从自然界筛选产乳酸微生物及菌种初步鉴定的毕业论文.doc

哈尔滨商业大学毕业设计（论文）从自然界筛选产乳酸微生物及菌种初步鉴定的毕业论文目 录摘要IAbstractII1 绪 论11.1 乳酸菌的概述1 1.2 乳酸菌的基本属性1 1.3 乳酸菌的发展时期及分类21.3.1 乳酸菌的发展时期21.3.2 乳酸菌的分类21.4 乳酸菌的发酵特性21.5 乳酸菌的应用31.5.1 乳酸菌在食品领域的应用31.5.2 乳酸菌制剂41.6 乳酸菌的生理作用和作用机理41.6.1 乳酸菌的生理作用41.6.2 乳酸菌的作用机理51.7 乳酸菌的国内外发展现状61.7.1 乳酸菌的发展历史61.7.2 乳酸菌的发展现状71.8 乳酸的生产及应用71.8.1 乳酸的概述71.8.2 L乳酸的生产81.8.3 乳酸提取工艺101.9 本课题的目的及研究的意义122 实验部分132.1 实验材料与仪器132.1.1 实验材料132.1.2 实验仪器132.1.3 实验试剂142.1.4 实验培养基142.2 实验方法152.2.1 从自制酸菜汁中分离提纯乳酸菌的思路和原理152.2.2 培养条件152.2.3 菌种储藏152.2.4 样品采集152.2.5 乳酸菌的分离和筛选162.2.6 乳酸菌的产酸定性定量试验162.2.7 乳酸菌的生理生化鉴定173 结果与讨论183.1 乳酸菌的形态学鉴定183.1.1 初步分离183.1.2 乳酸菌的复筛183.1.3 菌株形态193.2 乳酸菌的产酸定性定量试验203.2.1 菌株产乳酸试验203.2.2 乳酸定量试验203.3 乳酸菌的生长过程鉴定213.2.1 乳酸菌在37恒温培养pH值变化213.2.2 菌株最适生长起始pH值的确定213.2.3 乳酸菌株耐盐性的确定223.2.4 乳酸菌的不同温度生长鉴定233.3 乳酸菌的生理生化鉴定25结 论28参考文献29致谢31 绪 论1.1 乳酸菌的概述乳酸菌是对能利用可发酵碳水化合物产生出大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。自然界中乳酸菌分布十分广泛，可以存活在各种动物的消化道及其其他器官里。在乳制品、发酵植物食品、自然界的湖泊和泥土都有所发现。人们常常利用乳酸菌产酸等特性来处理和加工食品，延长食物的储存时间和提高食品的适口性。乳酸菌从发现、分离到分类体系的建立，经过了大约一个世纪。目前，在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上至少可划分成 23 个属，共有200多种。涉及到的有关属则更多，有的只是某些属中的少数成员。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。 而人体肠道内乳酸菌拥有的数量，与人类年龄成倒数增长曲线。在平时，健康人比病人多50倍，长寿老人比普通老人多60倍。当人到老年或生病时，乳酸菌数量可能下降100至1000倍，直到老年人临终完全消失。因此，人体内乳酸菌数量的实际状况，已经成为检验人们是否健康长寿的重要指标。现在，由于抗菌素的广泛应用，使人体肠道内以乳酸菌为主的益生菌遭受到严重破坏，抵抗力下降，健康受到极大的威胁。所以，增加人体肠道内乳酸菌的数量就是明智之举。人体肠道内以乳酸菌为代表的益生菌数量越多越好。也完全符合诺贝尔得奖者生物学家梅契尼柯夫“长寿学说”里所得出的结论：乳酸菌=益生菌=长寿菌。 在面对抗生素的日渐无能为力的现状，不断寻求新的更加有效的生物抗菌产品是正确选择。瑞典科学家研究发布的结果：治疗胃和大肠炎症时直接喝乳酸菌比用抗生素更好，危险性基本没有。而在日本，乳酸菌制品占据日本乳制品市场的85%以上，二十年来研究记录表明日本青年平均身高增加15厘米，平均寿命达85岁，居世界第一位。这是乳酸菌制品所带来的直接健康功效。1.2 乳酸菌的基本属性乳酸菌具有的基本特点为:革兰氏阳性细胞; 菌体常排列成链，乳酸链球菌族，菌体球状，通常成对或成链；乳酸杆菌族，菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分枝; 过氧化氢酶反应为阳性; 消耗的葡萄糖50%以上并且产生乳酸; 不形成芽孢; 极少运动或者不运动; 可以分解蛋白质, 不产生腐败产物; 可以分解脂肪但是能力较弱。乳酸菌所属界：细菌界（Bacteria），所属门：厚壁菌门（Firmicutes），所属纲：芽孢杆菌纲（Bacilli），所属目：乳杆菌目(Lactobacillales),所属科：乳杆菌科(Lactobacillaceae),所属属：乳杆菌属(Lactobacillus)；肠球菌属(Enterococcus Thiercelin and Jouhaud)1. 在固体培养基上菌落较小，生长缓慢。在液体发酵培养基内可以很快的生长，离心洗涤可以获得纯度较高的菌体且兼具需氧和厌氧的性能。多数不运动，少数以鞭毛运动。有的也连消化驱动。