植物逆境生理 第四章 植物与病原菌之间的生理生态关系.doc

第四章 植物与病原 菌之间的 生理生态关系第一节 致病毒素和植物抗毒 素第二节 病原菌侵染植物的过 程及对寄主植物的影响第三节 植物与病原菌互作和 抗病性的分子机制第四章植物与病原菌之间的 生理生态关系?植物除受食草动物（包括昆虫）的取食危害外， 还经常遭到真菌和细菌等病原菌的侵染而罹病。真 菌是侵染植物的主要类群。真菌门属低等的真核植 物，有10万余种，它们都无叶绿素，营寄生或腐生 活。营寄生的多数真菌寄生在植物体上。根据真菌 的形态、生殖和孢子等情况，把它们分为4个纲：藻 菌纲(Phycumycetae)、子囊菌纲（Ascommycetae）、 担子菌纲（Basidiomycetae）和半知菌纲 （Deuteromycetae）。在漫长的进化过程中，植物发展了各种各样 的抗病机制，筑起了一道又一道防线，部分有效 地抵御了病原菌的侵染；而病原菌在同植物的斗 争中，也发展了各种方式来攻破植物的防御使侵 染成功，得以在植物体上定居下来并繁衍后代。 植物和病原菌之间的相互关系是动态的，处于不 断的进化之中。在这种侵染和防御的对抗中，化 学手段是最重要的，同时环境因素也是很重要的。 德国植物病理学家Wheeler曾用了一句形象的话， 概括地说明了这个复杂关系。他说“可以把植物 的发病过程，看成是植物和病原菌之间进行的一 场战斗，环境是这场战斗的仲裁者。”的确，有 时侵染的成功与否，在某种意义上取决于当时的 环境条件，主要是温度和湿度。植物对病害的抵抗力是相当强的，它们受伤 后，伤口会很快愈合；侵入的微生物也会被杀死。 而且整株植物外面被角质层保护着，顶盔穿甲， 绝大多数病菌都不能透过这种角质层。许多植物 还会产生抑制微生物生长的物质，如亚麻根分泌 物中含有氰化物，燕毒叶中含有毒的糖苷。同时， 当细菌侵入植物体内时，植物会产生特殊的能杀 死病原微生物的物质植物抗病毒素。人们已 经发现多种植物抗病毒素，如四季豆产生的菜豆 素，豌豆产生的豌豆素等。对植物抗病和染病的研究属于植物病理学的 范畴，由于农业生产实践的要求，人们期望能找 到更有效防治植物病害的手段，因此，植物病理 学在近代有了较大的发展。植物病理学包括很多 内容，生理生态学主要是从生态学角度讨论植物 和病原菌相互关系之间的生理生化因素。第四章 植物与病原 菌之间的 生理生态关系第一节 致病毒素和植物抗毒 素第一节 致病毒素和植物抗毒素一、致病毒素 ? 二、植物抗毒素?第一节 致病毒素和植物抗毒素 一、致病毒素（pathotoxin）致病毒素专指植物病原物产生的对其它寄主有 毒的次生代谢物，是病原物与植物间相互识别、相 互作用过程中的产物，在植物病程中起着决定作用。 按照致病病原菌的种类，可分为植物病原细菌毒素 和植物病原真菌毒素。(一)植物病原细菌毒素目前研究较多的植物病原细菌毒素是棒杆菌 (Clavibacter michiganesis)、火疫病菌 (Erwiniaa mylovora)等病原细菌所产生的毒素。 棒杆菌毒素都是致萎毒素，已发现有3个亚种产生 毒素，包括马铃薯环腐病菌 (C.m.Subsp.sepedonicus)毒素，苜蓿萎蔫病菌 (C.m.Subsp.insidiosus)毒素和番茄溃疡病菌 (C.m.Subsp.michiganesis)毒素，在60年代就有 人报道马铃薯环腐病菌产生一种致萎糖肽，以后 又相继发现后两种毒素的化学结构均为糖肽。对于火疫病菌毒素在1974年证实了火 疫病症状与病菌产生的多糖毒素有关。对 于棒杆菌毒素的致病机理，认为马铃薯环 腐病菌毒素在细胞膜上有作用位点，苜蓿 萎蔫病菌毒素致萎的原因在于阻塞导管纹 孔膜孔，而番茄溃疡病菌毒素主要作用于 小叶导管部位。火疫病菌毒素的作用方式 已证明是由于使木质部水流阻力加大所致。1987年发现了一种植物细菌病的新病 原菌为xylella fastidiosa，它侵染葡萄、桃、 李、偏桃等许多观赏及莠草植物，还有桑、 无花果、榆、栎树、豚草、长春花等。病 害的症状是丛生、缺绿、叶缘坏死、叶片 和果实变小而脱落，树冠向顶性，新梢萎 蔫，树枝和根系枯萎，植株死亡。目前有 关这种病原细菌的毒素及致病机理还不清 楚。（二）植物病原真菌毒素 1寄主专化性真菌毒素 迄今为止已报道有9个属的21种植物病原真菌可以产 生寄主专化性毒素，其中15种明确了其化学结构。 这些寄主专化性毒素主要是由蠕孢菌和链格孢菌产 生的。蠕孢属寄主专化性毒素主要包括HV、HC、 MT、HS、HMC、。HV毒素是由燕麦维多利亚叶枯病 菌产生的，该毒素对抗病品种和感病品种的毒性差 异很大。