重楼总皂苷提取分离及其对人胃癌细胞BGC823的抑制作用.doc

重楼总皂苷提取分离及其对人胃癌细胞bgc823的抑制作用簿嬲重楼总皂苷提取分离及其对人胃癌细胞bgc823的抑制作用吴夏慧薛娇胡文静禹立霞钱晓萍刘宝瑞(南京大学医学院附属鼓楼医院,江苏南京210008)摘要目的:初步探索重楼总皂苷的提取分离方法,并通过比较重楼总皂苷与重楼醇提物,重楼皂苷i对人胃癌细胞bgc823生长抑制作用评价重楼总皂苷提取分离工艺和临床应用价值.方法:采用热回流提取法得到重楼醇提物.再经大孔吸附树脂分离得到重楼总皂苷.采用噻唑蓝染色法(mtt法)和集落形成实验.比较重楼总皂苷与重楼醇提物,重楼皂苷i对人胃癌bgc823细胞增殖和集落形成的影响.结果:重楼总皂苷,重楼醇提物,重楼皂苷i作用于人胃癌bgc823细胞48h的半数抑制浓度(ic50)分别为(8.63+0.30),(2.610.03),(1.970.o1)g/ml.在3.13,6.25,12.51xg/ml浓度下重楼醇提物组集落形成抑制率为30.84%,53.27%,100%,而重楼总皂苷组在各浓度范围内均无集落形成.结论:重楼总皂苷对人胃癌bgc823细胞生长抑制作用显着优于重楼醇提物,稍弱于重楼皂苷i,但二者ic5o数值接近且均较低,从而肯定重楼总皂苷提取分离工艺和临床应用潜能.关键词重楼皂苷bgc823细胞细胞增殖病理学体外实验中图分类号r282.710.5文献标识码a文章编号1672397x(2011)08008403中药重楼(rhizomaparidis)为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎,具有清热解毒,消肿止痛,凉肝定惊之功效,主治疔疮痈肿,咽喉肿痛,毒蛇咬伤,跌扑伤痛,惊风抽搐等症田.实验室前期研究表明,重楼复方及重楼醇提物对肿瘤生长有良好的抑制作用12-3.同时,国内外大量文献报道重楼皂苷具有抑制肿瘤细胞增殖,诱导凋亡等作用,其中以重楼皂苷i抗肿瘤活性最强.研究最为广泛h_q.有效部位是中药研究的一种新的思路,其既去除了中药及其复方的杂质.又保留了化学成分相近,功效类似的药效成分群.符合中药多成分,多靶点,多效应的作用特点,且提取分离工艺相对单体化合物简单,便于研发和临床应用.鉴于重楼良好的抗肿瘤活性和有效部位研究的优势,本实验探索重楼抗肿瘤天然有效部位总皂苷的提取分离方法,并比较重楼总皂苷与其醇提物,重楼皂苷i体外直接细胞毒作用,从而进一步评价重楼总皂苷提取分离工艺和临床应用价值.1实验材料1.1药材重楼.产地四jii,购自重庆重楼中药饮片厂有限公司,批号100401;重楼皂苷标准品i,购自南京泽朗医药科技有限公司,纯度98%.1.2主要仪器r501型旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司),olympus倒置显微镜(日本olympus公司),低速离心机(北京医用离心机厂),exl800自动酶标仪(美国biotek公司),co:培养箱(日本sanyo公司),超净工作台(苏州净化设备有限公司).1-3主要试剂rpmi1640培养液(美国gibco公司),新生小牛血清(兰州民海生物公司),0.25%胰蛋白酶(美国sigma公司),m,iti(美国sigma公司),dmso(上海凌峰公司,分析纯),d101型大孔吸附树脂(上海振光树脂厂),无水乙醇(南京化学试剂厂),其他试剂均为分析纯.1.4细胞株人胃低分化腺癌细胞株bgc823(由南京大学附属鼓楼医院肿瘤中心实验室保存)接种于完全培养液中.37恒温,5%co:,饱和湿度培养箱中生长,23d消化传代1次.取对数生长期细胞用于细胞毒实验.2实验方法2.1重楼醇提物的制备采用本实验室通过正交实验优选的重楼醇提物制备方法.将重楼粉碎过二号筛,置于干燥箱60过夜,称取药材粉末100g.加8倍量80%乙醇热回流提取3次,每次2h,抽滤,滤液减压浓缩,将滤液水浴蒸干后真空干燥制得干浸膏.将重楼醇提物用dmso溶解定容至200mg/ml,以3000r/min离心15min,取上清,过0.22m微孔滤膜过滤除菌,4冰箱保存,临用时用完全培养液稀释成所需浓度.dmso终浓度o.1%.2.2重楼总皂苷的制备称取适量重楼醇提物用80%乙醇溶解,按体积比1:1加入dio1大孑l树脂拌样,蒸干后上样于d101型大孔吸附树脂.