1.3 乳酸菌的发展时期及分类1.3.1 乳酸菌的发展时期乳酸茵的分类也经历了四个主要的发展时期，分别是经典分类时期和化学分类时期、数值分类时期、分子分类时期2。1.3.2 乳酸菌的分类乳酸菌根据来源大体上可分为两类。一类是植物源乳酸菌，一类是动物源乳酸菌。植物源乳酸菌，因为取自植物，摄取的量不易受限制，人体不会产生异体蛋白排斥反应，并且植物源乳酸菌比动物源者更具有活力，能比动物源乳酸菌多数倍的数量到达人体小肠内定植，从而发挥乳酸菌稳定的生物功效。因为动物源取自动物，菌种相对于植物源不稳定，生物功效也较不稳定，在大量摄取后，较容易导致人排斥反应。目前对乳酸菌的分类鉴定，是以表型特征和生物学特性为依据来判定其归属。这种分类鉴定方法也有其局限性，这种方法耗时耗力，培养条件的改变可能会导致结果发生变化，并且仅依靠主观选择的特征，很难对某些区别不明显的生理生化特性的乳酸菌进行有效的区分3。因此随着分子生物学同其相关技术的发展，分子标记技术可以快速、准确、灵敏的分类并且鉴定乳酸菌。1.4 乳酸菌的发酵特性 乳酸菌作为化能异养型微生物, 代谢活动需要单糖, 尤其是葡萄糖, 经发酵作用将单糖转变为低分子的乳酸和其它有机酸,获取能量4。乳酸菌的发酵作用根据代谢途径不同和产物的差异, 可以划分为异型乳酸发酵和同型乳酸发酵。 同型乳酸发酵: 葡萄糖经糖酵解途径几乎变成100%的乳酸。如链球菌、片球菌和部分乳杆菌等。 葡萄糖通过糖酵解途径转化为两个乳酸。 异型乳酸发酵: 葡萄糖的分解完全依赖磷酸戊糖途径转变为乳酸和其它产物, 根据产物不同, 又有两种类型:第一、明串珠菌和部分乳杆菌将葡萄糖转变为乳酸、乙醇和二氧化碳。葡萄糖通过磷酸戊糖途径转化为乳酸和乙醇和二氧化碳。 第二、双歧杆菌将1mol 葡萄糖转变成1mol乳酸和1. 5mol 乙酸。 两个葡萄糖通过磷酸戊糖途径转化为两个乳酸和三个乙酸。1.5 乳酸菌的应用1.5.1 乳酸菌在食品领域的应用人类对于乳酸菌的应用可以追溯到远古时代，那时候人类就在酿造和食品方面利用了乳酸菌。人类研究和掌握乳酸菌的生长规律，并加以利用。乳酸菌能够赋予食品柔和的香味和酸甜的口感，可以改善食物的品质和营养，还具有抗菌、抗肿瘤、抗变异原和降低胆固醇、维持微生态环境、增强免疫力等生物学功能，被广泛的应用在食品工业领域中5。在酸乳制品中的应用，是将乳酸菌纯种培养活化后制成乳酸菌发酵剂，再添加于经过灭菌处理的鲜乳或者复原乳中，在4045度下发酵获得终产物常用的发酵剂为嗜酸链球菌、保加利亚乳杆菌嗜热链球菌。经乳酸菌发酵的乳酸菌奶酪蛋白及乳脂被转化为短肽、氨基酸和小分子的游离脂类等，更易被人体吸收。乳酸与钙结合形成乳酸钙，极易被人体吸收，也可被乳糖不耐症人群选用。乳酸菌奶促进消化，促进胃液分泌，对胃具有保养功能，能抑制肠道内腐败菌的生长，其生物保健价值远远高于牛奶。 在酿造业中的应用，是通过乳酸菌产生的乳酸与乙醇酯化生成乳酸乙酯，提高白酒的质量及口感，也可以改善葡萄酒的风味。乳酸菌产生的乳酸是一种呈香物质，可伊提高产品酸度，又可改善风味并且提高产品质量。在发酵肉制品中的应用，是通过发酵产生乳酸降低pH值，从而抑制肉毒杆菌及其它病原微生物的生长繁殖或产生毒素，减少了腐败。还可以促进亚硝酸盐的分解，形成稳定的亚硝基肌红蛋白，促进发色和减少致癌物质一亚硝胺产生；使肌肉蛋白变性形成胶状组织，增加肉块间的结合力，可以提高制品的硬度和弹性。在发酵果蔬制品中乳酸菌的应用，是通过同型或异型发酵，产生乳酸、醋酸、丙酸等有机酸，这些酸赋予发酵果蔬制品柔和的酸味；同时产生的微量双乙酰赋予制品奶油香味；产生的2一庚酮、2一壬酮对爽口、清香有一定作用；低级饱和脂肪酸与脂肪醇所形成的酯类具有水果香味。在饲料中添加乳酸菌，不仅可以提高蛋雏鸡成活率和日增重，还可以使断乳后仔犬体重显著增加，因此显著提高饲料利用率。1.5.2 乳酸菌制剂 利用现代生物技术，发酵生产的具有活性的乳酸菌制剂，是安全、高效的动物保健制剂，目前已经投入广泛应用固体发酵和液体发酵的两类活菌制剂。克服了死的菌体及代谢产物效果不确切的弊端，为动物保健及食品安全保障提供了动力7。1.5.2.1 固态发酵制剂应用移动发酵技术、多菌种复合保质技术、高负压吸真空技术，好氧厌氧分阶段发酵技术，使发酵产品在潮湿状态保质期达到18个月以上，保证了乳酸菌的活性。1.5.2.2 液态发酵制剂为养殖场提供小型全自动乳酸菌发酵罐，并提供菌种、培养基，由养殖场自行发酵，随用随饮，保证了乳酸菌的活性。1.6 乳酸菌的生理作用和作用机理1.6.1 乳酸菌的生理作用1、防治有些人种普遍患有的乳糖不耐症（喝鲜奶时出现的腹胀、腹泻等症状）。2、促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收，产生维生素B族等大量有益物质。3、抑制腐败菌的繁殖，消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾。4、使肠道菌群的构成发生有益变化，改善人体胃肠道功能，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康。5、抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压作用。6、抗肿瘤、预防癌症作用。7、免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力。8、有效预防女性泌尿生殖系统细菌感染。9、提高SOD酶活力，消除人体自由基，具抗衰老、延年益寿作用。 10、控制人体内毒素水平，保护肝脏并增强肝脏的解毒、排毒功能8。1.6.2 乳酸菌的作用机理 通过对大量资料的研究，我们得以知道，乳酸菌有一下功能：调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，促进动物生长，从而改善胃肠道功能；抑制肠道内腐败菌生长；提高机体免疫力提高食物消化率和生物效价；降低血清胆固醇，控制内毒素等。乳酸菌通过发酵产生的有机酸、特殊酶系、酸菌素等物质。这些物质具有特殊生理功能。它们可以刺激组织发育，对机体的免疫反应和应激反应、营养状态、生理功能等产生作用10。第一，提供营养物质，促进机体生长。乳酸菌可以通过挥代谢活性，为宿主提供可利用的必需氨基酸、各种维生素（维生素B族和K等)，还可提高矿物元素的生物活性，进而达到为宿主提供必需营养物质、增强动物的营养代谢、直接促其生长的作用。Dalmin等(2001)研究报道乳酸菌可以改良水质，提高斑节对虾的存活率、生长速率和健康状况。Hamad(1979)试验证明，小麦、稻米等谷物用乳酸菌发酵后，营养价值大大提高。此外，乳酸菌产生的酸性代谢产物使肠道环境偏酸性，而一般消化酶的最适PH值为偏酸性(淀粉酶6.5、糖化酶4.4)，这样就有利于营养素的消化吸收。何机峻的产生还可加强肠道的蠕动和分泌，也可促进消化吸收养分。第二、改善胃肠道功能，维持肠道菌群平衡动物的整个消化道在正常情况下都寄生有大量微生物。就其作用而言，可分乃三类：共生性类型，主要是兼性厌氧菌，在生态平衡时，它们的维生素和蛋白质合成、消化吸收、生物拮抗和免疫等功能对宿主有利。致病性类型，正常情况下数量少，寄生于正常部位，不至于使宿主发病。若失控，则会导致宿主的不良反应。中间性类型，即同时具有生理和致病两种作用。微生物群的平衡，对机体的健康十分重要，而乳酸菌就能够调节这种微生态平衡，保障宿主正常生理状态。乳酸菌是肠道常在菌（常生菌），畜禽服用乳酸菌后，可以改变肠道内环境，抑制有害菌繁殖，调整胃肠道菌群平衡。乳酸菌通过粘附素与肠粘膜细胞紧密结合，在肠粘膜表面定植占位，成为生理屏障的主要组成部分，从而达到恢复宿主抵抗力，修复肠道菌群屏障、治愈肠道疾病的作用。如果这个屏障遭到抗生素或其他因素的破坏，宿土丧失了对外来菌抵抗力，会使具有耐药性的肠内菌异常增殖而取代优势菌的位置，造成肠道内微生态平衡的失调。第三、改善免疫能力乳酸杆菌和双歧杆菌一方面能明显激活巨噬细胞的吞噬作用，另一方面由于它能在肠道定植，相当于天然自动免疫。它们还能刺激腹膜巨噬细胞、诱导产生干扰素、促进细胞分裂、产生抗体及促进细胞免疫等，所以能增强机体的非特异性和特异性免疫反应，提高机体的抗病能力。Pergidon等(1988)报道，口服乳酸菌后，对巨璇细胞的半乳糖甙酶活性、巨噬细胞的吞噬活性等具有显著的激活和促进作用。当异物侵入机体时，免疫细胞被乳酸菌激活，增强了机体对异物产生抗体的作用。Chndra(1984)认为，乳酸菌之所以具有有激机体产生抗体的作用，是由于菌体通过淋巴结、粘膜刺激淋巴细胞接受刺激的淋巴细胞再通过肠系膜淋巴结(MIN)循环到血流中，并分布全身，从而调节机体的免疫应笞。第四、抗菌作用研究资料表明：乳酸菌对一些腐败菌和低温细菌有较好的抑制作用。可用于防治腹泻、下痢、肠炎、便秘和由于肠道功能紊乱引起的多种疾病以及皮肤炎症。其抗菌机制主要表现在以下几个方面：产生的乳酸等有机酸能显著降低环境pH值和Eh(氧化还原电位)值，使肠内处于酸性环境，对于致病菌如痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、弯曲杆菌、葡萄球蔺等有拮抗作用；产生的过氧化氢能够激活牛乳中的“过氧化氢酶-硫氰酸”系统，抑制和杀灭革兰氏阴性菌、过氧化氢酶阳性细菌如假单胞菌属、大肠杆菌类和沙门氏菌属等；产生类似细菌素的细小蛋白质或肽类（抗菌肽），如各种乳酸杆菌素和双歧菌素，对葡萄球菌、梭状芽孢杆阔以及沙门氏菌和志贺氏菌有拮抗作用。另外，双歧杆菌等还可将结合的胆酸分解为游离的肌酸，后者对细菌的抑制作用比前者更强。1.7 乳酸菌的国内外发展现状1.7.1 乳酸菌的发展历史早在五千年前，人类就已经在使用乳酸菌。到目前为止，人类日常食用的酸奶、泡菜、调味品酱油等，都是应用乳酸菌这种原始而简单的又容易得到的天然发酵的代谢产物13。