关于它的化学结构是由一个肽基和一个含 氮杂环组成，肽部由天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、 缬氨酸、亮氨酸组成，是毒素的专化性部分，而含 氮杂环是一种萜类化合物，无专化性；HC毒素是由 玉米圆斑炭色蠕孢菌1号小种产生，1967年分离了此 毒素，1982年确定了其化学结构为一环状四肽 ，层析发现HC毒素有4种毒性成分，其中分离物1为主要 组分；HMT毒素是由玉米小斑菌的小种产生的，据 推测HMT毒素是由直线状的多酮醇组成的混合物，其 中一组分含有5个羟基和7个酮基，另一组分含6个羟 基和6个酮基；HS毒素是由甘蔗眼斑病菌产生的，它 是在1971年分离出来的，经理化分析，现已鉴定出 是一种环丙基- -半乳糖苷，该毒素有、 三种异构体，其中异构体对甘蔗毒性最强；HMC毒 素是由玉米小斑菌小种产生的，通过柱层析从玉 米小斑病菌小种培养滤液中分离到了4种分离物，并定名为HMC-亚毒素；HT毒素是由玉米大斑菌 1号和2号生理小种产生的寄主选择性毒素，通 过硅胶层析发现2号小种毒素有3种毒性成分， 而1号小种只有2种毒性成分。HO H HO C C NH Cl Cl H 2N HN OH O OH O OOCOOH NH HN HN O O CHCl O维多利亚长蠕孢毒素链格孢属的寄主专化性毒素主要包括：AK、 AM、AL、AF、ACT毒素。1933年报道的菊池链格 孢产生的毒素是报道最早的寄主专化性毒素，现 已发现AK毒素是两种毒素主成分和一种毒素次要 组分的混合物，主组分毒素已结晶提取，并定了 结构式。AM毒素是由苹果链格孢产生的一种寄主 专化性毒素，它是一环状四肽，由3种组分组成， 以毒性最强，III最弱。AL毒素是由番茄链格 菌产生的，由两种组分组成，经碱解成丙三羧酸 和氨基戊醇两部分，前者对番茄无毒性，后者则 保留了寄主选择性毒性。AF毒素是由草莓黑斑病 菌的簇生链格孢产生的一种寄主专化性毒素，该 菌产生的毒素含有3种组分，这3种组分结构上相似，但其生物活性不同。ACT是由柑橘黑腐菌宽 皮橘致病型产生。该毒素有两种组分，组分 对柑橘有毒，组分对柑橘无毒却对几个日本 梨品种有毒。C CO NH R CH CO NH C CO O CO C NHAM病毒 I:R=OCH3 : R=HIII: R=OH2非寄主专化性真菌毒素 近年来，有关非寄主专化性的植物病原真 菌毒素的研究报道很多，但大多都限于镰刀菌属 (Fusarium spp.) 、 长 蠕 孢 (Helminthosporium spp.)、链格孢菌(Alternaria spp.)、轮枝孢菌 (Verticillium)、尾孢菌(Cercospora)等产生的 毒素研究。 镰刀菌毒素包括单端孢霉烯类毒素和玉米 赤霉烯酮类毒素。常见的单端孢霉烯类毒素有雪 腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)，去氧雪腐镰刀 菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，乙酰去氧雪腐 镰刀菌烯醇(Acetoxydexynivalenol，AcDON)， 木霉毒素(Trichodermin)等。这类毒素都是倍半 萜，可引起致命的人畜病，有些对植物也有害。玉米赤霉烯酮类毒素包括玉米赤霉烯酮 (Zearalenone，ZEA)，玉米赤霉烯醇 (Zearalenol，ZEN)，4-酰基玉米赤霉烯酮(4Acetylzear-alenol，4-AcAEA)等。长蠕孢菌毒 素包括蛇孢腔毒素，麦根长蠕孢毒素及玉米长蠕 孢毒素等。蛇孢腔毒素是一种二倍半萜类毒素， 在水稻胡麻斑病菌及玉米小斑病菌中发现。链格 孢菌可产生细链格孢毒素和链格孢酸等非寄主专 化性毒素。前者是一种环四肽，后者是一种四酰 胺醇类化合物。引起棉花、番茄、马铃薯黄萎病 的大丽轮枝孢菌可产生轮枝孢毒素，可使棉花、 番茄和马铃薯等植物致萎。国内外的研究表明，这类毒素实际上是蛋白质、多糖和脂类的混合 物，而以蛋白质组分最为重要。尾孢菌产生的 毒素主要包括尾孢毒素、甜菜褐斑病菌毒素、 花生黑斑病菌毒素等。 80年代以来，随着分子生物学的研究进展， 在寄主专化性毒素和非寄主专化性真菌毒素作 用机理的研究上取得了一定的成果。HV、HS、 AK、AF及尾孢病菌毒素这些寄主专化性毒素的 作用位点是植物细胞质膜部位；玉米小斑病菌 毒素、粗皮柠檬黑斑病菌毒素及烟草赤星病菌 毒素的作用位点是线粒体；细链格孢毒素、HC 毒素、AM毒素对叶绿体的生理作用有所影响； 还有些毒素对酶、蛋白质及细胞内的超微结构有抑制、破坏作用。尤为指出的是HMT毒素对 寄主植物不仅可以影响细胞质膜，还可影响到 线粒体及叶绿体。 （三）致病毒素在植物及病原菌遗传工程中的应 用 1用于抗病植株的筛选 不论是利用传统方法或是遗传工程技术所 获得的抗病性遗传变异，都要求在感病植株的 群体中鉴定出抗病个体。这项工作通常采用接 种病原茵进行，是一个烦琐而低效的过程。因 此，有的研究工作者认为利用致病毒素是更有 效地鉴定活体植株或植株组织、细胞等器官和 原生质体的手段。利用致病毒素成功地筛选抗病植株或群体的例 子很多。其中由Helminthosporium victoriae 产生的HV毒素是研究早而且深入 的植物致病毒素。HV毒素是致病性因素，因为 缺乏产毒能力的分离菌不致病。而且HV毒素是 寄主专化性的，只侵染对该菌感病的植株。在 感病的群体中，这种毒素是鉴定极少数抗病植 株的强有力的工具。Wheeler和Luke用HV毒素 从块感病的燕麦地的100丛中选择出973株抗 病个体。