（食品科学专业论文）南瓜籽蛋白制备及其活性多肽的研究.pdf

山西大学 硕士学位论文 南瓜籽蛋白制备及其活性多肽的研究 姓名 刘艳荣 申请学位级别 硕士 专业 食品科学 指导教师 范三红 2011 06 i 中 文 摘 要 本文以南瓜籽为研究对象 用超临界二氧化碳萃取技术脱除油脂 研究饼粕中 蛋白质的提取工艺和功能性质 制备活性多肽的酶水解工艺 以及超滤技术对酶解 液的分级分离过程 同时分别用 sds page 凝胶电泳技术和凝胶柱层析技术分析南 瓜籽蛋白和多肽的分子量分布情况 并通过体外实验初步评价南瓜籽酶解液的抗氧 化活性和降血压活性 得到如下结论 1 碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的最佳工艺条件是 温度为 50 料液比为 1 30 ph 值为 11 浸提时间为 1 5h 在此条件下蛋白质的提取率达到 85 52 纯度为 91 07 南瓜籽蛋白的第一限制性氨基酸为含硫氨基酸 其次为赖氨酸 必 需氨基酸指数高达 0 8687 是一种良好的蛋白资源 2 南瓜籽蛋白的溶解度随 ph 变化呈 v 型曲线 在 ph 为 5 0 6 0 时溶解度最 小 吸水性和吸油性都在 1 2 1 6g g 左右 乳化能力在适宜 ph 下达到 80 以上 起泡性则相对较弱 南瓜籽分离蛋白的 sds page 电泳得到至少 7 条谱带 分子量 主要分布在 35kda 45kda 左右以及 25kda 以下 3 采用plackett burman实验设计结合响应面优化酸性蛋白酶制备南瓜籽抗氧化 肽的工艺条件 最终确定水解条件为 温度50 水解ph 2 5 水解时间5 h 底物 浓度0 05 g ml 加酶量6000 u g 在该条件下得到的dpph清除率为92 82 4 通过单因素实验初步确定 alcalase 蛋白酶制备南瓜籽降血压肽的最佳工艺 参数为 加酶量 6000u ml ph 为 8 温度为 55 底物浓度为 0 06g ml 水解时 间为 4h 此时水解度为 12 74 5 南瓜籽酶解液一次超滤的工艺参数为 操作压力 0 25mpa 料液浓度为 3 料液 ph 为 7 操作时间为 60min 二次超滤的工艺参数为 操作压力 0 2mpa 料液浓度为 2 料液 ph 为 7 操作时间为 60min 酸性蛋白酶解液和 alcalase 蛋 白酶解液经过超滤以后分子量小于 4000da 的组分均占到 95 以上 且分别具有更 强的抗氧化活性和降血压活性 关键词 南瓜籽 蛋白质 功能性质 活性肽 响应面法 超滤 ii abstract in this thesis defatted powder of pumpkin seeds was produced by supercritical carbon dioxide extraction technology the extraction and functional properties of pumpkin seed proteins the preparation of active peptides through enzyme hydrolysis as well as ultrafiltration technology of enzyme hydrolysate were studied simultaneously sds page gel electrophoresis technology and gel column chromatography were respectively used to analysis the molecular weight distribution of the proteins and peptides then the antioxidant and ace inhibitory activities were researched in vitro tests some conclusions were got as follows 1 the best conditions of alkaline extraction and acid precipitation for producing protein isolate from pumpkin seed were a temperature of 50 solid liquid ratio 1 30 ph 11 0 and time 1 5h under these conditions the extraction ratio was up to 85 52 and the purity of protein reached 91 07 it was found that sulfur amino acids was the first restrictive in pumpkin seed protein and lysine was the second one the essential amino acid index of pumpkin seed protein is 0 8687 so it is one of good protein resources 2 the solubility of pumpkin seed protein was changed with ph there