 1 样本为新鲜无溶血血清 2 取1 0 m l r 2 加入到1 瓶r 1 中 溶解后即为工作液 校准品放置室温融化 混 匀后使用 操作步骤 按试剂盒测定步骤进行 具体操作如下 4 3 山东大学硕士学位论文 分别混合均匀 3 7 下保温6m i n 于波长5 0 0n n l 处 lc m 光径比色杯 以试剂 空白管校零 分别读取a 标准和a 样品 计算 总胆固醇浓度 m m o l i l 慧燃 标准浓度 山东大学硕士学位论文 附录四 血清甘油三酯测定方法 检验原理 用脂蛋白脂酶 l p l 使血清中t g 水解为甘油和脂肪酸 将生成的甘油用甘油 激酶 g k 及三磷酸腺苷 a t p 磷酸化 以磷酸甘油氧化酶 g p o 氧化甘油 3 磷酸 产生磷酸二羟丙酮和过氧化氢 h 2 0 2 h 2 0 2 再经过氧化物酶 p o d 4 一氨基安替 吡啉 4 a a p 与4 氯酚 三者合称p a p 反应 生成红色醌亚胺色素 醌亚胺的最 大吸收在5 0 0 r i m 左右 吸光度与标本中甘油三酯的含量成正比 反应式如下 甘油三酯 3 h o 生 b 甘油 3 脂肪酸 甘油 a t p 旦b 甘油一3 一磷酸 a d p 甘油一3 一磷酸 0 2 2 h 2 0 鱼 斗磷酸二羟丙酮 2 h 2 0 2 h 2 0 2 4 一氨基安替吡啉 4 一氯酚 堕屿醌亚胺 2 h 2 0 h c i 试剂组成 试剂准备 1 样本为新鲜无溶血血清 2 取1 0 m l r l 加入到一瓶l 也中 溶解后即为工作液 标准品开口即可使用 4 5 山东大学硕士学位论文 操作步骤 按试剂盒测定步骤进行 具体操作如下 分别混合均匀 3 7 下保温1 0 分钟 于波长5 0 0 n m 处 1 c m 光径比色杯 以试剂 空白管校零 分别读取a 标准和a 样品 计算 甘油三酯浓度 m m o l l 慧麟x 标准浓度 山东大学硕士学位论文 附录五 血清高密度脂蛋白胆固醇测定方法 检验原理 在镁离子的存在下 磷钨酸 p 1 a 能选择性沉淀血清中低密度脂蛋i 刍 l d l 及极低密度脂蛋i 刍 v l d l 等 离心后上清液仅含高密度脂蛋i 刍 h d l h d l 中 的胆固醇酯被胆固醇酯酶 c e h 水解成游离胆固醇 后者被胆固醇氧化酶 c o d 氧化成 4 胆甾烯酮 并产生过氧化氢 h 2 0 2 h 2 0 2 再经过氧化物酶 p o d 4 氨基安替吡啉与酚反应 生成红色醌亚胺色素 醌亚胺的最大吸收在5 0 0 n m 左 右 吸光度与标本中胆固醇含量成正比 反应式如下 胆固醇酯 h o 马胆固醇 脂肪酸 胆固醇 0 2 马 4 一胆甾烯酮 h 2 0 2 2 h 2 0 2 氨基安替吡啉 4 一氯酚 马醌亚胺 4 h 2 0 试剂组成 试剂准备 1 样本为新鲜无溶血血清 2 工作液配制 取1 0 m l r 2 加入到一瓶r 1 中 溶解后即为工作液 3 上清液制备 将血清与沉淀剂以1 l 混合 室温放置2 0 分钟 放置时间不得 超过1 小时 3 0 0 0 转 分离心1 5 分钟 吸取上清液用作胆固醇测定 4 7 山东大学硕士学位论文 一 操作步骤 按试剂盒测定步骤进行 具体操作如下 空白管 标准管样品管 一 工作液 1 o m l 1 0 m l 1 0 m l 蒸馏水 2 5m 标准 2 5 山 样品 一 2 5 山 分别混合均匀 3 7 下保温l om i n t 波长5 0 0n m 处 1c m 光径比色杯 以试剂 空白管校零 分别读取a 标准和a 样品 计算 高密度脂蛋白胆固醇浓度 m m o l l 蒹黼 标准浓度 4 8 山东大学硕士学位论文 参考文献 1 巫志峰 李鹏 许舜军 等 不同产地牡丹皮提取物的降血脂作用研究 j 时 珍国医国药 2 0 0 8 1 9 1 2 2 9 6 2 2 9 6 3 2 李方军 牡丹皮化学成分及药理作用研究进展 j 安徽医药 2 0 0 4 8 9 1 0 3 易军鹏 朱文学 马海乐 等 牡丹籽的化学成分研究 j 天然产物研究与 开发 2 0 0 