这项研究和其它研究表明，所有高抗 HV毒素的植株都完全抗这种病原茵，而部分抗 毒素的植株对病原菌的反应是中等抗病性，由 于HV毒素是一个致病性因素，抗毒素的水平与 由该菌所致的病害的量是一致的。2用于杂草防治 将微生物用于杂草防治的设想可追溯到十 七世纪。其途径之是引入外来病原菌到当地 杂草群体中，使其变为地方流行病；另一个途 径是把病原菌的繁殖体的配方象化学除草剂一 样直接用于杂草防治。尽管杂草生防至今为止 成功的例子很有限，但借鉴微生物在其他有害 生物防治中成功地应用，其途径和方法是可行 的。病原微生物致病力强弱是防治杂草成败的 主要原因之一。根据当今生物及遗传工程技术 的发展水平以及在其他领域的应用成果，通过 基因操作，完全有可能使低致病力菌系获得较 强的致病能力。正如前面已经涉及的，已知某 些由病原菌产生的毒素能增强病原菌对寄主的 致病力。目前用传统的方法已经鉴定出一些控 制毒素产生的专性基因，如果控制一种毒素产 生的一个基因或一组基因能人工复制并转移到 对某种杂草是专性的病原菌中，增强的致病力 就能有效地降低杂草群体。考虑到杂草寄主病 原专化性毒素的发现不多，所以更有希望的工 作重点应放在控制非专化性毒素基因的复制和 转移上。（四）根据致病毒素研制杀菌新药 植物致病毒素 ，特别是寄主特异性毒素 (host specific toxin)在病害发生发展过程中具有重要的 作用。采用化学的方法中和毒素消除其有害作用或抑 制毒素产生，必然干扰病原菌的致病过程，从而达到 防治植物病害的目的。 1中和植物致病毒素 很早以来，人们就曾设想通过中和或钝化植物病 原菌毒素的方法达到防治植物病害的目的。 Zentmyer(1954)发现8-羟基喹啉苯甲酸酯可以通过内 吸治疗作用减轻油梨根腐病(Phytophthora cinnamomi)的发生。其原理被认为是中和了致病毒 素。 Feldman等(1950)曾设计出一种针对中和毒素筛选化学治疗剂的方法，并且开发出以水杨酸盐、 尿素、二氨基偶氮苯和熟石灰为组分防治荷兰 榆树枯萎病的化学治疗剂。Tamari等(1966)发 现，阿魏酸可明显提高水稻对稻瘟病的抗性。 侵入菌丝生长受抑制，叶组织呈现抗病的过敏 性反应。离体实验表明，阿魏酸对稻瘟病菌分 生孢子萌发完全没有影响，含有500 ppm阿魏 酸水稻汁液对孢子萌发及其以后的生长也无任 何作用。实验证明，阿魏酸提高水稻组织抗病 性的原因是由于阿魏酸及其氧化物对稻瘟病菌 产生的毒素稻瘟菌素(piricularin)具有 解毒作用。稻瘟菌素中添加一定剂量阿魏酸可以抵消对稻种芽长及根长的抑制作用，水稻植 株吸收一定量阿魏酸后同样具有这种作用。 一般认为，许多镰刀菌产生的镰刀菌酸毒 素对植物的有害作用是由于与呼吸酶中铁离子 形成络合物抑制呼吸所致。这种作用可用铁、 镍、锌、铜、锰等金属离子解除。其原理可解 释为是镰刀菌酸直接与金属离子形成络合物不 再与呼吸酶中铁离子发生反应的缘故。奥等 (1988)从蚕豆褐斑病菌(Ascochyta fabae)中 提取的毒素壳二孢素(ascochitine)同时 也是一种抗菌性物质，其毒性和抗菌活性可被 蛋白质、胨、天门冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、 铁离子等物质解除。某种化学物质若能促进植物病原菌毒素在 寄主体内代谢，也可减轻病害的发生。 Jost(1965)发现，萎蔫酸在番茄组织内代谢为 N-甲基萎蔫酰胺和5-甲基吡啶羧酸后无毒化， 将吲哚基醋酸稀溶液施与番茄后可增加对镰刀 菌属引起的萎蔫病的抗性，是由于促进了萎蔫 酸毒素的分解过程。 有时某种毒素对植物的毒性是由于抑制了 寄主代谢系统的某个环节使代谢中止，造成某 种中间代谢产物不能合成而引起的。此时若从 外部补充不足成分即能消除或减轻其有害作用。 例如，烟草野火病极毛杆菌(Pseudomonas tabaci)产生的野火毒素(wild fire toxin)的有害作 用是由于抑制了谷氨酰胺合成酶(glutamine synthease)，若人为地给予谷氨酰胺，就可保护烟草不受其害。此外，菜豆叶烧病菌毛杆菌 (Pseudomonas phaseolicola)产生的菜豆毒素 (phaseotoxin)可抑制寄主鸟氨酸氨甲酰基转 移 酶 (ornithine carbamoyl transferase) ， 导致瓜氨酸、精氨酸缺乏，引起组织黄化。若 在病斑部添加瓜氨酸或精氨酸，则48 h内黄化 病斑消失。 交链孢酸(alternaric acid)是茄链格孢 (Alternaria solani)的致病因子。李树正等 (1994)就多种化合物对交链孢酸的解毒作用进 行了研究。结果表明，KMnO4、FeCl3、 FeSO4、MnSO4柠檬酸铁等化合物具有这种作 用。将交链孢酸分别与上述化合物混合接种番 茄叶片，可不同程度地减弱交链孢酸的植物毒 性。这种解毒作用随化合物浓度提高而增强。将这些化合物制成一定浓度溶液喷施在番茄叶 片上然后接种番茄早疫病孢子悬浮液，可在一 定程度上减轻番茄早疫病的发生。交链孢酸溶 液中加入KMnO4等化合物后，其紫外吸收光谱图 发生明显的变化。