was minimum solubility beteen the ph of 5 0 and 6 0 the water and oil absorption were both at 1 2 160 g g or so emulsifying ability under suitable ph reached 80 foaming ability were relatively weak at least 7 spectral bands were showed in sds page electrophoresis get of pumpkin seed protein the molecular weight mainly distributed in the 45kda 35kda and 25kda below 3 the antioxidant peptides of pumpkin seed were produced by acid protease optimization of the process was through plackett burman experimental design with the response surface methodology finally the best technological conditions were determined as temperature50 ph 2 5 hydrolysis time 5h substrate concentration 0 05g ml and enzyme quantity iii 6000 u g in this condition the scavenging activity of dpph radical was up to 92 82 4 the optimum parameters of antihypertensive peptides using alcalase protease is determined primarily by single factor experiments was that enzyme quantity 6000u ml ph 8 temperature 55 substrate concentration 0 06 g ml hydrolysis time 4h then hydrolysis degree for 12 74 5 the enzyme hydrolysate of pumpkin seed protein was ultrafiltered first as pressure 0 25 mpa concentration 3 ph 7 operating time 60min parameters of the second ultrafiltration technology as pressure 0 2 mpa concentration 2 ph 7 operating time 60min after ultrafiltration the two kinds of hydrolysate by acid protease and alcalase protease obtained more than 95 percent components of less than 4000da which had stronger antioxidant activity and antihypertensive activity respectively key words pumpkin seed protein functional properties active peptides response surface methodology ultrafiltration 56 承诺书 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是在导师指导下独立 完成的 学位论文的知识产权属于山西大学 如果今后以其他 单位名义发表与在读期间学位论文相关的内容 将承担法律责 任 除文中已经注明引用的文献资料外 本学位论文不包括任 何其他个人或集体已经发表或撰写过的成果 学位论文作者 签章 20 年 月 日 57 学位论文使用授权声明 本人完全了解山西大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留并向国家有关机关或机构送交论文的复印件 和电子文档 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或 扫描等手段保存 汇编学位论文 同意山西大学可以用不同方 式在不同媒体上发表 传播论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后遵守此协议 作者签名 导师签名 20 年 月 日 第一章 绪论 1 第一章 绪论 南瓜学名cucurbita moschata duch 是葫芦科南瓜属一年生蔓性草本植物 原产 于中 南美洲 现在世界各地都有种植 范围广泛 产量巨大 南瓜主要有五个栽 培种 分别是 西葫芦 cucurbit pepo l 又名美洲南瓜 笋瓜 cucurbit maxima duch 又名印度南瓜 南瓜 