（细胞生物学专业论文）金鱼生长激素Ⅰ和人角质细胞生长因子异源表达的研究.pdf

金鱼生长激素i 和人角质细胞生长因子异源表达的研究 中文摘要 ( 1 ) 鱼生长激素( f i s hg r o w t hh o r m o n e ，f g h ) 是鱼类脑垂体中分泌的促进生长 的单一亚基的蛋白激素。它参与鱼的生长代谢，能够加速蛋白质合成和脂类降 解等生理功能，具有增强食欲、提高饲料转化率的作用。天然鱼g h 含量极低， 分离纯化成本较高。基因工程技术为生产大量低成本的鱼生长激素创造了条件， 且很多实验证明重组鱼g h 具有天然鱼g h 的功能，却不会对人体产生激素副作 用。因此，生产基因重组鱼g h 在养殖领域具有重要的应用价值。 用引入酶切位点b a m hi 和n o ti 的引物，以质粒p b l u e s c r i p ts k - g f g h ，为模 板，p c r 扩增获得- - f g f g h ，编码区序列，分别定向插入原核表达载体p e t - 2 8 a 和 p g e x 一4 t - 2 中，构建了原核表达载体p e t 2 8 a - g f g h ，和p g e x 一4 t - 2 一g f g h ， p e t 2 8 a - g ；f g h ，转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，在1 0m mi p t g 诱导下，表达出融合 蛋1 刍( h i s ) 6t a g g f g hi ，该蛋白分子量大约为2 6 k d ；经质谱以及抗h i s 抗体的 w e s t e r n b l o t t i n g 鉴定，该融合蛋白即为表达的目的蛋白；经超声鉴定该蛋白为包 涵体形式存在，尝试用连续超声破碎的方法，回收该蛋白纯度可达8 5 。1 ，免疫 小鼠，间接e l i s a 法检测抗体效价为1 ：1 6 0 0 。 p g e x 4 t - 2 蒯，质粒转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，经1 0 mmi p t g 诱导 可表达分子量约4 6k d 的特异蛋白g s t t a g - g f g hi 。在2 8 - 3 7 c 温度条件下分 别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白，经2 8 诱导的茵体裂解液上 清经g s tr e s i n 纯化获得g s t t a g - g f g hi 。纯化的g s t t a g g f g hi 腹腔注射锦 鲤( c r y p r i n u sc a r p i o d ) ，经4 周处理后，实验组的体重增长率比对照组高2 4 6 8 ，体长增长率比对照组高1 1 8 2 。经t 检验统计分析表明，表达的重组g f g hi 具有显著的促锦鲤生长作用( p 0 0 5 ) 。 利用植物作为生物反应器生产具有医用价值的蛋白或者抗体是植物基因工 程的一个研究热点。同大肠杆菌等微生物相比，植物作为生物反应器具有翻译 后正确的修饰、加工，生产成本低的优点，构建了植物表达载体 p 1 3 0 1 3 5 s - g f g h ，t n o s ，通过农杆菌介导法转化了水稻愈伤组织。对得到的再 生水稻通过组织化学染色、p c r 检测，确认外源基因已经成功插入水稻基因组 中。进一步通过r t - p c 鼢对转基因株系分析，证明g f g h ，基因可以转录。对转 金鱼生长激素i 和人角质细胞生长因了异源表达的研究 基因植株子代进行p c r 和r t - p c r 检测，发现g c g h ，基因能成功的遗传给子代且 在子代中同样能够转录成功。 ( 2 ) 角质细胞生长因子( k g f ) 是成纤维细胞生长因子( f g f s ) 家族的成员， 即f g f 7 ，最初从人胚胎肺成纤维细胞的培养上清中分离纯化获得。k g f 在表 皮细胞的生长和更新过程中起着重要作用，能加快膀胱、肾和肠的损伤修复和 促人角膜上皮细胞生长。毕赤酵母具有分子遗传操作简单、外源蛋白高水平表 达、具有近似于哺乳动物细胞翻译后的修饰与加工功能和安全性好等特点。 用e c o ri 和n o ti 酶切质粒p m d l 8 - t - k g f ，胶回收后定向插入p p i c 9 k 质 粒，构建酵母表达质粒p p i c 9 k k g f 。p p i c 9 k - k g f 质粒用b p u l l 0 2i 酶切线性 处理化后转化毕赤酵母，用g 4 1 8 m d 平板法、菌落p c r 和总d n ap c r 法筛 选重组子，以及m m m d 筛选法鉴定重组菌株表型为h i s + m u t + ，用r t - p c r 分 析表明，k g f 在酵母中成功转录，用s d s p a g e 分析表明，重组k g f 蛋白可 在毕赤酵母中获得表达，分子量与预期的k g f 蛋白大小相近，对蛋白摇瓶表达 条件进行优化，诱导4d 后蛋白表达量达到最高。 