早在20世纪初，俄国著名的生物学家，诺贝尔奖获得者梅契尼柯夫（Mechnikoff,1845-1916），在他的“长寿学说”里已明确指出，保加利亚的巴尔干岛地区居民，日常生活中经常饮用的酸奶中含有大量的乳酸菌，这些乳酸菌能够定植在人体内，有效地抑制有害菌的生长，减少由于肠道内有害菌产生的毒素对整个机体的毒害，这是保加利亚地区居民长寿的重要原因。这个具有划时代意义的“长寿学说”，为人类利用乳酸菌生产健康食品开创了新纪元。今天，利用乳酸菌生产的健康食品已经一跃成为全世界关注的健康食品。1.7.2 乳酸菌的发展现状在发酵型乳酸菌奶饮品已有上百年历史的欧美国家，发酵型乳酸菌奶饮料在乳制品市场的比例高达80%。随着消费者健康意识的提高，中国乳酸菌市场发展迅猛，目前产业规模已经超过200亿元人民币，中国的乳酸菌产业正处于快速发展期,正以每年25%的速度递增。中国乳酸菌奶饮品的年总产量已突破100万吨。随着消费者的需求增长，继世界最大的乳酸菌饮品养乐多进入中国后，国内乳品企业也开始发力乳酸菌产品市场。未来五年将是中国乳酸菌行业快速发展的黄金时期。1.8 乳酸的生产及应用 1.8.1 乳酸的概述 乳酸又名丙醇酸或-羟基丙酸（2-hydroxypropanoic acid），分子式CH3CHOHCOOH，是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人体，动植物，微生物中，因含有不对称C原子，而具有光学异构现象。分为L型，D型，外消旋体的DL型。易溶于水，乙醇和甘油，微溶于乙醚，但不溶于氯仿，苯，汽油，二硫化碳等。外消旋体为无色糖浆状液体或晶体，无臭，有酸味，有吸湿性，光学性不活泼，在极冷条件下也不凝固，相对密度为1.4392（2040）。熔点18，沸点122。有防止腐败发酵的作用，不侵犯健全的组织，但对病变组织敏感18。自从1780年Scheele发现乳酸以来，乳酸及其衍生物，广泛的应用于食品医药、饲料、化工等领域。由于人体只能吸收L乳酸，过多地食用D乳酸或DL乳酸可导致人体代谢功能的紊乱，因此世界卫生组织（WHO）限制成人每天摄入 D乳酸不得超过100mg/kg.而对L乳酸则不加限制。L乳酸是世界公认的三大有机酸之一，其最具应用潜力的是生产聚乳酸( PLA)。PLA除具有和聚苯乙烯相似的光泽度及加工性能外，还可以生物降解，可替代化工合成包装材料，消除白色污染，由于PLA具有良好的生物相容性，可广泛应用于医用材料，如药物缓释材料、组织工作材料、手术缝合线、骨折固定等， 被认为是最具发展前途的生物可降解材料，其市场潜力巨大，发展前景十分诱人。1.8.2 L乳酸的生产1.8.2.1 化学合成法化学合成法包括乳腈法和丙烯腈法两种。乳腈法是将乙醛和冷却的氢氰酸连续送入反应器生产乳腈，再用泵将所得乳腈加入水解釜中，注入硫酸和水，使乳腈水解得到粗乳酸，将粗乳酸送入酯化釜，加入乙醇酯化生成乳酸酯，经精馏，再送入分解浓缩罐内热分解得精乳酸。美国的斯特林化学公司和日本的武藏野化学公司之前均采用化学合成法19。 丙烯腈法是将丙烯腈和硫酸送入反应器中，生成粗乳酸和硫酸氢铵的馄合物，再把混合物送入酯化反应器中与甲醇反应生成乳酸甲酯，把硫酸氢铵分出后，粗酯送入蒸馏塔，塔底获精酯，将精酯送入第二蒸馏塔，加热分解，塔底得稀乳酸，经真空浓缩得产品。化学合成法中采用较多的是乳腈法。该法可连续生产，生产成本低，能耗低，但由于该法所用的原料为乙醛和剧毒的氢氰酸，致使生产的乳酸食用较难为人们所接受，因此，应用受到一定的限制。 1.8.2.2 酶法 (1) 氯丙酸酶法转化日本东京大学的本崎等，研究了用酶法催化合成乳酸，分别从恶臭甲单孢菌和假单孢菌的细胞中提取纯化了L2一卤代酸脱卤酶和DL2卤代酸脱卤酶，作用于底物DL2氯丙酸，制得L乳酸或D乳酸。L2卤代酸脱卤酶催化 L2卤代酸脱卤；而DL2卤代酸脱卤酶既可催化L2卤代酸脱卤，又可催化D2卤代酸脱卤，在催化时可发生构型转变。 (2)丙酮酸酶法转化Hummel等人从D乳酸脱氢酶活力最高的混乱乳杆菌DSM20196菌体中得到了D乳酸脱氢酶，以无旋光性的丙酮酸为底物制得到D乳酸。 1.8.2.3 微生物发酵法由于化学合成法所使用的原料有乙醛和剧毒物质氢氰酸，因而合成法生产乳酸大大受到限制，在食品工业中使用也不被民众接受，此外其生产成本也较高。酶法生产乳酸虽然可以专一性旋光乳酸，但工艺比较复杂，应用到工业上还有待于进一步研究。微生物发酵法生产乳酸，可通过菌种选育和培养条件的选择而得到具有专一性的L乳酸，D乳酸或 DL乳酸，完全可以满足聚乳酸的生产需求。微生物发酵法生产乳酸因其原料来源广泛，生产成本也较低，产品光学纯度高和安全可靠性好等优点而成为目前国内外生产乳酸的主要方法。在乳酸发酵工艺上除了可采用根霉生产L乳酸外，目前国内外都展开了对细菌发酵生产 L乳酸的研究。原因在于虽然根霉发酵产乳酸存在对营养要求简单，可以直接利用大量廉价原料以及能够得到光学纯度很高的L乳酸等优点，但也存在产酸，对糖利用率都较低，发酵需要通氧，能耗大，时间长，副产物多等缺点，而细菌厌氧发酵虽然存在营养要求高，原料成本高等缺点，但有产酸量大，发酵时间短，无需通氧，能耗低，对糖的转化率较高，理论上可达100%等优点而同样受到研究人员的青睐，。