cucurbit moschata buch 又名中国南瓜 黑籽南瓜 cucurbit ficifolia bouche 和灰籽南瓜 cucurbit mixta pang 据联合国粮农组织 fao 1994年统 计 全世界南瓜种植面积为1102万亩 其中中国种植面积为141万亩 约占全球八分 之一 居世界第一 尤其以华北 东北 西北 华中 西南 台湾等地区分布最广 近年来 人们发现南瓜不仅营养丰富 而且药用价值很高 1 3 目前市场上一系 列南瓜产品应运而生 如南瓜粉 南瓜罐头 南瓜饼干等 然而 20 世纪末我国已 进入老年型国家行列 研究开发针对老年人常见病与多发病的功能食品 其社会效 益和经济效益更显著 利用南瓜种子 花 叶及加工副产物开发饲料产品也已有报 道 4 5 随着农副产品综合利用的深化 研制开发以南瓜副产品为原料的高科技含量 的制品以及对其中活性物质的研究成为一大发展方向 1 1 南瓜籽的研究概况 南瓜子 semen moschatae 又称白瓜子 金瓜子 是南瓜成熟的种子 其含有 大量的油脂 蛋白质 维生素和矿物质等营养成分 是我国的传统特产和外贸商品 同时也是一味药食两用的中药 南瓜子品种繁多 来源广泛 其丰富的营养价值日 益受到世界发达国家的重视 已被公认为保健食品 极具开发潜力 1 1 1 南瓜籽的营养组成 据报道南瓜籽中粗脂肪含量较高 达到40 4 41 0 包含油酸 亚油酸 棕 榈酸 硬脂酸 亚麻酸等十几种脂肪酸 其中不饱和脂肪酸 主要是亚油酸 油酸 棕榈酸 含量为76 9 91 5 平均比大豆油 84 3 葵花籽油 89 4 略低 而亚油酸含量达到43 0 64 0 与大豆油 葵花籽油接近 6 7 当然 由于产地 品种的不同 不同的南瓜籽的含油量和脂肪酸组成存在显著差异 但其仍然是目前 最具开发价值的新型油料资源 南瓜籽蛋白质含量高达30 40 特别是脱脂美洲南瓜种子的蛋白质含量高达 66 54 高于富含蛋白的大豆 48 32 南瓜籽含有平衡性很好的各种必需氨基 酸 包括人体必需的8种氨基酸和儿童必需的组氨酸 并且有与人体所需氨基酸组成 模式相似的必需氨基酸比例 据测定 4 美洲南瓜种子的氨基酸总量527 1mg g 高 南瓜籽蛋白制备及其活性多肽的研究 2 于大豆种子 456 5mg g 必需氨基酸含量为180 7mg g 占氨基酸总量的34 3 南瓜籽蛋白质在人体中的吸收率可达88 97 生理效价为73 86 蛋白质 的品质好 含量高 可见南瓜籽是一种优质的植物蛋白资源 8 9 南瓜籽还含有丰富的类脂 维生素 矿物质等 据报道 南瓜籽含有植物甾醇 甾醇酯 膦脂酰丝氨酸 脑苷脂 类胡萝卜素等 10 类脂 含有维生素b1 维生素b2 维生素c 维生素e 维生素p 泛酸等维生素 特别是具有高抗氧化活性的 生育酚 含量最高可达到410mg 620mg kg干重 11 南瓜籽还含有锌 硒 锰 铜 铁 钙 磷 镁 钾 钠等矿质元素 12 和水苏糖 棉籽糖 胰蛋白酶抑制剂 植酸 单宁酸 等其它成分 13 1 1 2 南瓜籽的开发利用 南瓜籽作为南瓜的副产品 廉价易得 大多被废弃 造成资源浪费和环境污染 其实南瓜籽经过清理 去皮后 可采用压榨法 浸出法 超临界co2 萃取法等方法 提取油脂 同时对提取的粗油进行精炼 即可得到香味浓郁 风味独特的南瓜籽油 其品质可以和大豆色拉油等油脂相媲美 提油后的饼粕含有丰富的蛋白质 是优质 的植物蛋白资源 唐云等 14 通过分析我国南瓜相关发明专利的现状 也指出南瓜籽 中有两大值得开发的成分即南瓜籽油和南瓜籽蛋白 1 1 2 1 南瓜籽油的提取 南瓜籽油的提取最普通的是溶剂萃取法 该法提取的南瓜籽油必须经过精炼才 能食用 而精炼过程不可避免地会破坏南瓜籽油中的天然成分 降低南瓜籽油的营 养价值 王晓等 6 采用索氏提取法提取南瓜籽油 利用正己烷提取6h 旋转蒸馏回收 溶剂 提取率为41 4 研究表明改进方法 还可进一步的提高出油率 宋琳琳等 15 也 采用同样的方法提取南瓜籽油 在单因素的基础上通过正交试验得出最佳条件为提 取温度60 时间4h 料液比1 10 w v 此时提取率达83 88 冷榨法可以很好地保存南瓜籽油的天然成分 是目前广受推崇的加工方法 缺 点是产品不具有浓香口味 且出油率较低 陈钊等 16 对南瓜籽的不同冷榨工艺进行 研究 发现利用冷榨方法生产高品质南瓜籽油是可行的 并且不同的冷榨设备 冷 榨工艺 出油率不同 在冷榨工艺中 进行必要的加热处理可以提高南瓜籽油中脂 溶性维生素的含量 特别是ve的含量 魏冰 17 比较了目前国内外南瓜籽油研究开发 的状况 提出冷榨技术制取的南瓜籽油具有独特的风味 同时可以最大限度的避免 蛋白质的变性和活性物质的损失 是很有前景的制取南瓜子油的方法 传统的热榨工艺制取的南瓜籽油出油率较冷榨法高 具有类似香油的浓香味道 第一章 绪论 3 但因加工温度过高使许多天然成分遭到破坏 降低了营养价值 甄成等 18 研究比较 了一种改进热榨工艺与冷榨工艺制得的南瓜籽油的品质和稳定性 发现两者无显著 差异 这意味着该工艺可以同时解决冷榨工艺香味不足和出油率偏低的问题 超临界流体萃取法也可以很好地保存油脂中的天然成分 目前研究也较多 陆 国东等 19 和任建等 20 研究了超临界co2萃取南瓜籽油的工艺条件 探讨了原料含水 量和萃取条件对南瓜籽油萃取率和质量的影响 采用超临界流体萃取技术提取南瓜 籽油得率提高 饼粕蛋白变性小 工艺可行 