已知交链孢酸对某些植物病 原真菌有抗菌作用，实验证明，KMnO4等化合物 可 明 显 逆 转 交 链 孢 酸 对 Botrytis cinerea 、 Sclerotinia sclerotiorum的抗菌活性。 研究认为，寄主特异性毒素敏感性寄主， 其组织细胞膜内存在与毒素结合的毒素受体， 抗病品种不存在这种受体。若使毒素受体发生 物理化学变化可降低感病组织的感病性。 Otani(1974)证实，对梨黑斑病敏感性梨叶组 织用二硫键还原剂DTT处理，或者用55热处理2秒，均可降低叶组织对毒素的敏感性。若 用DTT处理后再用巯基氧化剂5,5-二硫代-双-2硝基苯甲酸酯(DTNB)处理，可消除DTT对毒素 的保护作用，这些研究结果间接证明，感病性 梨组织细胞膜内存在的毒素受体可能是含有二 硫键的蛋白质。另有研究结果证明，巯基化合 物(sulfhydryl)、羧基化合物(carbonyl)、亚胺环 己醇化合物(cycloheximide)等对 Helminthosporirm victoriae的毒素具有保护作 用。但有报导指出，亚胺环己醇和磷酸酯酶 D(phospholipase D)对Periconia circinata毒素 起保护作用，而巯基化合物不起保护作用。这 些研究结果说明三种毒素的毒素受体或作用机 制似有不同之处。如何利用这些研究结果研制新的解毒剂，干扰毒素的寄主选择特性是值得重 视的研究课题。 2抑制毒素的生物合成 植物病原菌产生的毒素，其种类及能力因菌 种不同而受基因控制。抑制毒素的生物合成，从 理论上讲可减轻病害的发生。 许多研究表明，碳源、氮源、微量元素以及 氨基酸可影响毒素的产生。许多镰刀菌产生的萎 蔫酸毒素因改变培养基锌离子浓度或氮源而得到 控制。Rouxel等(1990)报道，把ZnSO4添加到油 菜黑胫病菌(Leptosphaeria maculans)生长的培养 基中，可降低致病毒素sirodesmin PL的浓度。把 ZnSO4施加到植株上能抑制子叶和真叶毒素的产 生。若将EDTA-Zn、ZnSO4或ZnCl2喷施到温室植株上可提高对黑胫病的抗性。Fernando(1986) 认为，高浓度钼对Myrothecium roridum有毒 代谢产物roridin E的产生有抑制作用。 Hansa(1988)报道，Aspergillus flavas在以 山梨糖或乳糖为碳源的培养基中不产生黄曲霉 毒素而葡萄糖和蔗糖是菌体生长、孢子形成及 毒素产生最好的碳源。小麦链格孢叶枯菌 (Alternaria triticina)毒素产量受碳、氮及 生长调节剂的影响，将葡萄糖、谷氨酸和2.4D添加到培养基中可获得大量的毒素。Takashi 等(1985)研究了26种化学物质对Alternaria alternata菌群致病性及分生孢子萌发时产生 毒素的影响。在A. alternata日本梨变种分生 孢子悬浮液中添加20 ppm蛋氨酸，对孢子萌发、芽管伸长、附着胞形成以及致病力等几乎没有 影响，但是却明显抑制孢子萌发时寄主特异性 毒素AK毒素的产生，同时对感病的二十世纪日 本梨致病性也降低。进一步研究表明，这两种 化学物质也可抑制A.altetanta苹果变种AM毒 素及草莓变种AF毒素的产生，并使两菌致病力 降低。此外，KH2PO4、NH4Cl、酵母浸膏及半胱 氨酸等对A.alternata梨变种孢子萌发也几乎 没有影响，而能抑制孢子萌发时AK毒素的产生 及其致病力。但是这几种化学物质不象变兰菌 素、蛋氨酸那么明显，需要在较高浓度下才有 抑制作用。研究认为变兰菌素对AK、AM及AF毒 素的抑制作用是干扰了毒素合成过程中脂肪酸 及其相关中间产物的合成。在发酵技术中在培 养基中加入高浓度磷酸盐和氮源通常可抑制次生代谢物的合成，其原理是由于磷酸可抑制能量代 谢。KH2PO4 对毒素合成的抑制作用可用相似的机制 解释，酵母浸膏的抑制作用说明大量营养物可能对 毒素产生不利。含硫氨基酸如半胱氨酸、蛋氨酸对 毒素合成的抑制作用，原理可能不同于磷酸盐及氮 源，因为它们可在相对较低浓度下产生抑制。 除此之外，某些植物提取物以及化学农药也可 影响毒素的产生。Poutean- Thouvent(1968)发现， 某种菌科植物(Helichrysum arenarium)花汁中的萜 酸(terpene)可抑制尖镰孢(Fusarium oxysporum)毒 素番茄菌肽(lycomarasmin)的生物合成。 Reddy(1987)报导20种植物提取物均有抑制黄曲霉 毒素产生的作用。Mccormick (1988)报道，幼嫩棉籽皮中含有一种明显抑制黄曲霉毒素形成的化 合物，它可能是一种阴离子蛋白。Draughon等 (1985)证明，把代森锰、西维因、三溴磷等农 药加入玉米培养基中，再接种小麦赤霉菌 (Gibberella zeae)可抑制有毒代谢产物赤霉 烯酮(zearalenone)的产生，田间施用代森锰、 西维因后也可明显减少赤霉烯酮的产生。杀菌 剂百菌清、氯硝胺和代森锰锌可抑制 Myrothecium roridum 有毒代谢产物roridin E 的产生，其中百菌清作用最显著。 某些微生物代谢物也可抑制毒素产生。