Zhang等研究了食淀粉乳杆菌NRRL B 4542直接从淀粉发酵生产 L乳酸的条件，淀粉的起始浓度为120 gL，从液化淀粉出发，可在20h生产出浓度为96.2 gL的乳酸。Hujanen等对干酪乳杆菌NRRL B441产L乳酸进行优化， 在葡萄糖浓度为160gL时， 乳酸浓度最高可达到118.6gL，他们采用廉价的大麦芽提取物加少量酵母膏(4gL) 取代单独使用酵母膏( 22gL )，较大的节省了生产成本。最近几年来芽孢杆菌发酵生产乳酸受到人们的关注。Danner等采用嗜热脂肪芽孢杆菌菌株FA6和IFA9，以葡萄糖为碳源，分批培养发酵生产L乳酸， 糖的转化率分别为84.0和98.7。Poyat等报道：筛选得到能在52生长的一株凝结芽孢杆菌TB04，能在培养基不灭菌的条件下发酵生产乳酸，经发酵条件的优化，乳酸的最终浓度55gL，糖的转化率为92。路福平等发表了芽孢乳酸菌凝结芽孢杆菌TQ33的筛选及产酸条件的研究结果，其最适生长温度4550，厌氧条件下，以葡萄糖为碳源发酵L乳酸，72h产酸量最高达到 67.8 gL，其中L乳酸含量占96以上。1.8.2.4发酵中和剂新兴的发酵工艺如提取与发酵相偶联的原位分离ISPR技术等，发酵的同时提取乳酸，减轻产物抑制，又不产生废弃副产物，但对设备要求较高，工艺复杂，设备投资大，因此对成熟低成本的传统发酵工艺进行改进后仍可在现阶段继续用于生产。传统乳酸发酵常用中和剂消除终产物乳酸的抑制，如碳酸钙，氢氧化钙，氨水，氢氧化钠等。其中碳酸钙成本低，简单易用，应用广泛，但最终会产生硫酸钙对环境不利；氢氧化钙则难于添加且不利于局部pH控制，最终也产生硫酸钙因此应用不多；氨水不产生副产物，容易控制，但发酵存在糖酸转化率偏低，发酵残糖偏高等缺点；应用氢氧化钠则成本偏高，菌体活性较差。1.8.3 乳酸提取工艺L乳酸发酵液的成分复杂，除L乳酸外，还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、胶体、有机杂酸、无机盐等，所以L乳酸的提取比较复杂。常用的方法有如下几种。1.8.3.1钙盐法乳酸钙结晶酸解工艺是传统的分离方法。其流程见图4图 4 乳酸钙 结晶一酸解工艺流程图该工艺虽具有易于控制、工艺成熟的优点，但其流程长，硫酸及活性炭的用量大，副产物量大，劳动强度高，不能有效分离残糖，且产品收取率低。也有浓缩液不结晶而直接用硫酸酸解乳酸钙提取乳酸的工艺。 1.8.3.2萃取法萃取法是使用不溶或微溶于水的有机溶剂，通过物理或化学萃取方式从粗乳酸中提取乳酸， 然后再反萃取，把乳酸从萃取相中分离出来。萃取法不用石灰或石灰石和硫酸，所以不产生CaSO4废渣，有利于环境保护，操作简便, 占地面积少, 对设备腐蚀性小, 无细菌污染和操作过程可自动化等优点。应用萃取法的关键是寻找高效、无毒、水溶性小、经济可行的萃取剂。用于乳酸萃取效果较好的载体为一种水不溶性的长链叔胺, 并将载体溶于油醇后去萃取乳酸, 于是载体与乳酸形成乳酸胺络合物, 后被有机相萃取分离, 再经反萃取, 即可获得纯净的稀乳酸液, 浓缩蒸发后即为成品 L乳酸。近年来，国内外开发出许多新的萃取技术，如双水相萃取、膜萃取和超临界萃取等。1.8.3.3酯化法经钙盐法提取的乳酸不能满足一些对乳酸有耐热性要求的工业用途, 如用于聚合物工业、焙烤食品以及其他一些附加值高的乳酸产品。将钙盐法提取后的乳酸产品在高温条件下进一步同乙醇或甲醇反应, 产生乳酸乙酯或甲酯, 再蒸馏分离出乳酸酯, 然后水解乳酸酯、提纯回收乳酸, 水解时释放出的醇则可重复利用。稀乳酸经浓缩蒸发就可制成高纯度、 耐热性好的乳酸, 日本武藏野公司已成功将该法运用于 L乳酸的工业生产中,该方法缺点是能耗较高, 装备的投资也较大。 1.8.3.4吸附法离子交换树脂、活性炭和聚乙烯吡啶都被用作吸附剂，不过活性炭吸附容量小，选择性差， 重复性差，而离子交换树脂选择性高、交换容量大、操作简单、易于自动控制。吸附法的缺点在于不具备高度专一性，且脱附困难。 1.8.3.5分子蒸馏法分子蒸馏属于高真空蒸馏技术，它克服了常规蒸馏分离效率低、操作温度高、受热时间长导致有效成分的聚合、分解等缺点，特别适合于高沸点、热敏性及易氧化物质的分离。通过分子蒸馏提纯L乳酸，可以达到蛋白质、重金属离子清除、脱臭、脱色、提纯等目的，得到的乳酸也具有较好的耐热性。1.8.3.6电渗析法电渗析技术不仅可以用于偶联发酵，也可单独用于发酵液分离提纯乳酸。电渗析法是在离子交换技术与膜技术基础上发展起来的一种新的分离提纯技术。欧美率先将该技术运用于 L乳酸等有机酸的提取,在 L乳酸的提取过程中使用单极电渗析的目的是分离电解质和非电解质; 浓缩乳酸盐, 用双极电渗析的目的是最终将乳酸盐变成高纯度的乳酸 ,并回收碱回用到发酵罐中调 pH值。该技术的最大优点是分离提纯效果好、 回收率高、 产品质量好 ,其缺点是能耗高 ,可以说是极具前景的方法。