关键词：金鱼生长激素；表达；纯化；水稻；角质细胞生长因子；毕赤酵母 2 金鱼生长激素l 和人角质细胞生长因子异源表达的研究 a b s t r a c t ( 1 ) f i s hg r o w t hh o r m o n e ( f g h ) p r o d u c e db yt h ep i t u i t a r yc e l l so ft e l e o s t s i tc a n i n c r e a s et h ee x p r e s s i o no fp r o t e i n ，d e g r a d a t i o no fl i p i da n dp l a ya ni m p o r t a n tp a r ti n t h eg r o w t ho ff i s h h o w e v e r ，t h ec o n t e n to fn a t i v ef g hi np i t u i t a r yi se x t r e m e l yl o w a n dt h ee x p e n d i t u r eo fp u r i f i c a t i o ni st o oh i g h f o r t u n a t e l y ，i ti sp o s s i b l et op r o d u c e r e c o m b i n a n tf g ha b u n d a n t l y a n dt h e yh a v eb e e np r o v e di nm a n yc a s e st h es a m e f u n c t i o na st h en a t i v eo n e sw i t h o u ta n ys i d ee f f e c tt oh u m a n t h e r e f o r e ，i ti sv a l u a b l e t oi n v e s t i g a t et h ep r o d u c t i o no fr e c o m b i n a n tf g h t h eg c g hic d n aw a sa m p l i f i e db yp c ru s et h eo l i g o n u c l e o t i d e sw h i c hw e r e d e s i g n e dt og e n e r a t eab a m his i t ea t5 e n da n dan o tia tt h e3 e n d t h ep c r p r o d u c tw a sp u r i f i e dw i t hp c rp u r i f i c a t i o nk i ta n dd i g e s t e dw i t hb a m hi a n dn o t id i g e s t i o n ，u s e dg e lt oh a r v e s t i tw a st h e nl i g a t e di n t ot h ec o r r e s p o n d i n ga n d b a m hia n dn o tir e s t r i c t i o ns i t e si nt h e e x p r e s s i o n v e c t o r p e t 2 8 aa n d p g e x 一4 t - 2 ，w h i c hw a sn a m e dp e t 2 8 a - g f g hl a n dp g e x 一4 t - 2 一g f g hi t h e r e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dp e t 2 8 a - g f g h1w a st r a n s f o r m e di n t ob l 21 ( d e 3 ) a n df u s i o np r o t e i n ( h i s ) 6t a g g f g hi ( a b o u t2 6k d ) c o n t a i n i n ga ( h i s ) 6t a ga tt h e n t e r m i n u sw a se x p r e s s e da f t e r1m mi p t gi n d u c t i o n m si d e n t i f ya n dw e s t e r n b l o t t i n gi n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s e dr e c o m b i n a n tp r o t e i nw a s ( h i s ) 6t a g - g f g h t h e r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sm a i n l yi nt h ef o r mo fi n c l u s i o nb o d y t h ee x p r e s s e d p r o d u c ti sp u r i f i e dw i t hc o n t i n u o u su l t r a s o n i cw a v es ot h a tw eo b t a i nt h ep u r i f i e d f u s i o np r o t e i no fr e c o m b i n a n t ( h i s ) 6t a g - g f g hi ，t h eh i g hp u r i f i e dp r o t e i nw a su s e d a sa n t i g e nt oi m m u n em o u s e d i r e c t l ya n dh i g hq u a l i t ya n t i s e r u mw a so b t a i n e da n d t h ee f f i c i e n c yo fa n t i b o d yw a s1 16 0 0 ，w h i c hs h o w e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i n p o s s e s s e sg o o di m m u n o g e n i c i t y t h ev e c t o rp g e x - 4 t - 2 一f f f g h1 w a st r a n s f o r m e di n t ob l 21 ( d e 3 ) w h i c hc a nb e i n d u c e db y1m mi p t gt op r o d u c eas p e c i a lp r o t e i ng s t t a g g f g hio f4 6k di n m o l e c u l a rw e i g h t t h es p e c i a lp r o t e i nc a nb em a i n l yi nf o r mo fs o l u b l ep r o t e i no r i n c l u s i o nb o d yw h e ni n d u c e da t2 8 - 3 7 。