有利于南瓜籽的综合利用 但加工成 本颇高 对于南瓜籽油这种非高价位产品来说是需要考虑的 微波和超声波萃取技术是当前植物油最为常用的先进提取工艺之一 微波萃取 技术具有设备简单 萃取效率高 节省试剂 污染小 重现性好等特点 而超声波 萃取技术可以有效克服浸出时间长 浸出温度高 杂质浸出多 能源消耗大等缺陷 从而提高植物油脂制取的经济效益 王小溪等 21 以无壳南瓜籽为材料 通过单因素 和正交设计 寻找南瓜籽油超声波提取的优化工艺条件 研究发现 石油醚是提取 南瓜籽油的理想溶剂 且最佳工艺参数是温度60 时间35min 料液比6 1 v w 超声频率和功率为59khz 280w 此时得油率为39 04 麻明友等 22 采用微波和超 声波对南瓜籽油的萃取进行了对比研究 采用正交法得到两种方法的最佳条件 结 果表明 两种方法萃取南瓜籽油都是可行的 从萃取率看 微波略优于超声波 但 是超声萃取温度低 故二者各有优点 1 1 2 2 南瓜籽饼粕的利用 南瓜籽饼粕含有丰富的蛋白质 维生素和矿物质等 在美国和加拿大早有将其 加工成高蛋白的动物饲料或肥料的报道 目前开发的重点则是其中的蛋白质 国内 对榨油后的南瓜籽饼粕未能充分开发利用 还处于起步阶段 李燕杰等 23 对南瓜籽 饼粕的可开发性和其中蛋白质资源的综合利用进行综述 提出了南瓜籽饼粕开发的 两种思路 即作为全部蛋白原料和作为部分蛋白原料 指出南瓜籽蛋白产品和蛋白 饮料的开发具有一定的市场前景 同时 南瓜籽多肽及其生理活性的研究作为一个 新的思路被提出 这对南瓜籽饼粕资源的开发具有重要的意义 1 1 3 南瓜籽的保健功能 1 1 3 1 驱虫作用 南瓜籽可以驱除蛔虫等寄生虫 其有效成分是南瓜子氨酸 南瓜子氨酸对犬绦 虫的头节 末成熟节段和成熟节段都有麻痹作用 24 对猪带绦虫也有麻痹作用 对 神经无损伤 25 不产生任何毒副作用 很适合老人与儿童患的寄生虫病症 南瓜籽蛋白制备及其活性多肽的研究 4 1 1 3 2 缓解高血压作用 zuhair h a 26 等通过动物实验研究发现 给自发性高血压小鼠饲喂南瓜籽油四 周可以改善小鼠体内自由基清除剂的含量 当与血管紧张素转换酶抑制剂配合给予 时 显著提高治疗的效果 这表明南瓜籽油具有缓解高血压的功效 1 1 3 3 抗氧化和抗炎作用 xanthopulou m n 等 27 用两种不同的方法制备南瓜籽提取物 以 dpph 清除率 为指标评价其抗氧化活性 同时以对大豆脂肪氧化酶活性的抑制来评价抗消炎的作 用 结果表明 南瓜籽提取物清除自由基的能力主要取决于总酚的含量 而丙酮提 取组分则表现出最强的脂肪氧化酶抑制活性 1 1 3 4 对前列腺细胞增殖的影响 tsai ys等 28 发现南瓜籽油单独或者辅以植物缁醇可以阻止睾丸素 哌唑嗪引发 的前列腺增生 hong h 等 29 也从临床上证明了南瓜籽油对于预防和治疗前列腺细 胞增殖的安全性和有效性 从而再次挖掘了补充和替代医学的巨大作用 1 1 3 5 降血糖作用 蔡同一等 30 观察了南瓜种子发芽前后的脱脂蛋白粉对糖尿病大鼠降血糖作用 的影响 结果表明发芽后的种籽蛋白具有显著的降血糖效果 而这与发芽处理后精 氨酸含量的增加有着直接的联系 1 1 3 6 其他作用 pumar m 等 31 研究了南瓜籽粉对小鼠的肠道影响 发现了南瓜籽粉作为一种纤 维膳食的巨大潜力 它能增加小鼠排泄物的重量和体积以促进通便 de cerqueira pm 等 32 通过动物实验评价南瓜籽粉对小鼠葡萄糖和脂代谢的影响 结果表明南瓜 籽粉是一种良好的蛋白油脂 特别是纤维来源 1 2 南瓜籽蛋白的研究概况 1 2 1 南瓜籽蛋白的组成 张玉秀等 33 曾对瓜类种子蛋白质组分进行研究 发现南瓜种子蛋白约有10个组 分 含量高的组分为56kd球蛋白和12 5kd清蛋白 黄秀丽 34 等人对南瓜属4个栽培 种中国南瓜 印度南瓜 美洲南瓜及黑籽南瓜的12个品种种子蛋白组分进行了分析 结果显示中国南瓜 印度南瓜及美洲南瓜种子以水溶性蛋白种类居多 盐溶蛋白种 类较少 酸溶蛋白种类更少 黑籽南瓜则以盐溶性蛋白种类居多 其次为水溶性蛋 白 酸溶性蛋白 庄东红 35 等人通过介质因素对南瓜种子蛋白质溶出率的影响分析 第一章 绪论 5 发现南瓜种子贮藏的蛋白质主要是溶于碱的谷蛋白 其次为球蛋白 清蛋白 醇溶 蛋白以及溶于酸的谷蛋白 该结果与前人报道过的瓜类种子蛋白质主要是12s球蛋白 不一致 jacks 36 发现葫芦科种子球蛋白占总蛋白的70 90 含氮量为18 由2 6 个亚基组成 而清蛋白含氮量为12 由9 12个比球蛋白分子量低的亚基组成 此 外 giami 37 研究了发芽的凹槽南瓜籽 telfairia occidentalia hook 结果发现凹槽 南瓜籽中主要是清蛋白和球蛋白 在未发芽种子中占58 6 其次是谷蛋白 醇溶蛋 白含量最低 发芽以后 清蛋白和谷蛋白分别增加61 5 和57 0 而醇溶谷蛋白则 减少54 6 球蛋白组分在萌芽前期增加在结束时减少 1 2 2 南瓜籽蛋白质的营养价值 王萍 38 等人研究了我国内蒙古地区南瓜属3个主要栽培种6个品种的南瓜籽的氨 基酸组成 发现谷氨酸含量均最高 占氨基酸总量的20 23 其次是精氨酸 占 总量的14 17 含硫氨基酸含量最低 为7 15 9 83mg gdw 从人体必需氨基 酸看 中国南瓜品种含量较高 而缬氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸4种必需氨 