目前采用该技术的最大困难是日本和美国垄断了离子交换膜 ,特别是双极膜的生产技术 ,将装备的售价提得较高。1.9 本课题的目的及研究的意义乳酸菌作为一种绝大多数为益生菌的菌种对人类的健康起着重要作用，而选育出优良的乳酸菌菌株对生产有特殊的意义，能够更突出的表现出乳酸菌的优点和功效。然而目前被运用到生产的乳酸菌种十分的固定，自然界中还有许多未知的乳酸菌种值得我们去寻找筛选、提纯并且诱导。本实验研究目的在于从自然界筛选及鉴定未知的乳酸菌，使其生理生化特征可以表现出来，从而判断是否能够在酱油、酸奶、陈醋等发酵产品生产中更好发挥乳酸菌的作用，更好的达到发酵的效果，能够培育出人类生产中所需要的优质的乳酸菌，方便的应用于发酵产品的生产中122 实验部分2.1 实验材料与仪器2.1.1 实验材料自制酸菜汁中筛选出的4株乳酸菌:R1、R2、R3、R42.1.2 实验仪器设备名称生产厂家721E型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司电热恒温培养箱（DHP-9162）上海恒科学仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KB）上海申安医疗器械厂空气振荡器（HZQ-C）哈尔滨市东联电子技术开发有限公司振荡器（DZP-102）哈尔滨市东联电子技术开发有限公司电子天平（FA1104）上海天平仪器厂SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台杭州净化设备有限公司生化培养箱（LRH-70F）上海恒科学仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9203A）上海恒科技有限公司PH计（PHS-3C）上海精科紫外分光光度仪（W1000） 上海天美有限公司可见分光光度计（721）天津市普瑞斯仪器有限公司光学显微镜（Motic-BA200Digital）日本尼康公司电炉子（SX2-4-10） 天津市中环实验电炉子有限公司其他仪器：pH酸度计、试管、容量瓶、量筒、玻璃棒、烧杯、纱布、报纸、锥形瓶、铁架台、酒精灯、涂布棒、镊子等。19哈尔滨商业大学毕业设计（论文）2.1.3 实验试剂实验药品名称级别生产厂家蛋白胨生物试剂北京奥博星生物技术有限责任公司牛肉粉生物试剂北京奥博星生物技术有限责任公司干酪素生物试剂北京市海淀区微生物培养基制品厂葡萄糖分析纯天津市天力化学试剂有限公司氯化钠分析纯天津基准化学试剂有限公司硫酸铵分析纯天津市天力化学试剂有限公司磷酸氢二钠分析纯天津市天力化学试剂有限公司磷酸二氢钾分析纯天津市博迪化工有限公司硫代硫酸钠分析纯天津市百世化工有限公司氢氧化钠分析纯天津市博迪化工股份有限公司可溶性淀粉生物试剂北京市海淀区微生物培养基制品厂明胶生化试剂天津市风船化学试剂科技有限公司L-酪氨酸生化试剂天津市光复精细化工研究所石蕊分析纯天津市巴斯夫化工有限公司溴甲酚紫分析纯天津市光复精细化工研究所1-萘酚分析纯天津市光复精细化工研究所酚酞分析纯天津市永太化学试剂开发中心对二甲氨基苯甲醛分析纯上海试剂工厂酸性品红生物染色剂北京化工厂无水乙醇分析纯天津市天力化学试剂有限公司95%乙醇分析纯天津市天力化学试剂有限公司2.1.4 实验培养基2.1.4.1 乳酸菌分离培养基分离培养基（BCP培养基）配方：5g乳糖、5g酵母浸粉、15g-20g琼脂、5%溴甲酚紫2.5ml、1000mlH2O、PH6.8-7.0、121高压灭菌15分钟。基础培养基：葡萄糖0.5g，(NH4)2SO40.2g，柠檬酸钠0.1g，MgSO47H2O0.02g，K2HPO40.4g，KH2PO40.6g，蒸馏水100mL，调PH 7.0-7.22.1.4.2 乳酸菌的生理生化鉴定培养基 产硫化氢试验培养基：蛋白胨10 g，氯化钠5 g，牛肉膏10 g，半胱氨酸0.5 g，蒸馏水1000 ml，pH值为7.07.4，121灭菌20 分钟。石蕊牛乳试验培养基：2.5% 石蕊水溶液4 ml，脱脂牛奶100 ml，115灭菌20 分钟。硝酸盐还原试验培养基：葡萄糖 20 g，KH2PO4 1 g，MgSO47H2O 0.5 g，酵母膏 0.2 g，KNO3 7.8 g，蒸馏水 1000 mL，121灭菌20分钟。柠檬酸盐试验培养基：NaCl 5.0 g，MgSO47H2O 0.2 g，(NH4)H2SO4 1.0 g ，K2HPO43H2O 1.0 g，柠檬酸钠2.0 g ，溴百里酚蓝1%水溶液 10 ml ，水洗琼脂12.0 g，蒸馏水990 ml，pH值为7.0，121灭菌20分钟。糖发酵基础培养基：蛋白胨 20 g，NaCl 5 g，1.6 % 溴甲酚紫乙醇溶液 1 mL，糖 10 g，蒸馏水 1000mL， 121 下灭菌15 分钟。2.2 实验方法2.2.1 从自制酸菜汁中分离提纯乳酸菌的思路和原理酸菜发酵是多种细菌共同作用的结果。