cr e s p e c t i v e l y t h ec e l l si n d u c e da t2 8 c 金鱼生长激素t 和人角质细胞生长因子异源表达的研究 w e r ed i g e s t e db yl y s o z y m ea n dd i s r u p t e db ys o n i c a t i o n a f t e rb e i n gc e n t r i f u g e dt h e s u p e r n a t a n tw a sp u r i f i e db yg s tr e s i n g s t t a g - g f g hi f u s i o np r o t e i nc o u l db e a b s o r b e d s p e c i f i c a l l y o nt h i sc o l u m n t h eh i g h p u r i f i e dg s t t a g g f g h1w a s d i s s o l v e di nt h es t e r i l es a l i n ea n dw a si n j e c t e df a n c yc a r p ( c r y p r i n u sc a r p i o d ) i n t r a p e r i t o n e a l l ya tt h ed o s eo f0 1 肛g g 。1b o d yw e i g h tw e e k 1 f o ro n e t e s t e dg r o u p ，a n d c o n t r o lg r o u pw a st r e a t e dw i t l ls t e r i l es a l i n ew i t h o u tg f g hi a f t e r4w e e k i n j e c t i o n s t h eg r o w t hr a t eo ff a n c yc a r pi n j e c t e d 谢t l lp u r i f i e dg s t t a g g f g hi ，w a s f o u n dt ob e2 4 6 8 h e a v i e rt h a nt h ec o n t r o l ，a n d11 8 2 l o n g e rt h a nt h ec o n t r o l 。 t h e a n a l y s i s o ft e s ti n d i c a t e d g s t t a g g f g his h o w e d t h e s i g n i f i c a n t g r o w t h - p r o m o t i n ge f f e c t si nb o d yw e i g h ta n db o d yl e n g t ho nf a n c yc a r p 伊 o 。0 5 ) w i t hs i g n i f i c a n td i f f e r e n c e o n eo ft h eh o t t e s ts t u d i e si np l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n gi st h a tu s i n gt h ep l a n t b i o r e a c t o rt op r o d u c tt h eu s e f u lm e d i c i n eo ra n t i b o d y c o m p a r e dw i t ht h em i c r o b e l i k eec o l i ，p l a n ta sab i o r e a c t o ri se d i b l e ，c o s tl o w , a n dh a se u k a r y o t i c p o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n s w ec o n s t r u c t e dp l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp 1 3 0 1 3 5 s - g f g hi t n o s ，t h e n ，t h eg f g h g e n ew a si n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m eo fr i c ev i a a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n se h a 10 5m e d i a t i o na n dr i c ee f f e c t i v et r a n s f o r m a t i o n s y s t e mr e s p e c t i v e l y r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eg f g h _ h a sb e e nt r a n s f e r r e di n t or i c e c u l t i v a r s ( z h o n gh u a l1 ) w