铜、镉及其联合毒性对唐鱼肝脏CYP3A基因表达影响.docx

第52卷第10期 湖北农业科学 v0152 no102013年5月 hubei agricultural sciences may，2013铜、镉及其联合毒性对唐鱼肝脏cyp3a基因表达影响肖衙1，靖静1，武娜2，杨学芬，马徐发1(1华中农业大学水产学院农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉4300702中牧智合(北京)生物技术有限公司，北京100095)摘要：运用荧光定量pcr方法检测不同暴露时间和暴露浓度的铜、镉单一毒性和其联合毒性对唐鱼 (tanichthys albonubes)肝脏cyp3a基因mrna表达量的影响。结果袁明，铜和镉对唐鱼肝脏cyp3a基 因的表达有显著的诱导作用(po05)：与单一毒性相比，铜镉联合毒性表现为一定的协同作用。唐鱼 cyp3a基因的表达变化对镉、铜胁迫的响应具有一定的可测性和较强的规律性。关键词：唐鱼(tanichthys albonubes)；cyp3a基因；rtpcr；联合毒性中图分类号：$949 文献标识码：a 文章编号：043981 14(2013)10243904effect of single and combined copper，cadmium on cyp3a gene expression in livertissue of tanichthys albonubesxiao kanl，jing jin91，wu na2，yang xue-fent,ma xu-fal(1college of fisheries，huazhong agricultural universitykey laboratory of agncultural animal genetics，breeding and reproduction ofministry of education wuhan 430070，china；2zhongmu zhihe(beijing)biotechnology co，ltd，beijing 100095，china)abstract：rri_pcr was used to detect the effects of different exposure time and exposure concentration of copper and cad mium and their joint toxicity orl cyp3a gene expression in liver tissue of tanichthys albonubesthe results showed that ex posure to copper and cadmium had a significant induction effect(p005)on cyp3a gene expression in liver tissue of r ol bonubes。compared with single toxicity，their joint toxicity on cyp3a gene expression pefformanced a synergistic toxic effect the expression of cyp3a gene of r a!bonubes responsed to copper and cadmium exposure could be detected and presentedparticular regularitykey words：tanichthys albonubes；cyp3a gene；real-time pcr；joint toxicity细胞色素p450氧化酶(cytochmme p450 e11 简单并且对于许多污染物较敏感而有望作为一 zymes，cyp450)主要存在于动物肝脏中是一类重 种新的水环境监测生物加以开发研究。然而，关于 要的混合功能氧化酶(inixedfunctionoxidasemfo)t1i， 唐鱼的水生态毒理学研究还仅限于急性毒性及安 对许多内源性、外源性化合物在体内的生物转化具 全浓度评价等方面。本研究运用荧光定量pcr方法 有重要的作用23。cyp3a是鱼类代谢亲脂性有机化 检测不同暴露时间和暴露浓度的铜、镉单一毒性及 合物的主要氧化酶也是动物肝脏中含量最丰富 其联合毒性对唐鱼肝脏cy丹a基因表达量的影 的cyp450酶很多药物或环境因子是cyp3a的诱 响。为铜、镉作为淡水鱼类生态毒性的生物分子指 导剂或抑制剂4。研究cyp3a在生物体内的变化与 示物提供一定参考。污染物浓度的关系对环境污染的监测和预警具有1材料和方法重要意义。