西 村(1975)发现，丧失梨黑斑病致病性菌株，其 培养滤液可显著抑制致病性菌株寄主特异性毒 素产生，但滤液不影响孢子萌发。将致病菌株 孢子悬浮在该滤液中然后接种梨叶片，孢子虽正常发芽但不能侵入寄主细胞，叶片不出现病 症。 3毒素间的保护作用 利用寄主特异性毒素间的相互作用可以减 弱某种毒素的致病作用，为阐明毒素的作用机 理及化学防治提供线索。草莓黑斑病菌 (Alternaria alternata)产生的寄主特异性毒 素AF毒素其化学结构由AF-I、AF-、AF-构 成。Fumio等(1986)研究指出，若在AF-I毒素 处理前18小时用AF-(2.610-5 mol/L)处理 草莓叶片，则叶组织因AF-I引起的K+外漏显著 减少。将离体草莓叶片先用AF-处理，18小 时后再用AF-I处理，再经24小时测量坏死叶脉 面积。结果表明，AF-可有效地保护感病性草莓叶片不受AF-I的侵蚀作用。AF-与AF-I 为10：1时有80%的防治效果。进一步实验，先 用AF-喷施感病性草莓离体叶片，一定时间 后接种A. alternata孢子悬浮液(每亳升5105 孢子)，结果表明，因 A. alternata引起的黑 斑数明显减少。 樊 慕 贞 等 (1990) 就 白 菜 黑 斑 病 菌 (Alternaria brassicae)产生的AG毒素(来自 青邦白菜菌株)、AW毒素(来自白邦白菜菌株)。 与 AK 毒 素 ( 来 自 桃 黑 斑 菌 Alternaria kikuchiana)之间相互作用进行了研究。结果 发现，AK毒素对AG和AW毒素的植物毒性有抑制 作用，可降低对种子根抑制率，并使症状减轻。近年来，植物致病毒素化学结构及其生理 作用的研究使从化学生态学角度开发新型杀菌 剂不断进步。但这一领域的研究国内外均处于 实验室阶段。其难点之一是，若某种化合物仅 能中和毒素但不能抑制毒素的产生，那么只要 病原菌还存活它将继续分泌毒素危害作物，因 此这类物质药效持续期较短。此外，一种病原 菌往往可分泌数种化学结构相似或完全不同的 毒素，而实验室通常仅以一种毒素作为筛选对 象。这也是实际效果不稳定的原因。不过， “从基础到应用”是科学发展的规律。作为新 领域的研究具有十分重要的意义。二、植物抗毒素植物抗毒素（phytoalexin）又叫植保素， 是植物体被病原菌侵染后新产生的抗菌物质， 用以对抗病原菌的侵染，而在健康组织里基本 上测不到。 （一）植物抗毒素的概念及研究历史 早在1911年，法国植物学家Noel Bernard 证明植物受真菌侵染后会产生一些抗真菌物质。 他发现当果树芽受丝核菌（Rhizoctonia repens）侵染后，对后继感染的其它真菌有拮 抗作用，但遗憾的是限于当时的科研条件和科 技水平未能分离、鉴定出抗菌物质。1940年，Mlle和B?rger发现类似的现象，他们发现马铃 薯 （ Solanum tuberosum ） 芽 管 受 晚 疫 病 菌 （Phytophthora infestans）侵染后，会产生了一 种被称作“植物抗毒素”的物质，并将该类物质定 义为“由寄生物侵入活细胞所产生的化学物质”。 之后的大量研究表明，植物抗毒素不但可以通过真 菌诱导产生，而且许多物理（如紫外线等）和化学 （如CuCl2 等）因素也可诱导植物抗毒素的产生。 当前普遍接受的观点认为：植物抗毒素是植物受到 生物、化学或物理胁迫后所产生的抗微生物的植物 次生代谢物质，是植物重要的抗病物质基础之一。 其内涵主要包括三方面：1）植物抗毒素是植物通 过外来物诱导产生的；2）植物抗毒素是植物的次 生代谢产物；3）植物抗毒素具有抗病，尤其是抗 真菌病害的作用。植物抗毒素的种类很多，但习惯上将分子 量小于1000的次生代谢物质称为植物抗毒素。 因此，一些具有抗菌作用的多肽或蛋白质，虽 然它们也是诱导所产生，但一般不把它们视为 植物抗毒素。事实上，判断一种化合物到底是 否为植物抗毒素并不容易，其困难主要在于： 1）有些物质是植物的固有成分，在正常条件 下，它们在植株体内的含量很低，但当植株受 到外来因子的刺激后，这些物质的含量会大幅 度增加。因此，严格地讲，这种物质不属于植 物抗毒素，因为它们并不是植物受到刺激后所 产生的新物质。但由于其含量甚微，在一般条 件下检测不到。因此，有人建议将该类物质也 算作植物抗毒素，并据此建议将植物抗毒素定义为“植物抗毒素是高等植物的代谢产物，它 们在健康的植物组织中没有或很少，但当植物 受到真菌或细菌的侵染后才会大量产生的植物 次生物质”；2）有些抗菌物质在一种植物上 为组成（constitutive）物质，但在另一种植 物上则是诱导产生的。例如，二氢黄酮樱花亭 （sakuranetin）是植物黑醋栗固有的抗菌物 质，但在水稻叶片上却是由真菌侵染所诱导产 生的，是典型的植物抗毒素。因此，很难确切 地说一种物质是植物抗毒素，还是植物的固有 成分；3）即使是同一抗菌物质，在同一植株 的不同器官上所表现出的化学性质也可能不同。 例如，momilactone A在水稻谷壳和茎杆上为 组成成分，但在叶片上则是由微生物侵染诱导 产生的。自Mlle和B?rger提出植物抗毒素假说以来， 科学家已对40多科150多属植物进行了研究，涉及 裸子植物和被子植物（包括单子叶植物和双子叶植 物）。