i t hp c ra n a l y s i s ，a n dg u sg e n ee x p r e s s i o nd e t e c t i o n t h em r n a t r a n s c r i p t i o no fk f g hii nr e g e n e r a t e dp l a n tw e r ed e t e c t e db yr t - p c t l t h er e s u l t ss h o w e dt h a tg f g hic a nt r a n s c r i p ti nt h et r a n s g e n i cr i c e ，t h i si n d i c a t e s t h a tg f g hic a nb ee x p r e s s e ds t a b l y w i t hp c ra n dr t - p c ra n a l y s i so ft r a n s g e n i c t 1g e n e r a t i o np l a n t ，w ef o u n dt h a tt h eh e r e d i t yo f 酾hic a ns u c c e e di ng i v i n g t r a n s g e n i c t 1g e n e r a t i o np l a n ta n dg f g hi c a nt r a n s c r i p ti nt h et r a n s g e n i ct 1 g e n e r a t i o np l a n t ，t o o ( 2 ) k e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o ri sam e m b e ro ft h ef i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ( f g f ) f a m i l ya n dw a so r i g i n a l l yi s o l a t e df r o mt h ec o n d i t i o n e dm e d i u mo fah u m a n e m b r y o n i cl u n gf i b r o b l a s tc e l ll i n e k g fp l a y e dac e n t r a lr o l ei nt h eg r o w t ha n d r e n e wo fe p i d e r m a lc e l l i tc a na c c e l e r a t et h eb l a d d e r 、n e p h r i d i u m 、i n t e s t i n e sa n d c o r n e a le p i d e r m a lw o u n dh e a l i n g a l s o ，i tc a na l l e v i a t et h ec h e m o t h e r a p ya n d 4 金鱼生长激素i 和人角质细胞牛长因子异源表达的研究 i r r a d i a t i o ni n d u c e di n j u r e p i c h i ap a s t o r i sb e a r sc h a r a c t e r i s t i c st h a ts u i td e m a n d so f p r o d u c i n gr e c o m b i n a n tb i o p h a r m a c e u t i c a l s ，s u c ha st h es i m p l i c i t yo fg e n em a n i p u l a t i o n ，t h ea b i l i t yo fp r o d u c i n gf o r e i g np r o t e i na th i g hl e v e la n dp e r f o r m i n gm a n y e u k a r y o t i cp o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n s k g f g e n ef r a g m e n to b t a i n t i n e db yd i g e s t i o np m d 18 一t - k g fw i t he e o ria n d n o ti d i r e c t l yi n s e r t e di n t op p i c 9 kp l a s m i dt op r o d u c ep p i c 9 k k g f t h e nt h e p p i c 9 k - k g fp l a s m i dw a sl i n e a r i z e da n dt r a n s f o r m e di n t op p a s t o r i sb yc h e m i c a l t r a n s f o r m a t i o n t h er e c o m b i n a n ts t r a i n sw e r es e l e c t e db yg 418 - m dp l a t e s ，a n dt h e n w e r ei d e n t i f i e dc o l o n yp c rt o t a lg e n o m ed n ap c r a n dt h eh i s + m u t + p h e n o t y p e w a sp e r f o r m e db ym m m dp l a t e s t h em r n aa n dp r o t e i ne x p r e s s i o nw e r ea s s