以57倍柱体积的纯水,40%乙醇,70%乙醇,90%乙醇依次洗脱,流速:2bvfla,收集各梯度滤液,其中70%乙醇部位滤液60减压回收,将滤液水浴蒸干后真空干燥即得重楼总皂苷.将重楼总皂苷配制成200mg/ml的溶液,方法同重楼醇提物.基金项目:教育部高校博士点专项(200803150007);南京市卫生局医药卫生科(ykk09095,ykk09097);南京市医学科技发展项目(zkxio011)团!璺竺竺堂竺!塑中压;52-3m1-r法比较重楼醇提物,重楼总皂苷,重楼皂苷i对bgc823细胞增殖的影响取对数生长期的人胃低分化腺癌bgc823细胞.加以每孔6.oxlo密度活细胞接种于96孔板,培养24h,弃培养液,加入含药物的培养基(每组浓度设立3个复孔).药物终浓度分别为25,l2.5,6.25,3.13,1_56,0.781xg/ml.同时设立只加完全培养液的空白对照组.置于370c,5%co饱和湿度的培养箱培养48h后每孔加入2om丌溶液,继续培养4h后,弃上清,每孔加入dmso1501.ll,微型混合器震荡10min,充分溶解结晶后,用自动酶标仪双波长(570/630nm)测定各孔的光密度值(opticaldensity,od值).按公式计算肿瘤细胞增殖抑制率:抑制率(%)=(1一实验组0d值/对照组od值)10o%2.4集落形成实验71取对数生长期的人胃低分化腺癌细胞bgc823,以io0/:l密度活细胞接种于24孔板,培养24h,弃培养液,加入含药物的培养基(每组浓度设立3个复孔),药物终浓度分别为12.5,6.25,3.13p,g/ml,同时设立完全培养液的空白对照组.药物作用48h,弃上清,换完全培养液,继续培养7d,弃上清,经95%酒精固定,结晶紫染色,在显微镜下计数含50个细胞以上的集落.按下式计算集落形成抑制率:集落形成抑制率(%)=(1一实验组集落形成数,对照组集落形成数)xlo0%2.5统计学方法运用spss17.0统计软件处理,采用t检验进行数据统计,所有数据用(础s)表示.以p<0.05为有显着性差异.3实验结果3.1比较重楼醇提物,重楼总皂苷,重楼皂苷i对bgc823细胞增殖的影响从表1可以看出,经不同浓度的重楼醇提物,重楼总皂苷,重楼皂苷i作用后,人胃癌细胞bgc823的生长增殖受到不同程度的抑制.并呈浓度依赖性.除251xg/ml浓度外.重楼醇提物,重楼总皂苷在其余各浓度下组间抑制率比较差异均具有统计学意义(尸<0.05).在低浓度(o.783.13gml)范围内.重楼总皂苷,重楼皂苷i组间抑制率比较差异均具有统计学意义(p<o.05).重楼醇提物,重楼总皂苷,重楼皂苷i作用于bgc823胃癌细胞48h的半数抑制浓度(ic50)分别为(8.63-z-0.30),(2.61_-+0,03),(1.97蝴.01)咖l,各组间ic50比较差异具有统计学意义(p<0.05).重楼总皂苷对人胃癌细胞bgc823的增殖抑制作用显着强于重楼醇提物,但弱于重楼皂苷i.表l重楼总皂苷,重楼醇提物,重楼皂苷i对bgc823细胞的增殖抑制作用(,n=3)注:与重楼醇提物组比较,p<0.05;与重楼皂苷i组比较.p<0.05.3.2重楼醇提物,重楼总皂苷,重楼皂苷i对人胃癌细胞bgc823形态的影响如图1所示,以3.131g/ml浓度作用时,重楼总皂苷,重楼皂苷i组肿瘤细胞密度减低,分裂像减少,大部分细胞变圆皱缩,脱壁漂浮,而重楼醇提物组肿瘤细胞形态改变不明显.以6.251xg/ml浓度作用时,重楼总皂苷,重楼皂苷i组肿瘤细胞形态相似,即碎裂成沙粒状,而重楼醇提物组部分肿瘤细胞变圆皱缩,无沙粒状改变._a重楼醇提物3.13g/ml组b重楼总皂苷3.13g/ml组c重楼皂苷i3.13g/ml组_d重楼醇提物6.25g/ml组e重楼总皂苷6.25p/ml组f重楼皂苷i6.25g/ml组图1重楼醇提物,重楼总皂苷,重楼皂苷i作用48h后bgc823细胞的形态变化(2oo)(本文彩图刊登于http:/www.jstcm.en电子图片栏目)3i3重楼醇提物,重楼总皂苷对人胃癌细胞bgc823集落形成的影响结果见表2.不同浓度下实验组与空白对照组比较差异均有统计学意义(p<o.05).重楼醇提物对bgc823胃癌细胞集落形成的影响呈剂量依赖性,在3.13,6.25,12.5txg/ml浓度下重楼醇提物组集落形成抑制率为30.84%,53.27%,100%.而重楼总皂苷组在各浓度范围内均无集落形成.