基酸含量6个品种均超过fao规定的标准 oyebiodum 39 以telfaria occidentalis为材料 研究了凹槽南瓜籽的营养价值 比 较了未成熟和成熟南瓜籽蛋白的氨基酸组成 与全蛋氨基酸相比 含硫氨基酸是第 一限制性氨基酸 赖氨酸和苏氨酸是第二限制性氨基酸 像大多数其他油籽一样 南瓜籽中缺乏蛋氨酸 胱氨酸和赖氨酸 富含天冬氨酸 精氨酸和谷氨酸 蔡同一 30 等对南瓜籽发芽前后的脱脂蛋白粉进行氨基酸分析 发现发芽前后脱 脂蛋白粉氨基酸总量分别占总蛋白的32 82 和36 73 经过发芽处理后氨基酸组分 中变化最大的是精氨酸 增加了2 50 其次是谷氨酸增加了1 95 亮氨酸 天冬 氨酸分别增加了1 07 和1 00 1 2 3 南瓜籽蛋白的制备 分离蛋白 rpi 和浓缩蛋白 rpc 一般通过碱法和酶法获得 碱法是提取蛋 白质的传统方法 至今仍在使用 酶法提取蛋白反应条件温和 易于控制 且所获 得蛋白质具有溶解性 乳化性 起泡性等特点 还可能产生具有多种功能的生物活 性肽 是推荐使用的方法 目前国内外对南瓜籽蛋白的提取工艺进行专门研究的报道很少 主要是采用碱 溶酸沉淀法 庄东红 35 等探讨了5种因素对南瓜种子蛋白质溶出率的影响 结果表明 蛋白质的溶出率受ph值 介质的影响较大 其次为料液比 浸提温度和浸提时间 南瓜籽蛋白制备及其活性多肽的研究 6 初步确定南瓜种子蛋白质提取的较佳条件为 料液比1 100 ph值12 0的碱性条件 下 37 浸提1 0h giami 40 利用碱液浸提的方法获得浓缩蛋白 使粗蛋白含量由原 来的46 4 52 7 增加到61 5 70 8 浓缩蛋白的得率在24 5 29 4 回收率 也达到64 8 65 2 1 2 4 南瓜籽蛋白的功能性质 1 2 4 1 溶解性 蛋白质的溶解性是蛋白质的基本物理性质之一 会影响蛋白质的其他功能性质 和实际应用价值 evangelos 41 对脱脂南瓜籽粉的某些功能性质进行研究 发现脱脂 南瓜籽粉 c pepo and c maxima 的溶解度与 ph 有关 在 ph 为 3 0 7 0 的范围 内氮溶解度最小 低于 10 当 ph 为 2 0 时 氮溶解度为 13 当 ph 值为 11 0 时 92 的氮可被溶出 另外 还发现在 ph 为 5 0 7 0 的范围内 氮溶解度随着 盐浓度的增加而增加 即使是在等电点处 也因为盐溶效应表现出相对较高的溶解 性 giami 37 40 发现发酵的南瓜籽粉和浓缩蛋白的氮溶解度都很低 分别为 35 2 和 36 6 可能是由于热处理的结果 而萌芽可以促进凹槽南瓜籽的氮溶解度 其原 因可能是 一方面发芽的种子有高的蛋白水解能力 另一方面贮藏蛋白被水解 1 2 4 2 吸水性和吸油性 蛋白质吸水性与食品储藏过程中保鲜及保型有密切关系 还与食品黏度有关 而吸油性则与蛋白质种类 来源 加工方法 温度及所用油脂有关 evangelos 41 发 现脱脂南瓜籽粉的吸水性和吸油性分别为24 8 2 03g 100g和84 4 4 05g 100g 吸水性 与大豆粉 葵花籽粉 棉籽粉相比要低 吸油性与大豆粉和小麦粉相近 但是低于 葵花籽粉和棉籽粉 因为蛋白质与水的相互作用与水合位点的数量和性质 物理化 学环境以及系统的热力学性质等有关 所以低吸水性和相对较高的吸油性可能是由 于极性氨基酸较少和油脂含量较高的缘故 南瓜籽蛋白包含较多的非极性侧链 这 些非极性侧链约束了油脂的碳氢化合物基团 从而导致了较高的持油性 另一个原 因可能是球蛋白含量较高 而球蛋白与清蛋白相比 吸水性要低 这是由这两种蛋 白的浓度和分子结构决定的 另外 giami 40 发现南瓜籽粉及其浓缩蛋白比起发芽或 发酵的南瓜籽粉及其浓缩蛋白有更好的吸水能力 而浓缩蛋白比起南瓜籽粉有相对 较好的吸油性 1 2 4 3 凝胶性 蛋白质的凝胶特性随蛋白质的不同而不同 分子质量大并且疏水性氨基酸含量 高的蛋白质能形成强度高的凝胶体系 evangelos 41 研究发现脱脂南瓜籽粉的最低凝 第一章 绪论 7 胶浓度为8 w v giami 40 报道发芽和发酵对南瓜籽粉的凝胶特性没有显著影响 但是显著改进了浓缩蛋白的凝胶特性 最低凝胶浓度是6 这表明经过发芽和发酵 的南瓜籽蛋白浓缩物需要更低的蛋白浓度即可形成凝胶 1 2 4 4 起泡性 evangelos 41 研究发现脱脂南瓜籽粉的起泡能力和泡沫稳定性在碱性ph范围内 随着蛋白溶解度的增加而提高 这与棉籽蛋白相似 而在酸性范围内 当ph为2 0时 起泡能力显著增加 但是与在碱性环境中相比泡沫稳定性要差 在ph为4 0左右 即 南瓜籽蛋白等电点附近 起泡能力和泡沫稳定性均最差 onimawo 42 发现发酵显著 影响了南瓜籽蛋白的起泡能力 可能是由于发酵过程的热处理使蛋白遭到不同程度 的变性 溶解度的降低导致了起泡能力的下降 giami 40 发现浓缩蛋白与南瓜籽粉相 比 泡沫体积增加 但是稳定性降低 2h之内就完全消失 发芽处理可以增加起泡 能力 但是和发酵一样 泡沫稳定性降低 此外 南瓜籽蛋白在水中的表观粘度与蛋白浓度 盐浓度和温度有关 发酵处 理降低了南瓜籽蛋白的乳化能力和乳化稳定性 同时提高了南瓜籽蛋白的膨胀能力 和分散性 后者可能与碳水化合物的增加和油脂含量的降低有关 1 3 南瓜籽多肽的研究状况 蛋白质酶解产生的多肽往往具有一定的生理活性 特别是对食物蛋白源活性多 