a y e d b yr t - p c ra n ds d s p a g e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ek g fw a sd e t e c t e db y r t - p c ri nt h ep p a s t o r i sa n dan e wp r o t e i nb a n dw a sf o u n di ns d s p a g ew i t h m o l e c u l a rm a s so fa b o u t2 3k d t h e s ei n d i c a t e dt h a tt h ek g fw a sc o r r e c t l y t r a n s c r i b e da n dt r a n s l a t e di nt h ep p a s t o r i s t h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tf a c t o r so n r e c o m b i n a n tp r o t e i np r o d u c t i o nd u r i n gi n d u c t i o np h a s ew a ss t u d i e d a f t e r4d a y s i n d u c t i o ni ns h a k ef l a s k ，t h ee x p r e s s i o no fp r o t e i nr e a c h e dm a x i m u m k e yw o r d s ：g o l d f i s hg r o w t hh o r m o n ei ；e x p r e s s i o n ；p u r i f i c a t i o n ；r i c es e e d l i n g s ； k e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o r ；p i c h i ap a s t o r i s 5 金鱼生长激素t 和人角质细胞生长因子异源表达的研究 缩略词 g f g hi ( g o l d f i s hg r o w t hh o r m o n ei ) k g f ( k e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o r ) b s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) k a n ( k a n a m y c i n ) a m p ( a m p i c i l l i n ) n a a ( n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d ) 2 ，4 一d ( 2 , 4 一d i c h l o r o p h e n o x ya c e t i ca c i d ) 6 - b a ( 6 一b e n z y l a m i n o p p u r i n e ) a s ( 3 , 5 - d i m e t h o x y - 4 - h y d r o x ya c e t o p h e n o n e ) h y g ( h y g r o m y c i nb ) c e f ( c e f o t a x i m es o d i u m ) g u s ( 1 3 - g l u c u r o n i d a s e ) c t a b ( c e t y l t r i e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ) x g l u c r t - p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t a s e p c r ) i p t g ( i s o p r o p y l p d - t h i o g a l a c t o s i d e ) e l i s a ( e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ) h r p ( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ) p b s ( p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e ) s d s p a g e ( s d s - p o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s ) a o x ( a l c o h o l o x i d a s e ) b m g y ( b u f f e r e dg l y c e r o l - c o m p l e xm e d i u m ) b m m y ( b u f f e r e dm e t h a n o l c o m p l e xm e d i u m ) g 418 ( a n t i b i o t i cg - 418s u l f a t e ) m u t + ( m e t h a n o lu t i l i z a t i o np l u s ) m u t 8 ( m e t h a n o lu t i l i z a t i o ns l o w ) 金鱼生长素i 角质细胞生长因子 牛血清白蛋白 卡那霉素 氨苄霉素 萘乙酸 2 ，4 二氯苯氧乙酸 6 苄基氨基嘌呤 乙酰丁香酮 潮霉素b 头孢氨苄 p 一葡糖醛酸糖苷酶 十六烷基三甲基溴化铵 5 - 溴一4 一氯- 3 一吲哚p d 一葡糖苷酸 反转录聚合酶链式反应 异丙基d d 一硫代半乳糖苷 酶联免疫吸附测定 辣根过氧化物酶 磷酸缓冲液 s d s 一聚丙稀酰胺凝胶电泳 醇氧化酶 平衡甘油复合培养基 平衡甲醇复合培养基 抗生素g 4 1 8 甲醇利用野生型 甲醇利用缓慢型 6 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为(植物细胞与基因工程) 课题( 组) 的研究成果，获得(植物细胞与基因工程) 课题( 组) 经费 或实验室的资助，在(生物i i 馆2 2 2) 实验室完成。