本实验利用BCP培养基变色原理，BCP培养基中酵母浸粉提供氮源；葡萄糖是可发酵的糖类；溴甲酚紫为pH指示剂。乳酸菌通过反应使菌落周围的PH发生改变，从而使培养基变色。在乳酸菌菌落附近培养基会从紫色变成黄色。因此通过在BCP培养基上不断的分离培养，可以得到乳酸菌单一菌种。2.2.2 培养条件所有平板和斜面均在37下恒温培养，所有液体菌株均在37，150rpm的摇床中震荡培养。2.2.3菌种储藏将菌种划线培养于BCP培养基斜面上，于4冰箱中保藏，约四周左右，定期转接。2.2.4 样品采集 选择酸菜缸中的酸菜汁，用消毒针筒抽取100ml液体，装入洁净塑料瓶中，密封好，并标注采集时间、地点、2.2.5 乳酸菌的分离和筛选将各代活化的样品用无菌生理盐水稀释10-110-6倍, 分别吸取0. 1mL涂布于培养皿中, , 于37 恒温培养48h. 挑取长势优良且单一的菌落反复进行分离纯化, 直至得到纯菌落为止, 并将得到的菌落编号保存备用。平板涂布法：平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。2.2.6 乳酸菌的产酸定性定量试验2.2.6.1 菌株产乳酸试验乳酸定性试验- 纸层析法：纸层析法依据极性相似相溶原理，是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质分配系数不同，因而扩散速度不同，从而达到分离的目的20。2.2.7.2 乳酸定量试验 通过测定乳酸生成量来确定高产酸的菌株。 利用酸和碱在水中以质子转移反应为基础的滴定分析方法。可用于测定酸、碱和两性物质。其基本反应为H+OH=H2O也称中和法，是一种利用酸碱反应进行容量分析的方法。 乳酸生成量测定：取乳酸发酵液10 mL 加入过量Ca CO3，然后加入指标剂钙黄绿素，蒸馏水稀释至25mL，用0 . 05 mol/L 的E DT A-Na2 滴定，并以新鲜发酵培养基为空白对照，计算乳酸含量。 乳酸含量计算公式： 乳酸含量（%）=90.0830.05V EDTA-Na/ 102.2.7 乳酸菌的生理生化鉴定2.2.7.1 乳酸菌的形态学鉴定 （1）菌落形态：观察分离培养基平板上的菌落形态，并且记录。 (2) 菌株形态：将所分离的菌株进行革兰氏染色，于100倍油镜下观察，并且记录。2.2.7.2 乳酸菌的生长过程鉴定（1） 菌株最适生长起始pH值的确定用乳酸将BCP液体培养基调至pH5.0、6.0、7.0、8.0的不同pH值梯度系列，将培养18h的菌株接种于其中，37培养，以空白培养基作为对照，每隔2h测定其OD值(=600nm)。（2） 菌株耐盐性的确定 用NaCl将MRS液体培养基调至0、2、4、6、8、10、12的不同盐浓度梯度系列，将培养18h的菌株接种于其中，37培养，以空白培养基作为对照，每隔2h测定其OD值(=600nm)。2.2.7.3 乳酸菌的生理生化鉴定 对分离的菌种分别进行糖发酵产酸试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、明胶液化试验、硫化氢产生试验和多种糖源实验。3 结果与讨论3.1 乳酸菌的形态学鉴定3.1.1初步分离（1）取酸菜汁1mL，依次加入到装有9mL生理盐水的试管中，将菌液稀释为10-1，取稀释液1ml,加入到装有9ml生理盐水的试管中，将菌液稀释为10-2，以此类推，稀释到10-3、10-4一共4个稀释度，然后分别取0.2mL，涂布于BCP固体培养基上，37培养48 h （2）对所有使培养基变色的菌落进行编号，并划线分离4次，最后选择单菌落，观察菌落特征，镜检确认为纯培养，采用革兰氏染色法 。（3） 观察其细胞形态 图3-1 R1菌的显微镜观察 图3-2 R3菌株的显微镜观察3.1.2 乳酸菌的复筛 （1）选择4株健康的远离其他菌落的菌株再进行培养，分别编号为R1、R2、R3、R4。（2）确保R1R4平板为纯菌落培养为止，接种试管斜面。37恒温培养48h。作为保留菌种。（3）将编号斜面菌种分别接种到BCP液体培养基的三角瓶中，37恒温培养48h。（4）分别取四只三角瓶菌种做革兰氏染色，观察并记录。 图3-2 乳酸菌的液体培养 图3-3 乳酸菌的菌落形态表3-1菌落的形态学特征菌株染色结果菌落特征R1G+扁平、边缘光滑、表面粗糙、圆形、乳白色、表面湿润、直径为2 mmR2G+呈凹透镜状突起、圆形、不透明、灰白色、直径0.51.5 mmR3G+呈凹透镜状突起，光滑、圆形、乳白色、半透明、直径为12 mmR4G+扁平、边缘光滑、表面粗糙、圆形、微黄色、表面湿润、直径1mm3.1.3 菌株形态将所分离的菌株进行革兰氏染色，于100倍油镜下观察，并且记录。菌株 染色结果细胞形态R1G+菌体表现长杆状、少量短链、无芽孢R2G+菌体呈球状或豆状，单个或链状、无芽孢R3G+菌体呈短杆状，成对或链状排列、无芽孢R4G+菌体呈球状或豆状，单个或短链排列、无芽孢表3-2菌株的形态学特征3.2 乳酸菌的产酸定性定量试验3.2.1 菌株产乳酸试验 所分离菌株在发酵培养基中30培养12h，以4 % 接种量接种至盛有250mL 发酵培养基的500 mL 三角瓶中，30静置培养24h，得乳酸菌发酵液。 