唐鱼(tanichthys albonubes)又名白云金丝鱼， 11材料 隶属于鲤形目鲤科。由于唐鱼饲养条件要求低、性 111试验动物试验唐鱼体长(285+017)on， 成熟早、繁殖周期短、产卵量大、病害少、管理条件体重(059_+018)g由中国水产科学院珠江水产研收稿日期：2012一11-26 基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008zx07211-007) 作者简介：肖衍(1988一)，男，湖北武汉人，在读硕士研究生，研究方向为水生态毒理学，(电话电子信箱)xkl98812126corn通讯作者，马徐发，副教授，博士，研究方向为水环境监测，(电子信箱)xufamamailhzaueduoil。万方数据湖北农业科学2013拄究所提供，已于实验室培养2代以上，每天投喂热 性毒性试验结果cu2+对唐鱼96 h的半数致死浓度带鱼薄片饲料(德国德彩水族公司生产)两次水温 为0054 mglcdz+对唐鱼96 h的半数致死浓度为控制在(2505-10)oc，光暗比为14 h：10 h，饲养期间 4610 m以，确定了铜和镉的亚急性试验浓度。铜暴鱼活动正常、无病，死亡率低于3。 露试验设o(对照组)、1350、2700gl(分别为9611。2 试剂trizol，premix taq dna聚合酶， h半致死浓度的0、25和50)3个处理组。镉暴 dntp mixture，ribonuclease inhibitor，oligo d(t)15 露试验设0(对照组)、115、230 mgl(分别为96 h primers，agarose gel dna purification kit，pmd 1 9- 半致死浓度的0、25和50)3个处理组。铜、镉t vectorsybr premix taq dna聚合酶prime 联合暴露为在单一毒性的基础上按毒性单位1：1script rtpcr kit均购自宝生物工程(大连)有限 设置3个处理组，每个处理组设3个平行。取暂养 公司；depc浓缩液、xgal、iptg和氨苄青霉系购 两周的健康唐鱼648尾，分别放入27个缸中每缸 自天根生化科技(北京)有限公司；cus045h20，cd 24尾，水中溶氧量保持在60 mgl以上，ph 80，硬 c1：25h：o等其余试剂均为国产分析纯。 度25 dh(德国度)，温度(250_10)oc光暗比为14113 引物 试验所用引物均由宝生物工程(大 h：10 h。试验共进行96 h，试验期间不投喂饲料，并 连)有限公司合成引物列表如表1。 未引起死亡表1试验所用引物124荧光定量pcr检测重金属暴露后mrna的表达量根据已获得的核心片段序列设计特异性名称引物序列(5一3)片段大小肋pcyp3aftkgtgrcgcttctgg盯wt荧光定量pcr引物rtf和rtr根据已报道的138cyp3ar ggttggl【-igckagattgt唐鱼bactin基因(noeul284811)设计特异性内rtfaagaagatgctgaag哪gac参引物bf和br。暴露后的24、48、72、96 h分别jjj取铜、镉及其联合毒性不同浓度各处理组每组6尾rtrtgtaaggctccgtagaag鱼剖取等量的肝脏提取总rna并反转录成cdnabfggatgatgaaatygccgc161 链后进行rtpcr反应。rtpcr反应体系为：brcaacatagctgtcctictgcccdna模板20 ixl，上下游引物(10 pmobl)各o512方法 “l。sybr premix砌dna聚合酶125“l。反应程121唐鱼总rna的提取将唐鱼冲洗干净在 序为：95预变性3 min：95 oc变性30 s，56退火 超净工作台上进行解剖，剖取肝脏组织块约50 mg。 30 s，72延伸30 s，35个循环；72延伸10 min， 采用trizol法提取唐鱼总rna用分光光度计测定 4保存。每个样品设3个重复。rna浓度并通过12琼脂糖凝胶电泳分析总 125数据分析采用2。法计算目的基因的相rna质量。 对表达量。以无处理组24 h肝脏组织cyp3a基因122 cy丹a基因的克隆 根据genbank上的鲫 表达量为对照，并设其基因的相对表达量为l。试验 鱼(carassius attratus)(jn555609)、稀有绚鲫(gobio 结果均采用平均值5-标准差表示用statisticacypris rarl岱)(eul06659)、锦鲤(cyprinus carpio) 60软件进行单因素方差分析(oneway anova)， (gu046696)cyp3a基因序列设计1对简并引物利用duncans多重比较对均值进行差异显著性检 cyp3af和cyp3ar。