( 请 在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明 内容的，可以不作特别声明。) 声明人( 签名) ：妻未绘 砂矿年- 7 月弓日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年 月日解密，解密后适用上述授权。 (4) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：妻j 嘻 金鱼生长激素i 和人角质细胞生长因子异源表达的研究 第一章金鱼生长激素i ( g f g hi ) 在大肠杆菌和水稻中的 表达衣尬 1 前言 1 1 鱼生长激素的结构和功能 鱼生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，g h ) 为蛋白质类激素，是由鱼脑下垂体前 叶的嗜酸性细胞合成和分泌的单链多肽，鱼类g h 具有促进鱼体蛋白质合成、提 高饵料转化效率、加速脂肪代谢和增强鱼体高盐环境适应能力等功能，对鱼体的 生长发育和机体代谢有着重要调节作用【l 】。它最基本的生理功能是促进鱼体生长 和参与多种促合成代谢作用。此外，它还参与鲑科鱼类和罗非鱼类等多种鱼类的 低渗调控从而促进在海水中适应的过程【2 】o 它在鱼类水产养殖业上具有重大的作 用，因而得到人们越来越普遍的重视。 1 1 1 鱼生长激素的分离 首次分离鱼类g h 的工作开始于7 0 年代的中后期，1 9 7 6 年f a r m e r 等采用与分 离哺乳动物g h 相类似的方法，在莫桑比克罗非鱼( o r e o c h r o m i sm o s s a m b i c a ) 中首 次提纯出鱼生长激素【3 1 。8 0 年代中后期鱼生长激素逐渐形成研究热点，目前国际 上已有几十种鱼类的g h 被分离纯化，鱼类g h 的分离最初是沿用类似哺乳类g h 分离的方法，主要是采取在碱性条件下匀浆破碎提取，经柱层析分离，再经盐或 等电点沉淀的方法得到，后来发现这种方法沉淀的g h 难以溶解【4 巧】。近来，许多 研究者采用柱层析后经离子交换层析，再经r p h p l c 纯化，避免了沉淀法的缺点 【6 】 o 1 1 2 鱼生长激素的结构 1 1 2 1 生长激素的基本结构 鱼类生长激素为单链蛋白质类激素，一般含有1 8 7 1 8 8 个氨基酸，分子量多 为2 1 2 2k d ，如狐鲣( s a r d as a r d a ) g h 和金枪鱼( t h u n n u st h y n n u s ) g h 分子 量为2 1k d ；罗非鱼g h 的分子量为2 2 2l ；而牙鲆( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 的分子量为2 0k d ；鳗鲡( a n g u i l l ar o s t r a t a ) g h 的分子量为2 3k d ；鱼类g h 7 金鱼生长激素t 和人角质细胞生长因子异源表达的研究 等电点在5 6 7 1 之间【7 1 。鱼类生长激素一级结构中含四或五个半胱氨酸，分子 内形成两个二硫键。在空间构型中，仪螺旋占5 0 ，折叠成四个反向平行的螺 旋段，即a 、b 、c 、d 段，在每一区段之间至少有一个脯氨酸存在，序列比较 发现在蛋白的羧基段d 区保守性比其他位置强，这一区域的疏水氨基酸埋在蛋 白内部，作为受体结合位点，同时在维持蛋白四级结构中其重要作用【8 】。 1 1 2 2 鱼生长激素的基因结构 最先被克隆的鱼类g h 基因是大麻哈鱼g he d n a ，编码区全长6 3 0b p ，由g h e d n a 推导g h 前体由2 1 0 个氨基酸组成，其中2 2 个氨基酸为信号肤序列，成熟肽 由1 8 8 个氨基酸组成。到目前为之，已有多达几十种的鱼类g h 基因被克隆，对各 种鱼类g h 的基因结构研究结果发现，鱼类的g h 基因大小一般为3 4k b ，g c 含量 一般在4 0 以下，而哺乳动物的g h 基因约2k b 。一部分鱼类g h 基因由6 个外显 子和5 个内含子组成，而另一部分鱼类g h 基因由5 个外显子和4 个内含子组成，并 且不同鱼类g h 基因的长度不尽相同。同时研究者发现具有两种g h 的鱼类均有两 种不同的g h 基因，分别编码两种g h 蛋刨9 1 。 1 1 2 3 金鱼生长激素及其基因结构 金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ，g o l d f i s h ) 属于鲤形目鲤科。金鱼生长激素( g o l d f i s h g r o w t hh o r m o n e ，g f g h ) 和其他鱼生长激素不同的是它共有两类，分别是g f g hi 和g f g h i i 。其中g f g h e d n a 长1 0 9 9b p ，它没有5 端的非编码区，它的3 端的非 编码区长4 6 9b p ，能够在终止密码子的4 6b p 后形成一个发夹结构。g f g h 长 1 1 6 1b p ，有4 0b p 位于5 端的非编码区，然而在4 8 7b p 长的3 端非编码区并没有发 现具有发夹状的二级结构。两种金鱼生长激素的编码区仅有4 3 个核苷酸是不同 的，而且这些不同的核苷酸中又有2 8 个氨基酸并没有引起改变。