肽的研究已经相当广泛 近年来国内外也有研究人员开始对南瓜籽多肽进行研究 刘政等 43 以南瓜籽粕为原料 以水解度为指标 采用木瓜蛋白酶和as1 398蛋白酶双 酶协同水解制备南瓜籽低分子肽 得到最佳条件为 加酶量19 底物浓度35mg ml 温度50 ph7 0 双酶质量比1 1 水解时间3h pericin d等 44 将响应面法应用于优 化裸仁南瓜籽分离蛋白的酶解工艺 结果表明采用酸性蛋白酶在温度为30 ph为 3 00 加酶量为0 137 v v nacl浓度为0 84 的条件下水解32 5h 水解度最大接 近50 并且模型的相关系数高达0 946 vastag z等 45 也采用响应面法研究了酸性蛋 白酶酶解南瓜籽油饼分离蛋白的工艺条件 并考察了酶解液的dpph自由基清除活 性 结果显示在40 加酶量为4 38hut mg的条件下水解85min 水解度达到最大 值42 94 而 dpph清除率在50 下达到最大34 40 这表明温度对酶解液的活 性影响最大 较高的温度有益于获得抗氧化活性高的多肽 1 4 生物活性肽的研究 生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益的或具有生理作用的肽类化合物 南瓜籽蛋白制备及其活性多肽的研究 8 46 他们具有多种多样的功能 如免疫调节 抗高血压 抗氧化 促进生长等等 由二到十几个氨基酸组成的生物活性肽被称为功能性短肽 研究表明机体对短肽的 吸收速度比游离氨基酸快得多 因此功能性短肽的生物价值和营养价值更高 有着 巨大的开发潜力 近几年抗氧化肽和降血压肽的制备 分离纯化 结构鉴定及其功 能性评价已经成为人们研究的热点 并且技术上日趋成熟 1 4 1 生物活性肽的制备 目前 生物活性肽的获得途径主要有三种 第一种方法是从生物体中直接提取 天然存在的功能性短肽及发酵后需要得到的多肽 即应用一些分离设备和技术将所 需的目标肽从原料中分离出来并对其进行分析和利用 第二种方法是合成法 主要 有化学合成 dna重组技术 酶合成 其中酶合成法应用较为广泛 合成方法的选 择主要依靠所需目的肽的量和其肽链长度 47 49 第三种方法是蛋白酶解法 该法能 在温和的条件下进行 且能定位水解产生特定的肽 水解进程易于控制 是目前制 备生物活性肽的主要方法 1 4 2 酶解制备抗氧化肽的研究 通常人们把具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基功效的生物活性肽称 为抗氧化肽 生物体内的天然抗氧化肽含量很低 运用各种蛋白酶水解不同来源的 蛋白质制备高活性的抗氧化肽有着广阔的前景 制备抗氧化肽的原料大致可分为三方面 大宗优质蛋白资源 海洋蛋白资源和 废弃蛋白资源 50 目前国内外已经在植物 动物水解蛋白的抗氧化肽方面做了大量 的研究 取得了一些成果 以大豆蛋白为例 沈蓓英等 51 和刘大川等 52 分别以酸性 蛋白酶和碱性蛋白酶2709对大豆分离蛋白酶解 前者发现抗氧化肽的分子量在700左 右 后者则发现水解物为分子量在2000以下的多肽具有明显的抗氧化活性 陈美珍 等 53 发现大豆分离蛋白酶解物具有清除羟自由基的能力 王力剑等 54 研究表明大豆 酶解物具有清除超氧阴离子 抑制脂质过氧化和部分抑制双氧水的作用 xu等 55 用 碱性蛋白酶制备大豆活性肽 并用葡聚糖凝胶g 25分离水解产物 发现具有抗氧化 活性的大豆肽多含有7个氨基酸 目前抗氧化肽活性的评价方法主要有三类 一是对人工生成自由基的清除能力 二是特定条件下对测试体系中脂类物质氧化的抑制能力 三是用特定条件下样品的 还原能力反映被测物的抗氧化活性 56 其中最常用的自由基包括dpph自由基 羟基 自由基 超氧阴离子自由基和氧自由基 虽然有多种抗氧化活性的检测方法 但是 由于反应的多样性和复杂性 尚未形成一种标准 因此对于某一被测物的抗氧化活 第一章 绪论 9 性至少使用两种不同的方法 而且最好是使用与动物实验相结合的方法综合评价 1 4 3 酶解制备降血压肽的研究 降血压肽又称为血管紧张素转化酶 angioensin i converting enzyme 简称ace 抑制肽 它只对高血压患者起到降压作用 而对正常者无降压作用 因此与化学合 成药物相比具有很高的安全性 已成为目前研究的热点 据报道 酪蛋白 乳清蛋白 鱼肉蛋白和玉米蛋白酶解产物中均含降血压肽 在日本以鱼类为原料生产的降血压肽已经呈规模化生产 日本学者利用嗜热菌蛋白 酶消化鲣节鱼得到8种具有不同降血压活性的肽段 而我国降血压肽的研究刚刚处于 起步的阶段 吴建平等 57 利用大豆低温粕为原料 经过蛋白酶水解处理后获得了两 种具有降血压效果的活性肽 其一级结构分别为asp leu pro和asp gly 采用hplc 对ace抑制动力学进行了探索 发现大豆降血压肽是ace的竞争性抑制剂 与已发 现的大多数ace抑制剂的作用模式相符 吴建平等 58 用胃蛋白酶水解米糠蛋白 经 色谱分离纯化获得了结构为ile ala pro asn tyr val ala pro ala gly thr tyr phe和 glu glu cys pro cys ala asn cys cys gly gly的三种降血压肽 降血压活性的评价包括体外实验和动物实验 还有临床实验 59 目前对食源性 多肽的体外筛选主要是对ace酶的抑制活性的测定 最常用的方法是以马尿酰组氨 酰亮氨酸hippuryl