仅从500多种豆科植物中就分离到上百种植 物抗毒素。部分植物抗毒素在植物抗病性方面的作 用也得到了证实。随着分子生物学技术的发展，人 们已从分子水平上阐述了植物抗毒素在植物抗病过 程中的作用。其中最有说服力的证据是：Hain等 （1993）利用转基因技术将二苯乙烯合成酶的基因 从葡萄树转移至烟草中，所获得的转基因烟草对灰 霉菌（Botrytis cinerea）的抗性明显提高，在灰 霉病菌侵染点处不仅合成了烟草原来就可以合成的 倍半萜类植物抗毒素，而且合成了烟草原来不能合 成的藜芦醇（resveratrol），含量高达每克鲜重 40 g，从而提供了植物抗毒素是重要的植物抗病 机制之一的直接证据。（二）豆科植物的抗毒素1960年Cruickshank和Perrin把褐腐病菌 （M.fructicola）的分生孢子液，滴加到豌豆 （ Pisum sativum ） 豆 荚 的 内 表 皮 上 ， 于 是 Cruickshank等从这些液滴中分离并鉴定了第 一个植物抗毒素豌豆素（pisatin），它是一 种紫檀烷（pterocarpan）的衍生物。 现在知道多种真菌都能诱发豌豆产生豌豆 素，豌豆素对多种真菌也都有抑制效应，其有 效浓度大约在104105 mol/L之间。豌豆素 能抑制豌豆白粉病病菌（ Erysiphe pisi ）对 豌豆的侵染。无豌豆素存在时，侵染率达 27.4%，若接种病菌孢子液中含有1?10-5的豌豆 素，侵染率下降到9.6%，若含1?10-4 的豌豆素，侵染率仅为1.1%。豌豆素对细菌也有一定的抑 制作用。Cruickshank曾实验了24种细菌，对 其中的11个种有抑制作用。 随后，在豆科植物中又分离出多种抗毒素， 大多数是紫檀烷类化合物。如从菜豆中分离的 菜 豆 素 （ phaseollin ） 、 大 豆 中 的 大 豆 素 （ glyceollin ） 和 苜 蓿 中 的 苜 蓿 素 （medicarpin）等，也有不少其他结构类型的 抗毒素。HOOOO OH OOOOO豌豆素菜豆素豆科植物中蝶形花亚科（Papilionoideae）有着重 要的经济意义，有关豆科植物抗毒素的研究主要集中在 这个亚科的植物里。1960年以来，已有500余种蝶形花 植物被研究过，从中已分离和鉴定了100余种结构不同 的植物抗毒素，主要是异类黄酮类（isoflavonoid）化 合物，也有少量非异类黄酮类化合物。异类黄酮如从洋 刀豆(Canavalia sp.)提取的木豆素（cajanol）等。非异类黄酮结构的抗毒素，如从豇豆分离 的 豇 豆 素 （ viganfuran ） 和 从 花 生 （ Arachis hypogaea ）分离的三羟二苯 乙烯（resveratrol）等。OHO OOOHOH O OHO OOH三羟基异黄酮木豆素HOOHO OHOOOH豇豆素三羟二苯乙烯（三）茄科植物的抗毒素Mller所预言的马铃薯的植物抗毒素，在 他 提 出 抗 毒 素 学 说 近 30 年 后 ， 1968 年 才 被 Tomiyana等分离出来，并由Katsui鉴定了结构， 它是一种去甲倍半萜类化合物，称为日齐素 （rishtin）。在接种马铃薯晚疫病病菌78 h，可以测到其存在，24 h后，在侵染点附近 鲜重含量达到了100 ?g/g。这个浓度对马铃薯 晚疫病病菌生长的抑制作用是很明显的，在体 外能使孢子的芽管停止生长。除了日齐素外，还陆续从接种马铃 薯晚疫病的块茎中，分离出留宾素 (lubimin)、茄歪惕酮（solavetivone）和 日齐醇（rishitinol）等十多个结构相似的 萜类化合物。其中日齐素、留宾素和茄 歪惕酮等3种成分成了萜类抗毒素成分的 85以上。HO HOHO CHOO日齐素留宾素茄歪惕酮马铃薯晚疫病病菌的细胞壁含有抗 毒素的激发子，通常认为是一种多糖成 分。1981年Bostock从这个菌中提取出两 种不饱和脂肪酸二十碳四烯酸和 cicosaoentaenoil acid，能诱导产生大 量抗毒素。脂肪酸和多糖的结合提高了 激发活性，并具有了特异性。（四）其他科植物抗毒素除豆科和茄科外，还有10多个科的植物抗毒 素被研究过。旋花科的甘薯（Ipomoea batatas） 黑斑病是由感染黑斑病病菌（Ceratocystis fimbriata）引起的。染病的甘薯变黑味苦，并 失去了食用价值。从染病的甘薯中分离并鉴定出 甘薯酮（ipomeamarone），甘薯酮对病原菌是非 特异性的，并且对动物也有很高的毒性。锦葵科的棉花（ Gossypium barbadense ） 受病原菌侵染时，能产生多个和棉酚有关的抗 毒 素 ， 如 棉 素 （ gossyvertin ） 和 半 棉 酚 （hemigossypol）等。蔷薇科苹果的抗毒素是 苯 甲 酸 。 菊 科 植 物 红 花 （ Carthamus tinctoria）中的红花醇（safynol）则是一种 炔类化合物。禾本科的水稻叶片被稻棘壳孢 （Pyricularia oryzae）侵染时，产生了两个 二萜内酯化合物momilactone A和B。