使用反转录试剂盒 验primescript rtpcr kit进行rna反转录得到2结果与分析cdna然后进行pcr反应扩增cyp3a基因。pcr反应体系为：cdna模板2仙l，上下游引物(1021 唐鱼cyp3a基因核心片段的克隆 pmoll)各1斗l，premix toq dna聚合酶25l，补 利用rtpcr进行核心片段扩增获得了与预 ddh20至50仙l。反应程序为：94预变性4 min；94 期大小一致的目的片段(图1)。将序列提交gen变性30 s，55 oc退火30 s72延伸1 rain30个 bank进行blast比对。结果表明，该序列与鲫鱼、 循环：72延伸10 min。pcr产物经1琼脂糖凝胶 锦鲤、稀有绚鲫同源性分别为86、87、90。 电泳将目的片段用agarose gel dna purification22铜暴露下唐鱼肝脏cyp3a基因mrna表达 kit回收后与pmdl9一t载体进行连接，转化至大肠 量变化结果 杆菌dh50t挑选阳性菌落检测目的片段。并送至上铜对唐鱼肝脏cyp3a基因mrna表达的影响 海英骏生物技术有限公司测序。 情况见图2。由图2可知低剂量组cyp3a基因123唐鱼重金属暴露处理根据陈辉辉等5的急 mrna表达水平在48 h显著上调(约为对照组的万方数据第10期 肖衍等：铜、镉及其联合毒性对唐鱼肝脏cyp3a基因表达影响2441m2 000 bp1 000 bp750bp500 bp250bp100bp注：l、2和3分别代表受试浓度0、115、230mgl cd二+。图3不同浓度c矿暴露下唐鱼肝脏中cyp3a基因mrna注：mdna marker；1 cp3a基冈的相对表达水平 图1 rtpcr扩增的唐鱼cyp3a基因24铜、镉联合暴露下唐鱼肝脏cyp3a基因38倍p005)，72 h下降后96 h对表达量显著上 mrna表达量变化 调(约为对照组的46倍。po05)：高剂量组cl，p3a铜、镉联合毒性对唐鱼肝脏cyp3a基因mrna 基因mrna表达水平整体在48 h显著上调(约为对 表达的影响情况见图4。由图4可知。联合处理的低 照组的25倍。p005)，72 h和96 h cyp3a基因剂量组cyp3a基因mrna表达水平在48 h极显著 mrna表达水平与48 h无显著性差异高剂量组 上调(约为对照组的144倍，p001)，随着暴露时cl，麟基因mrna表达水平整体上低于低剂量组间的增加cyp3a基因mrna表达量有所降低，96cyp3a基因mrna表达水平。cyp3a基因mrna h与对照组相比仍有显著差异(约为对照组的68表达水平与铜暴露时间无显著性相关关系。 倍，p005)；联合处理的高剂量组cyp3a基因6 24 h mrna表达水平在24 h和48 h内与对照组无显著5 48 h 性差异72h和96h与对照组均有显著性差异(分4 72 h 别约为对照组的48倍和43倍，p005)。联合处理9613的各剂量组cl，丹a基因mrna表达水平相较于2 铜、镉单一毒性处理表现出了更高的上调水平。强蝈摧毒幂z仨lii86o242注：1、2和3分别代表受试浓度0、1350、2700斗gl cu“；“彬表0示与对照组差异显著(po05)，“+木表示与对照组差异极显著(p8001)，下同。6图2不同浓度cu2+m露下唐鱼肝脏中cyp3a基因mrna 42的相对表达水平ol2323镉暴露下唐鱼肝脏cyp3a基因mrna表达注：1、2和3分别代表受试浓度0,675斗叽cu2+057msl量变化cd2+和1350斗gl cu2*+115 msl cd“。镉对唐鱼肝脏cyp3a基因mrna表达的影响 图4不同浓度铜、镉联合暴露后唐鱼肝脏中cyp3a基因情况见图3。由图3可知。低剂量组cyp3a基因 mrna相对表达量mrna表达水平在48 h表现为极显著上调并达到3小结与讨论峰值(约为对照组的12倍，p001)，随后呈下降趋势96 h又达到显著上调水平(约为对照组的77 韩华等6研究了4种水产药物对牙鲆肝细胞 倍，p005)， 鲆cypla和cyp3a的酶活性均有不同程度地抑制72 h达到显著上调水平(约为对照组的82倍，p作用并且不同浓度的中药黄芩苷对牙鲆肝细胞005)，96 h有所下降，但仍与对照组差异显著(约为cypla的酶活性和基因表达随着用药时间和剂量 对照组的36倍，p005)。与铜暴露一样，镉暴露下 的增加而加强。陈秀荣等7证明了cyp3a酶分布于48 h和96 h唐鱼肝脏cyp3a基因mrna表达水平草鱼肝脏、鳃、肾脏、脾、肠、脑等各组织中，氰戊菊 均出现了先高后低的上调作用。酯在一定浓度和时间范围内能显著抑制cyp3a的万方数据2442湖北农业科学2013正活性这种抑制随暴露时间的延长而增强但抑制 cytochrome p450 enzymesjthe annals of pharmacotherapy趋势减弱。