故重楼总皂苷抑制集落形成的作用显着强于重楼醇提物.表2重楼醇提物,重楼总皂苷对人胃癌细胞bgc823集落形成的影响(互,n=3)注:与空白对照组比较,p.,0.05;与重楼醇提物组比较.p<0.05.4讨论在我国,中药是恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分.随着分子生物学的发展.药物高通量高内涵分析,筛选等技术平台的不断提升.逐渐认识到有效部位是中药生物学活性的物质基础.中药有效部位包含多种物质成分,可作用多个靶点产生多种效应,较单个化合物的作用机制复杂,而提取分离工艺相对简单.同时区别于通过水煎,醇提等简单提取方法得到的中药粗提物,中药有效部位可以进一步提高药物疗效,降低药物副反应.相对重楼皂苷单体化合物而言,重楼总皂苷具有提取工艺相对简单和多组分,多靶点,多效应的药效优势.相对重楼醇提物而言,重楼总皂苷具有提高药物疗效,降低副作用等优势.本实验采用热回流提取和大孔吸附树脂提取分离重楼总皂苷,大孑l吸附树脂是一类新型的非离子型高分子吸附剂,具有分离效果好,操作简单,有机溶剂使用少,可以再生中医坠田补肾活血中药对子宫内膜异位症大鼠生殖功能干预研究夏亲华沈明勤:张蕾:(1.南京中医药大学,江苏南京210046;2.江苏省中医药研究院,江苏南京210028)摘要目的:探讨补肾活血中药对调节子宫内膜异位症(ems)模型大鼠生殖功能的作用.方法:将ems模型大鼠分为模型组和补肾活血汤高,中,低剂量组及阳性药组,另设假手术组.分别给药8周后观察在位内膜的pr表达和排卵数目,剩余各组大鼠分别与雄性大鼠按2:1比例合笼.观察孕鼠活胎数.结果:阳性药组和补肾活血汤中,高剂量组大鼠的在位内膜pr表达与模型组比较明显升高,阳性药组和补肾活血汤各剂量组的排卵数与模型组比较明显增多,补肾活血汤各剂量组的活胎数与假手术组相比差异无统计学意义.结论:补肾活血中药能有效调节ems模型大鼠子宫内膜孕激素受体的表达.促进卵泡发育,提高妊娠率,达到有效调节生殖功能的目的.关键词子宫内膜异位症补肾活血汤子宫卵巢病理学活胎数实验研究中图分类号r711.710.5文献标识码a文章编号1672397x(2ol1)o8008602目前.子宫内膜异位症(ems)已成为影响生育最主要的妇科疾病之一.中医药在缓解症状,调经助孕等方面疗效突出.有西药不可比拟的优势.本研究通过观察补肾活血汤对ems模型大鼠生殖功能的干预,证实其有效调节ems模型大鼠生殖功能的作用,现报道如下.1实验材料1.1实验药物补肾活血汤,处方:菟丝子log,紫河车10g,当归10g,川芎6g,生地10g,白芍log,山药15g,柴胡10g,桑寄生10g,丹参10g,由江苏省中医药研究院制剂室制备提供标准汤剂,每毫升药液含生药材约1.63g.己烯雌酚:0.5mgx100片,合肥久联制药有限公司生产,批号:20080104.孕三烯酮(内美通)胶囊:2.5mg/粒xl0粒,patheonu.k.limited生产,批号:018445.枸橼酸氯米芬片:50mgxl0片.codalsyntolimited生产,批号:a1101.1.2仪器与试剂waters高效液相色谱仪.600泵,2996型检测器.empower数据处理系统.阿魏酸对照品:中国药品生物制品检验所,供含量测定用,批号:07739809.其他试剂为市售分析纯.和反复使用,便于工业化生产等优点,是分离中药有效成分的重要方法.同时.本实验采用m1rr法和集落形成实验比较重楼总皂苷,重楼醇提物,重楼皂苷i对人胃癌bgc823细胞增殖和克隆形成能力的影响,结果发现:重楼总皂苷对人胃癌bgc823细胞的生长抑制作用显着优于重楼醇提物;重楼总皂苷和重楼皂苷i抗肿瘤的ic虽然差异有统计学意义,但数值相差不大且均较低.以上提示重楼总皂苷较重楼醇提物有效提高了对人胃癌bgc823细胞体外细胞生长抑制作用.相对重楼皂苷i而言,重楼总皂苷的提取分离工艺相对简单而体外活性相似,肯定了重楼总皂苷的提取分离工艺.同时良好的直接细胞毒作用提示其具有一定的临床应用潜能,因而值得进一步研究重楼总皂苷体内外抗肿瘤作用和安全性,以及深入机理研究,明确其作用靶点和作用机理,为指导临床用药提供理论基础.5参考文献1国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药科技出版杜.2010:24321胡文静,钱晓萍,邹玺.重楼,土鳖虫对人肝癌