燕麦在受 到病菌（ Puccinia coronata ）侵染时产生了 燕麦宁（avenalunin），它是一个含氮化合物。O O OCHO HOOH O薯酮甘CH3CH CH(C C)3CHmonilactone ACHCHCH2OH OH红花醇HO NO O OOOH棉索燕麦宁（五）植物抗毒素的合成1植物抗毒素的生物合成 植物抗毒素的合成实际上是在外源因子的 作用下，植物体内产生的一系列抵御病原菌侵 入的过程，包括：信号激活 ? 信号因子转移、 扩散 ? 防御基因的转录活化 ? 相关物质的 表达 ? 形成化学屏障。能够诱导植物产生植 物抗毒素的因子很多，根据来源可分为生物诱 导子（biotic elicitor）和非生物诱导子 （abiotic elicitor）。生物诱导子包括各种 病原菌（真菌、细菌、病毒及其代谢物）和植 物细胞壁的分离物，非生物诱导子包括物理和 化学因子，如重金属盐类、去污剂、乙烯、氯仿、水杨酸、杀真菌剂、紫外线、冻融等。按 化学组成诱导子可以分为多糖类、糖蛋白类、 多肽类和脂类(不饱和脂肪酸类)。按植物的防 卫反应，可以将诱导子分为内源诱导子 (endogenous elicitor) 和 外 源 诱 导 子 (exogenous elicitor)。前者是指植物细胞壁 的果胶多糖类，后者包括各种病原菌的表面结 构成份及分泌的代谢物。根据专化性，诱导子 可分为特异性诱导子和非特异性诱导子。特异 性诱导子的作用依赖于植物品种的基因型及其 潜在的抗性，而非特异性诱导子的作用不依赖 于植物品种的基因型及其潜在的抗性。植物抗毒素是参与植物防御反应的重要生 理活性物质，不同结构类型的植物抗毒素具有 不同的合成途径和抗病机制。以豆科植物产生 的异黄酮类植物抗毒素为例，该类物质能够直 接阻止病原物的生长、发育和侵染，其作用机 制是干扰真菌的甾体营养或影响真菌细胞膜的 透性。大量的研究证实，异黄酮类植物抗毒素 的合成与苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）有关。PAL是该类植 物抗毒素生物合成的关键酶，它催化苯丙氨酸 直接脱氨基转化为反式肉桂酸。例如，菜豆素 的生物合成与PAL的活性呈正相关，随着PAL 活性增高，菜豆素的合成增加。相反，用PAL抑制剂L-2-氨氧基-3-苯丙酸和 -氨氧基乙酸处理植物幼苗，植物体内的植 物抗毒素的合成和累积则受到抑制。现已证明 PAL的活性受产物的反馈调节，其表达受苯丙 烷类代谢途径产物的调节，如果将外源反式肉 桂酸加到经病原菌诱导物处理过的菜豆悬浮细 胞系中，则会导致PAL迅速失活，编码PAL及其 它植物抗毒素合成酶的mRNAs合成受到抑制， 从而影响了基因的转录和翻译。因此，认为肉 桂酸可能是植物体内苯丙烷类代谢途径酶类合 成的调节剂。有关黄酮类天然产物（包括植物 抗 毒 素 ） 的 生 物 合 成 途 径 详 见 Dixon 和 Steele(1999)的评述。另一类比较重要的植物抗毒素是倍半萜类 物质，其生物合成与植物的异戊二烯途径有关。 近年来的研究证实，该类植物抗毒素的生物合 成受3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase ， HMGR）基因表达的调控。HMGR的活性变化与倍 半萜产物的合成密切相关。进一步的研究表明， HMGR是由一类HMGR基因家族编码的，在这些基 因家族中，不同同源基因的表达可能控制着细 胞质中甲羟戊酸代谢中的“碳流”流向，从而 在转录水平上决定了终产物萜类物质的变化， 进而调控细胞质中萜类物质的含量。有关植物抗毒素形成的假说很多，从分子 水平来看不外乎有如下机制：1）植物抗毒素 的形成是由于酶合成的去阻遏。低浓度的诱导 物可使植物抗毒素合成中的控制合成调节酶的 DNA片段去阻遏；2）寄主植物特异性代谢物 和病原物质膜上的特异性受体相互作用，使寄 生物产生激发子后，激发子又和寄主细胞相互 作用，刺激植物抗毒素的形成，其中寄主植物 抗性基因与病原物无毒基因分别控制寄主代谢 物和病原物质膜受体的合成；3）植物抗毒素 的合成和控制取决于早期识别阶段，病原物产 生的特异性激发子和寄主膜上特异性受体之间 的相互作用。特异性激发子是病原物的显性无无毒基因编码的，而特异性受体是寄主植物显 性抗性基因编码的；4）“双重诱导作用”假 说认为植物代谢物在侵染时调节激发子形成的 质和量，激发子在原位通过重新合成酶，或通 过活化已存在的酶而调节植物抗毒素的合成； 5）植物抗毒素的形成受特异性阻遏子的调节， 植物抗毒素的特异性是受激发子和阻遏子之间 的平衡所决定的。 简而言之，在病原菌或一些非生物诱导因 子与植物相应受体结合的作用下，通过信号传 导受体系统，激活了植物的防御体系，使其产 生了一系列的生理生化反应，合成对致病菌有 抑制作用的小分子化合物植物抗毒素，进 而阻止致病菌的侵入、繁殖、扩展，实现防病 的目的。2植物抗毒素的诱导合成 生物诱导子主要是一些植物病原真菌和植 物害虫，其中病原真菌诱导子研究较多。接种 和侵染目标植物遣婢盏贾参锟苟舅厣?成的主要方式。病原真菌接种和侵染目标植物 的部位因研究目的不同而有所差异，可以是植 物的叶片、果实、根系以及茎杆，其中叶片和 果实是较常见的接种部位。