grosvik等8指出鳗鲡中erod活性能够 1995。29(6)：619624指示bap、pcb污染水平。haasch等9在酶活性、蛋 2李燕梅，关天增中药十八反源流探析j中医研究，1996，9(3)：911白、mrna几个水平上测定了被pah和pcb污染3mcarthur a，hegelund t，cox r，et a1phylogenetic的河水对鱼cyplal的诱导证明了几种水平上的 analysis of the cytochrome p450 3(cyp3)gene familyj1测定都可用于p450酶诱导作用的检测。铜是生命 journal of molecular evolution，2003，57(2)：200一21 1必需的微量元素然而高剂量铜具有凝聚蛋白质和4istrate m a，nussler a k，eichelbaum m，et a1 regulation of cyp3a4 by pregnane x receptor：the role of腐蚀作用。大量铜元素在动物组织细胞中蓄积尤nuclear receptors competing for response element bindingj其是在肝脏中蓄积使多种重要酶的活性受到抑biochemical and biophysical research communications，2010，制，导致肝脏功能障碍甚至坏死。镉会阻碍生物体 393(4)：688693内一定的活性传递机制影响机体的内分泌系统 5陈辉辉，覃剑晖，刘海超等典型重金属、多环芳烃及菊酯类农造成肾损伤和酶失活】0并能诱导金属硫蛋白的形 药对唐鱼的急性毒性效应j华中农业大学学报，2011，30(4)：511515成。6韩华，李健，李吉涛，等黄芩苷对牙鲆肝cypla酶活性及本研究是国内首次报道唐鱼细胞色素p450酶基因表达的影响j中国水产科学，2010，17(5)：11211127家族cyp3a对于鱼类cyp家族基因功能研究具 7陈秀荣，罗宇良，曾令兵，等氰戊菊酯对草鱼肝微粒体cyp3a有一定意义。单独的铜、镉暴露对唐鱼肝脏cyp3a 活性的影响j华中农业大学学报，2010，29(6)：768771基因表达量均表现为诱导作用且低浓度暴露诱导8grosvik b，bjornstad a，camus l，et a1membrane destabilisation of haemocytes measured by uptake of fluorescent作用增强高浓度暴露诱导作用减弱。不同浓度的probesjmarine environmental research，2000，50(1)：432铜、镉联合暴露下唐鱼肝脏cyp3a基因表达量相433较于单一重金属暴露均有不同程度的增加表现为 9haasch m l，lech j j，prince r，et a1caged and一定的协同作用。目前研究水体污染物联合毒性的 wild fish：induction of hepatic cytochrome p一450(cypla，)as 方法和模型多只限于急性毒性评价 主要运用单 an environmental biomonitorjenvironmental toxicology and 一污染物的lc。值建立各种模型，根据相应的公式 chemistry，1993，12(5)：88589510gillis p l，diener l c，reynoidson t b，et a1cad计算来判别混合污染物的联合作用如tu(毒性单mium-induced production of a metallothioneinlike protein in位)法，ai(加和指数)法、mti(混合毒性指数)法及入 tub咖x tubifex(oligochaeta)and chironomus riparius(dipter-(相似参数)法，在基因表达及蛋白表达等更深层次 a)：correlation with reproduction and growthjenviron的水平上却没有统一的较好的评价模型和标准。因 mental toxicology and chemistry，2002，21(9)：18361844此建立更科学的污染物评价模型和方法对于污11王瑞龙，马广智，方展强铜、镉、锌对唐鱼的急性毒性及安全浓染物的毒性评价有着更重要的意义。度评价j水产科学，2006，25(3)：117120参考文献：f 1slaughter r l，edwards d jrecent advances：the (责任编辑屠 晶)-卜-+一-+一-卜-+r一+一-卜-_卜-卜-卜-+_-卜-+-一卜-卜-+一-卜-叫卜一-+_-+一一卜一