乳酸定性试验- 纸层析法：展开剂: 正丁醇: 甲酸: 水= 80:15:5；用毛细管分别吸取乳酸发酵液，多次点样于新华滤纸上，以1.5% 的标准乳酸作为对照，平衡2h 后进行层析，以1 % 溴甲酚蓝显色，并计算Rf 值。表3-3 菌株的乳酸定性实验结果项目1.5%乳酸R1 R2R3R4Rf0.8300.8230.8240.8250.8323.2.2 乳酸定量试验 取乳酸发酵液10 mL 加入过量Ca CO3，然后加入指标剂钙黄绿素，蒸馏水稀释至25mL，用0 . 05 mol/L 的E DT A-Na2 滴定，并以新鲜发酵培养基为空白对照，计算乳酸含量。 乳酸含量计算公式： 乳酸含量（%）=90.0830.05V EDTA-Na/ 10表3-4 不同菌株产酸含量和酸度结果项目R1 R2R3R4pH乳酸含量/%吉尔涅尔度/T3.656.61213.924.5983.476.81244.564.881 对分离所得到的菌株进行纸层析检测发酵产物中是否产生乳酸，结果见表3-3；进一步试验定量检测菌株的产酸能力，结果见表3-4。表3-3 菌株的乳酸定性试验结果由表3-3 数据可知，4 株菌株发酵液与标准乳酸纸层析具有相近的Rf 值，表明菌株发酵产物中含有乳酸。定量试验表明R1、R3株菌株的产乳酸含量较高，产酸能力也较强。3.3 乳酸菌的生长过程鉴定3.2.1 乳酸菌在37恒温培养pH值变化 将四株菌株液体培养基放置于37恒温培养，分别每2h检测pH值并记录。 图3-4 四株菌株在37中24h的pH变化 由图3-4可以看出，在28小时内，四株菌株的pH变化最为明显。R2菌株在2-8小时内pH最低但和其他菌株差距不明显。在后期pH基本不变，表示乳酸菌基本代谢稳定。3.2.2 菌株最适生长起始pH值的确定用乳酸将BCP液体培养基调至pH5.0、6.0、7.0、8.0的不同pH值梯度系列，将培养18h的菌株接种于其中，37培养，以空白培养基作为对照，每隔2h测定其OD值(=600nm)。根据4株乳酸菌的表现，我选择R1号和R2号做不同pH对菌种的生长影响。 图3-5 菌株R1在不同pH的生长曲线图3-6 菌株R2在不同pH的生长曲线 图3-2和图3-3分别为菌株R1和菌株R2在不同pH值培养基中的生长情况，结果表明：两株菌在初始生长pH值为58期间均能生长，菌种1最适初始生长pH值为6.08.0，菌种2则最适初始生长pH值为70。3.2.3 乳酸菌株耐盐性的确定用NaCI将BCP液体培养基调至0、2、4、6、8、10的不同盐浓度梯度系列，将培养18h的菌株接种于其中，37培养，以空白培养基作为对照，每隔2h测定其OD值(=600nm)。图3-7 菌株R1在不同盐浓的生长曲线图3-8 菌株R2在不同盐浓的生长曲线图3-7和图3-8分别为菌株R1和菌株R2在不同盐浓度中培养的生长情况，结果表明，菌种1能在小于6的盐浓度中生长，当盐浓度达到8时几乎不生长，菌种2能在小于8的盐浓度中生长，当盐浓度达到10时几乎不生长。根据以上两株菌的耐盐能力，以上两株菌均能用于需要一定盐浓度的腌制发酵。3.2.4 乳酸菌的不同温度生长鉴定 将培养18h的四株菌株接种于BCP液体培养基中，置于30、37中恒温培养，以空白培养基作为对照，每隔2h测定其OD值(=600nm)。图3-9 菌株R1在不同温度的生长曲线图3-10 菌株R2在不同温度的生长曲线 图3-11 菌株R3在不同温度的生长曲线 图3-12 菌株R4在不同温度的生长曲线 由上图可知：图3-9、图3-10、图3-11、图3-12是4株乳酸菌在不同温度下的生长情况，结果表明，四株菌在30和37时均能生长，1号菌种在30时比37生长迅速，其他三株在37比30生长迅速，412h.OD值迅速增长，菌体处于生长期;1618h，OD值基本达到最大值，菌株进入稳定生长。3.3 乳酸菌的生理生化鉴定具体的实验步骤：（1） 过氧化氢酶试验：挑取分纯菌株的菌落一环，置于洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液，观察结果。半分钟内发生气泡者为阳性，反之为阴性。（2） 硫化氢试验：将分离纯菌接种于产硫化氢试验培养基试管后，用无菌镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内，下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧。实验中设空白对照。35 培养248 h，观察纸条是否变黑，变黑者为阳性，不变者为阴性。（3） 柠檬酸盐试验：将分纯的菌株在在斜面上划线接种，37 培养37 d，培养基为碱性（指示剂蓝色或桃红色）者为阳性，否则为阴性。（4） 产气产酸发酵试验：将保存的菌株接种到糖发酵液体培养基