研究植物果实植物 抗毒素一般有未成熟的果实，先用70%的乙醇 洗净果实表皮，再用沙纸轻擦果实的表皮，使 其表皮有轻微破损，然后将该果实浸于病原真 菌的孢子悬浮液中，浸泡时间与孢子悬浮液的 浓度有关，浓度高则浸泡时间短，浓度低则浸 泡时间可稍加延长。接种了病原真菌的果实应再培养一段时间，培养时间和温度因植物而异。 经过接种和培养的果实便可用于植物抗毒素的 分离、纯化及结构鉴定。叶片的接种和侵染与 果实的接种和侵染相似，具体可参见Pedras等 （2000）介绍的方法。线虫作为植物害虫也可 作植物抗毒素生物诱导子，其诱导方法与病原 真菌诱导方法略有不同，具体操作可参见 Yamada等（1993）方法。 非生物诱导子包括重金属离子（如Cu2+、 Fe2+、Hg2+、Co2+等）、紫外线以及有机分子 （如N乙酰壳聚糖、茉莉酸等）。与生物诱 导子相比，非生物诱导子研究较少。重金属离 子作为植物抗毒素的诱导子，一般是将目标植 物的茎杆、叶片或其他组织加到含该重金属离子的盐溶液中，盐的浓度及处理时间因 植物而异。紫外线诱导方法是用能发射 特定波长的紫外灯照射处理植物，波长 范围一般为254345 nm，处理时间一般 为1560 min。茉莉酸诱导方法是将一 定浓度的茉莉酸溶液滴于植物叶片的受 伤部位，经过适当时间的培养后取样进 行分析。N乙酰壳聚糖的诱导方法与茉 莉酸诱导方法相似。（六）植物抗毒素的应用前景随着人类生活质量的提高，人们强烈要求生产 没有农药残留的绿色食品，而实现绿色食品的最好 的方法就是提高寄主植物的抗病性（对病害而言）， 具体措施主要有三条：一是利用传统育种手段直接 培育抗病品种；二是利用基因重组技术培育转基因 抗病植株；三是利用各种物理、化学或生物手段， 诱导植物产生抗病性。比较而言，采用常规育种或 转基因技术育种难度较大，成功比例较低，而采用 诱导技术相对容易，成功率较高，且一旦方法建立， 可用于多种相关作物。因此，在目前强调可持续发 展农业阶段，关注环境保护的二十一世纪，开发和 研制能够诱导植物产生抗菌物质的诱导剂作为无公 害农药是一个重要的发展方向。实验证明很多植物抗毒素具有抑菌作用， 因此有关植物抗毒素结构和活性等的深入研究， 会给新型杀菌剂的研制提供新的线索。有时一 种植物产生的抗毒素，能更有效地抑制病原菌 对另一种植物的侵染，这样抗毒素也可直接用 于杀菌剂，以对不同植物提供交叉保护。 Ward等人发现，马铃薯晚疫病病菌在体外 对辣椒素特别敏感。他们进一步实验用从辣椒 提取来的辣椒素防治马铃薯晚疫病病菌对番茄 的侵染。在有34个展开叶片的番茄苗上喷洒 病菌孢子液，1.5 h后再喷洒不同浓度的辣椒 素，72 h病斑清晰可见而又未互相愈合，统计 3个叶片上的病斑总数。对照病斑数为135个， 辣椒素浓度为5?10-4 mol/L为16.6个，2.5?10-3 mol/L仅为1个，抑制效果是很明显的。近年由于植物基因工程技术的兴起，又为 植物抗毒素的研究开辟了新的天地。许多不同 科植物受到病原菌侵染时，都能产生二苯乙烯 型的植物抗毒素，如花生、葡萄和松等。植物 中一般也都有二苯乙烯的前体化合物，只是缺 少特殊的二苯乙烯合成酶。Hain和Reif(1993) 从葡萄分离出二苯乙烯合成酶基因，它的表达 能力很强，把它导入并整合到烟草的染色体上， 获得了烟草转基因抗性植株。在温室中，对转 基因植株和对照植株上接种灰葡萄孢 （B.cinerea），7天后测量各自的发病率，和 对照相比，转基因植株下降了50以上，最多 的降低了81.6%。但转入的基因若是花生和葡 萄嵌合的二苯乙烯合成酶基因，抑菌的效果就 很小。生化测定表明，在病原菌侵染转基因抗性植株48 h时，三羟二苯乙烯含量达到了鲜重400 ?g/g，这个 浓度在体外对真菌的生长即有抑制作用 。Hain和 Reif的研究结果无疑给植物抗毒素的研究注入了新 的活力，展现了新的前景。 大量的研究证实，植物抗毒素的确在控制植物病 害中具有重要的作用，但在实际应用中还应审慎处 理，因为植物抗毒素与其它化合物一样，也有一些 不尽人意的特性，主要表现在：1）毒性问题：现代 研究表明，许多植物抗毒素是有毒的，且其毒性是 非专化性的，它们既对病菌有毒，也对人类有害， 这样植物抗毒素能否作为新型杀菌剂就受到人们的 普遍质疑；2）杀菌活性较低：与商用合成杀菌剂相 比，植物抗毒素的杀菌活性很低，使用浓度往往大 于100 ?g/ml。也正是由于这一问题，植物抗毒素的 研究虽然已有40多年历史，但目前尚未见真正商品 化的产品。第四章 植物与病原 菌之间的 生理生态关系第一节 致病毒素和植物抗毒 素第二节 病原菌侵染植物的过 程及对寄主植物的影响第二节 病原菌侵染植物的过程及 对寄主植物的影响一、侵染过程 ? 二、植物抗病性的类型 ? 三、病害对植物的生理生态影响 ? 四、植物抗病机理?第二节 病原菌侵染植物的过程及对 寄主植物的影响病原菌孢子通过各种途径到达植物体后， 在合适的条件下就开始了侵染植物的过程。 如能侵染成功，就能在植物体上定居下来并 生长繁殖。在这个过程中，病原菌能产生某 些毒素，而使植物表现出一定的病症。一、侵染过