9 21 4 6 0 4 6 0 9 4 戴敏 李后开 丹皮酚对动脉粥样硬化家兔血管平滑肌细胞增殖的影响 j 中国药理学通报 2 0 0 6 2 2 5 5 8 7 5 范俊安 夏永鹏 申明亮 等 近1 5 年牡丹皮研究文献分析 j 中国中医药 信息杂志 2 0 0 6 1 3 6 1 0 3 6 张健萍 李连珍 赵红江 等 牡丹皮的化学成分 药理作用及临床应用研 究概况 j 中华中医药杂志 2 0 0 6 2 1 5 2 9 5 7 李向阳 屠万倩 张留记 r p h p l c 法测定不同产地的牡丹皮中芍药苷和 丹皮酚的含量 j 中药新药与临床药理 2 0 11 2 2 5 5 6 3 5 6 5 8 戚军超 周海梅 马锦旗琦 等 牡丹籽油化学成分分析g c m s 分析 j 粮 食与油脂 2 0 0 5 1 1 2 2 2 3 9 易军鹏 朱文学 马海乐 等 牡丹籽的化学成分研究 j 天然产物研究与 开发 2 0 0 9 2 1 6 0 4 6 0 7 10 了 d y e r b e r g h 0 b a n g a n dn h j o m e f a t t ya c i dc o m p o s i t i o no ft h ep l a s m a l i p i d si ng r e e n l a n de s k i m o s j t h ea m e r i c a nj o u r n a lo fc l i n i c a ln u t r i t i o n19 7 5 2 8 9 5 8 9 6 6 1 1 周兴 林成仁 饶琳 等 n 一3 多烯脂肪酸对血脂影响到实验 中国中医基础 医学杂志 1 9 9 7 3 4 2 9 3 1 1 2 肖颖 王军波 梁学军 等 富含单不饱和脂肪酸的坚果对高脂大鼠血脂水 平的影响 j 卫生研究 2 0 0 3 3 2 3 1 2 0 1 2 2 1 3 肖颖 王军波 梁学军 等 富含单不饱和脂肪酸的坚果对高脂血症患者血 脂水平的影响 j 中国公共卫生 2 0 0 2 1 8 3 9 3 1 1 9 3 4 1 4 陈小燕 周智广 唐炜立 等 维生素e 对新诊2 型糖尿病亚临床动脉粥样硬 4 0 山东大学硕士学位论文 化发生的影响 j 中国循证医学杂志 2 0 0 4 4 7 4 6 0 4 6 3 15 c l a r k em w b u r n e rj r c r o f tk d v i t a m i nei nh u m a nh e a l t ha n dd i s e a s e j c r i tr e vc l i nl a bs c i2 0 0 8 4 5 4 17 4 5 0 16 r i m me b s t a m p f e rm j a s c h e r i oa g i o v a n n u c c ie c o l d i t zg a w i l i e rw c v i t a m i nec o n s u m p t i o na n dt h er i s ko fc o r o n a r yh e a r td i s e a s ei nm e n j ne n g lj m e d1 9 9 3 3 2 8 1 4 5 0 1 4 5 6 17 l e ei m c o o kn r g a z i a n oj m g o r d o nd r i d k e rp m m a n s o nj e c ta 1 v i t a m i nei nt h ep r i m a r yp r e v e n t i o no fc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s ea n dc a n c e r t h e w o m e n sh e a l t hs t u d y ar a n d o m i z e dc o n t r o l l e dt r i a l j j a m a2