his leu hhl 为底物的分光光度计法 60 ace抑制剂的活性以 ic50即抑制50 ace活性的ace抑制剂浓度来表示 有学者发现 一些活性肽动物降 血压实验的结果与体外实验不一致 即体外有降血压活性的多肽在体内则不起作用 因此评价食物来源的多肽是否具有降血压的功能 动物实验以及人体试食试验和临 床观察是最客观的评价方法 1 5 本课题研究意义及主要内容 近年来 功能肽对人体的各种保健功能越来越受到食品界和医药学界的高度关 注 特别是抗氧化肽和降血压肽已成为生物活性肽研究领域开发的重点 南瓜籽作 为南瓜的主要副产品 产量巨大 廉价易得 这些籽资源大多被用作饲料或被堆积 甚至直接废弃 不仅造成资源的浪费 而且造成环境污染 经初步研究表明 南瓜 籽的蛋白质含量高 氨基酸的组成平衡 是一种应用价值很高的优质植物蛋白质资 源 因此利用生物技术开发廉价易得的南瓜籽蛋白资源获得活性多肽有着良好的市 场前景和社会效益 目前国内外对南瓜籽的研究主要集中在南瓜籽油的开发 而对提油后饼粕中蛋 南瓜籽蛋白制备及其活性多肽的研究 10 白质的研究很少 特别是南瓜籽肽的开发仍处于空白阶段 故有很大的研究空间 本课题即以美洲南瓜子 粒塞金 为原料 通过对南瓜籽蛋白及其酶解液的研究 旨在获得具有较强抗氧化活性和降血压活性的的多肽 为南瓜籽肽产品的开发及其 在食品 保健品中的应用奠定基础 本课题主要研究内容如下 1 南瓜籽蛋白质的制备及其功能性质研究 以脱脂南瓜籽粉为原料 采用碱溶酸沉法提取南瓜籽分离蛋白 通过单因素和 正交设计优化提取工艺 并考察获得的分离蛋白的氨基酸组成 功能性质以及分子 量范围 2 南瓜籽抗氧化肽的酶解工艺研究 从酸性蛋白酶 中性蛋白酶 木瓜蛋白酶等6种蛋白酶中筛选制备抗氧化肽的最 适用酶 在单因素的基础上 通过pb plackett burman 设计结合响应面分析法优化抗 氧化肽的酶解工艺 3 南瓜籽降血压肽的酶解工艺研究 从酸性蛋白酶 alcalase碱性蛋白酶等4种蛋白酶中筛选制备降血压肽的最适用 酶 然后以水解度为指标 通过单因素实验获得相应的酶解工艺参数 4 南瓜籽蛋白酶解液的超滤分离及其活性研究 考察操作压力 温度 ph和时间因素对超滤分离过程中膜通量和膜效能的影响 得到最佳的超滤条件 将两种酶解液分别进行超滤 并用凝胶层析色谱法测定分子 量范围 考察不同分子量多肽的抗氧化活性和降血压活性 第二章 南瓜籽蛋白的制备及其功能性质研究 11 第二章 南瓜籽蛋白的制备及其功能性质研究 目前 有关南瓜籽蛋白提取的专门报道较少 国外对脱脂南瓜籽粉和南瓜籽浓 缩蛋白的功能性质有所报道 40 41 而国内还几乎处于空白 庄东红 35 等探讨了 5 种 因素对南瓜种子蛋白质溶出率的影响 通过介质因素的比较研究 指出碱液和盐溶 液提取的效果最好 董原等 61 采用盐提酸沉的方法制备南瓜籽分离蛋白 并把其功 能性质与大豆分离蛋白做了比较 本章则以脱脂南瓜籽粉为原料 采用碱溶酸沉法 考察相关因素对南瓜籽蛋白提取率的影响 并通过正交设计优化提取工艺 然后对 分离蛋白的氨基酸组成和部分功能性质进行研究 从而为南瓜籽蛋白质的开发利用 奠定理论基础 2 1 材料及仪器 2 1 1 材料与试剂 南瓜籽 粒赛金 山西省晋黎来种业有限公司 菜籽油 市售 牛血清白蛋白 美 国 sigma 公司 考马斯亮蓝 g250 美国 solarbio 公司 其他试剂均为国产分析纯 2 1 2 仪器与设备 scf 1l 45mpa 广州市轻工研究所 101 2ab 电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪 器有限公司 hh 4 数显恒温水浴锅 国华电器有限公司 al204 电子分析天平 梅 特勒 托利多仪器 上海 有限公司 sp 2000uv 型紫外可见分光光度计 上海光谱 仪器有限公司 tdl 5 离心机 上海安亭科学仪器制造 868 型 ph 测试仪 美国奥 立龙公司 pl3000 真空冷冻干燥仪 thermo 公司 fa 25 型实验室高速剪切分散乳 化机 德国 fluko 公司 2 2 实验方法 2 2 1 基本成分测定方法 2 2 1 1 水分含量测定 62 105 烘箱恒重法 2 2 1 2 脂肪含量测定 62 索氏抽提法 2 2 1 3 蛋白质含量测定 微量凯氏定氮法 62 考马斯亮蓝法比色法 63 2 2 2 原料预处理方法 将去皮南瓜籽在60 烘箱中烘4小时 使水分含量在5 以下 然后粉碎 利用超 临界co2萃取技术进行脱脂 19 20 脱脂条件为 萃取釜压力25mpa 萃取温度45 分离柱压力10mpa 分离温度50 co2流量2 4 4 2l h 南瓜籽蛋白制备及其活性多肽的研究 12 2 2 3 南瓜籽分离蛋白的提取方法 2 2 3 1 实验流程 南瓜籽脱脂粉 一定温度 一定 ph 水浴浸提 离心分离 上清液 调 ph 到等电 点 离心分离 沉淀洗涤至中性 冷冻干燥 成品 2 2 3 2 蛋白质提取率的计算 蛋白质提取率 脱脂南瓜籽粉的取样量质含量脱脂南瓜籽粉中的蛋白 提取液体积提取液蛋白质含量 100 2 1 脱脂南瓜籽粉的蛋白质含量的测定用微量凯氏定氮法 提取液中的蛋白质含量 的测定用考马斯亮蓝比色法 2 2 3 3 南瓜籽分离蛋白提取工艺的确定 2 2 3 3 1 南瓜籽分离蛋白提取的单因素实验 1 料液比 在温度为 40 ph 为 10 0 料液比分别为 