因此，g f g h ， 和g f g h 堋译后的氨基酸序列只有1 1 个氨基酸是不同的【l0 1 。值得注意的是 g f g i y ，编码的多肽和其他鲤科鱼类的生长激素更为相似，共含有5 个半胱氨酸 ( c y s ) 残基( c y s 一4 9 ，c y s - 1 2 3 ，c y s - 1 6 1 ，c y s 一1 7 8 ，, i c y s - 1 8 6 ) 。而g f g h 编码的 多肽和其他脊椎动物的生长激素类似，只含有4 个半胱氨酸残基，它并不含有 c y s 一1 2 3 。c y s 残基的存在有助于生长激素的正确折叠，c y s 4 9 和c y s 1 6 1 ，以及 c y s 1 7 8 和c y s 一1 8 6 间形成的两个s s 键是维持金鱼生长激素正确结构的主要键 能。g f g hi 中i 幂j c y s 一1 2 3 并不参与s s 键的形成1 1 1 1 。 8 金鱼生长激素t 和人角质细胞生长因子异源表达的研究 1 1 3 鱼生长激素的功能 8 0 年代己来，对鱼类g h 生理功能研究进展较快。现己证实，鱼类g h 除与哺 乳动物g h 具有相似地促合成代谢作用外，还具有参与渗透调节等特殊地生理功 能。g h 发挥功能主要途径有两个：一是诱导肝细胞、肌细胞产生生长激素介质， 再经由介质间接起作用；二是直接作用于靶细胞产生生理效应。无论那一种方式 g h 都需要首先同细胞表面特异性受体结合，再由受体介导，激发一系列胞内的 生化反应最终导致相应的生理效应的发生，研究发现鱼g h 对哺乳动物的生长激 素受体无任何结合活性【8 】。 1 1 3 1 促进生长的作用 研究证实，将牛、猪和人的g h 通过肌肉或腹腔注射、埋植或高渗浸泡等手 段注入鱼体，具有显著的促进生长作用。而且，外源的鱼类g h 同样具有促进鱼 类生长的作用。g h 促进生长通过直接和间接两种方式进行作用，直接作用指g h 直接作用于靶细胞上的g h 受体，通过g h 相关的信号转导途径来刺激细胞的分 化；间接作用指通过诱导产生“促细胞分裂原”、类胰岛素生长因子i ( i g f i ) 来发挥促生长的作用。除g h 刺激原始软骨细胞的有丝分裂是属于直接作用外， g h 的大量局部效应都是日h i g f i 介导的【1 2 】。i g f i 作为g h 的中介体，在调节生 长中起核心作用。g h 刺激多种前体细胞的分化，分化的细胞受到i g f i 的作用， 进行有丝分裂，导致细胞数量的增加。g h 促生长效应表现为促进细胞代谢( 质) 和促进细胞分化( 量) ，g h 能够调节细胞内脂类、糖类、蛋白和矿物质等的代 谢，g h 增加蛋白合成，并延缓蛋白降解，表现出间断的促进蛋白合成作用【l3 1 。 女n h i g g s 等( 1 9 7 5 ) 用牛生长激素埋植和注射两方法对银大麻哈鱼( o n c o r h y n c h u s k i s u t c h ) 进行处理，结果实验鱼生长要比对照鱼快得多【1 4 】。同样，金枪鱼( ( t h u n n u s t h y n n u s )生长激素增加了赤鲷( p a g r u s p a g r u s ) 的生长率1 5 】。草鱼生长激素促 进了草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 的生长。重组虹鳟生长激素促进了鲻( m u g i l c e p h a l u s ) 的生长率【1 6 】。重组金枪鱼生长激素通过注射、投喂都显著促进了草鱼 的生长【1 7 1 。由此可见，不同来源的生长激素或不同种属的生长激素在不同程度上 促进了鱼类生长。促生长效应根据生长激素类别、施用方法和受体鱼种类不同呈 现一定差异。 关于生长激素促进鱼类生长的生理机制一般认为是：( 1 ) 接受生长激素的 9 金鱼， i 长激素i 和人角质细胞生长因子异源表达的研究 鱼食欲增强和有更高的食物消耗；( 2 ) 提高了食物转化效率【l 】。在食欲增强的 情况下，胃容量和消化率决定食物吸收。食欲和食物吸收是密切相关的。有研究 表明生长激素增加了鱼类的食欲【l4 1 。m a c a r i 等( 1 9 9 4 ) 研究了食物和生长激素两 方面对鱼的影响，结果表明接受重组人生长激素处理的鱼并没有增加食物消耗。 普遍一致的观点认为生长激素改善了鱼类的食物转化效率1 8 】。j t h i s h i o k a 等 ( 1 9 9 2 ) 报道重组菱羊鲷生长激素处理的菱羊鲷幼鱼有更高的食物转化效率并随 着剂量的增加而增加【1 9 】。m a c a r i 等( 1 9 9 4 ) 报道接受重组人生长激素处理的实 验鱼比对照鱼有显著高的食物转化效率和蛋白质转化效率，并随着剂量的增加而 增加18 1 。 1 1 3 2 渗透调节作用 近些年来，激素对其盐度转变过程中的渗透作用研究逐步深入。人们发现生 长激素对海河洄游性鲑科鱼类渗透压调节有着很重要的作用。这种理论来源于生 长激素促进了鲑科鱼类对海水的适应能力【2 0 1 。其主要的生理机制是生长激素能提 高n a + 。k + a t p 酶的生物活性和鱼体内氯化物细胞( c h l o r i d ec e l l ) 的数目，同时 抑制鲑科鱼类从淡水到海水迁移时引起的血浆渗透性和离子浓度的提高。另外， 生长激素通过促进血浆中皮质醇和i g fi 含量的增加而起到促进鲑科鱼类对海水 的适应的作用1 2 1 1 。c l a r k e 等( 1 9 7 7 ) 研究了罗非鱼生长激素对大麻哈鱼幼鱼适 应海水环境的作用口2 1 。将幼鱼放入人工海水中，注射生长激素鱼的血浆钠离子浓 度明显低于未注射组，同时还观察到银大麻哈鱼在初次入海洄游过程中，其生长 激素细胞增生、肥大、分泌活动也变的很旺盛。在淡水中，羊生长激素提高了鲑 n a + 一k + a t p 酶的活性2 0 , 2 3 】。以上的证据能够表明，生长激素可以提高鱼对海水 的适应性，在渗透压调节方面，生长激素和催