1 10 1 20 1 30 1 40 和 1 50 条件下进行搅拌提取 1h 离心分离 测定上清液中的蛋白质含量 2 ph 值 在料液比为 1 40 温度为 40 ph 分别为 8 0 9 0 10 0 11 0 和 12 0 的条件下进行搅拌提取 1h 离心分离 测定上清液中的蛋白质含量 3 时间 在料液比 1 40 ph 为 11 0 温度为 40 时间分别为 0 5h 1h 1 5h 2h 和 2 5h 条件下进行搅拌提取 离心分离 测定上清液中的蛋白质含量 4 温度 在料液比 1 40 ph 为 11 0 温度分别为 20 30 40 50 和 60 条件下进行搅拌提取 1 5h 离心分离 测定上清液中的蛋白质含量 2 2 3 3 2 南瓜籽蛋白等电点的测定 64 将南瓜籽蛋白提取液用 1mol lhcl 调节 ph 分别为 4 5 4 7 4 9 5 1 5 3 5 5 5 7 5 9 使蛋白质沉淀 离心后取上清液进行比色测定 吸光度值最小的点对应 的 ph 为蛋白质的等电点 2 2 3 3 3 正交实验设计 表 2 1 正交试验因素水平 因素 水平 a 温度 b 料液比 m v c ph 值 d 时间 h 1 30 1 30 10 1 2 40 1 40 11 1 5 3 50 1 50 12 2 在单因素实验的基础上 采用 l9 34 正交设计进行实验 如表 2 1 第二章 南瓜籽蛋白的制备及其功能性质研究 13 2 2 4 氨基酸组成分析及营养价值评价方法 2 2 4 1 氨基酸组成及含量测定 委托山西省粮食局储粮检测中心检测氨基酸组成及含量 采用酸水解法 取适量干燥的南瓜籽蛋白粉 用 6mol lhcl 在 110 条件下水 解 22h 用日立 835 50 型氨基酸自动分析仪测定除色氨酸以外的 17 种氨基酸 2 2 4 2 蛋白质营养价值评价 目前对蛋白质营养价值评定主要包括蛋白质含量 蛋白质消化率 蛋白质生物 价及蛋白质评分等 65 氨基酸评分 aas 是其中一种相对简便的化学分析方法 可以通过氨基酸自动分析仪直接测得 以 1973 年 fao who 联合推荐的必需氨基 酸模式和全鸡蛋氨基酸模式做参比 计算三种反映蛋白质氨基酸组成情况的指标 66 即氨基酸评分 aas 化学评分 cs 和必需氨基酸指数 eaai aas 100 基酸含量 评分模式中相应必需氨每克 必需氨基酸的含量 每克样品蛋白质中某种 mgwhofao mg 2 2 cs 100 应必需氨基酸含量 每克鸡蛋评分模式中相 必需氨基酸的含量 每克样品蛋白质中某种 mg mg 2 3 式中 n 为样品中必需氨基酸数目 i 为样品中各种 必需氨基酸含量 ai 为鸡蛋蛋白中相应的必需 氨基酸含量 i 1 2 n 2 4 2 2 5 南瓜籽分离蛋白功能性质测定方法 对实验室自制的南瓜籽分离蛋白分别进行溶解性的测定 67 吸水性测定 68 吸 油性测定 69 70 乳化性 71 和起泡性的测定 68 2 2 6 蛋白质分子量分布的测定方法 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 sds page 72 2 3 结果与分析 2 3 1 南瓜籽的基本化学组成 表 2 2 南瓜籽基本成分分析 样品 水分 粗蛋白 粗脂肪 南瓜籽粉 5 66 34 98 41 52 脱脂南瓜籽粉 6 34 66 32 8 73 2 3 2 南瓜籽蛋白提取工艺的确定 2 3 2 1 牛血清白蛋白标准曲线的绘制 100 1 1 n n i i i a eaai 南瓜籽蛋白制备及其活性多肽的研究 14 以牛血清标准蛋白溶液中蛋白含量 mg 为横坐标 以吸光度值 a 为纵坐 标绘制标准曲线如图 2 1 所示 线性回归方程为 y 0 0073x 0 0848 相关系数为 r2 0 9993 可见回归方程具有很好的相关性 y 0 0073x 0 0848 r2 0 9993 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 020406080100 蛋白含量 mg 吸光度 a 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 4 44 755 35 65 96 2 ph 吸光度 a 图 2 1 牛血清白蛋白标准曲线 图 2 2 吸光度随 ph 的变化曲线 2 3 2 2 南瓜籽蛋白的等电点 由图 2 2 可见 当 ph 为 5 3 左右时 南瓜籽蛋白提取上清液的吸光度值最小 也就是说此时蛋白质沉淀最多 故确定南瓜籽蛋白的等电点为 ph 5 3 2 3 2 3 南瓜籽蛋白提取的单因素实验结果 30 40 50 60 70 80 1 101 201 301 401 50 料液比 w v 提取率 20 30 40 50 60 70 80 78910111213 ph 值 提取率 图 2 3 料液比对提取率的影响 图 2 4 ph 值对提取率的影响 2 3 2 3 1 料液比对蛋白提取率的影响 由图 2 3 可以看出 随着料液比的增加 蛋白质的提取率不断增大 但料液比 增加到 1 40 以后蛋白提取率增加缓慢 基本趋于稳定 考虑到料液比太大会增加 后处理的负担 因此初步选择料液比为 1 40 2 3 2 3 2 ph 值对蛋白提取率的影响 由图 2 4 可以看出 随着 ph 的不断增大 蛋白质的提取率呈先上升后下