挑战杯报名表－食品学院－刘志明

第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛华南农业大学校内选拔赛报名表申报者情况姓 名刘志明性别男出生年月1984年4月所在学院食品学院现学历本科专 业生物工程年级2003级学制4年入学时间2003年9月作品全称灵芝gpd启动子功能活性分析作品类别自然科学类论文作品所属领域J住 址华山宿舍区24栋502房宿舍电话87344372手机号子信箱D合作者情况姓 名性别年龄最高学历所在单位李昭萍女22本科食品学院作品的目的和基本思路目前，食用菌外源基因表达系统尚不完善，缺乏有效的启动子是导致食用菌转化效率低，外源基因表达水平不高的主要原因之一。因此，从不同种类的食用菌中分离强启动子并对其功能活性进行检测，以期获得功能活性强的启动子，将为完善食用菌外源基因表达系统提供必要的顺式元件。因此，本作品将从灵芝中（Ganoderma lucidum）克隆得到的假定gpd启动子（3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子）与报告基因gfp基因（绿色荧光蛋白基因）串连，构建成表达载体。运用PEG介导的原生质体转化法与辅助质粒pCc1001共转化色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞菌粉孢子的原生质体。通过筛选得到色氨酸营养恢复型（trp+）的假定转化子。然后利用PCR技术，Southern杂交技术验证假定转化子；对Southern杂交阳性的转化子进行绿色荧光观察，观察到确有绿色荧光产生，说明我们克隆到的假定灵芝gpd启动子成功高效的启动了绿色荧光蛋白基因在灰盖鬼伞中的表达，为真启动子。该启动子是国内外唯一从灵芝中克隆到的gpd启动子序列，我们具有完全知识产权，可作为我们建立高效的食用菌外源基因表达系统提供必要的基因表达元件。作品的科学性、先进性及独特之处（设计、发明写出其技术关键和主要技术指标）科学性：在理论上：现代分子生物学研究表明，真核生物基因由增强子，位于基因上游的启动子、结构基因（由许多非编码序列，内含子间隔开）、终止子组成。这些元件控制了基因的表达和调控。其中，启动子是指RNA聚合酶识别，与之结合并开始转录的一段DNA序列，通常位于基因的上游。当RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动转录过程，因此启动子是基因表达调控的重要顺式元件，它与RNA聚合酶以及其他蛋白辅助因子等反式元件的相互作用是启动子调控模式的实质。同时，启动子作用的发挥需要有能识别启动子的相应因子。同源启动子有利于受体细胞调控因子的识别，减少甲基化，促进外源基因整合到染色体上，从而提高转化效率和外源基因的表达效率。 食用菌是真核生物，其基因的结构与表达调控模式符合以上理论基础。本作品利用灵芝的gpd启动子作为外源基因表达的启动子和gfp基因作为启动子活性检测的报告基因有以下的科学性。首先，灵芝与灰盖鬼伞同为大型真菌，在分类学上有一定的亲缘性，因此其启动子识别因子相同或相似，灵芝gpd启动子转化进灰盖鬼伞后，能被识别，发挥启动子的活性，符合理论基础。同时，gpd启动子是食用菌遗传转化中研究和应用最多的启动子之一，gpd基因是糖酵解途径的关键酶基因，其基因在细胞内具有很高的表达水平，从而推断gpd 启动子可能是一个非常高效的启动子。研究进一步证实，其确实具有很强的调控异源基因表达的作用。其次，绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，由于其具有荧光性质稳定、直观、操作方便和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测且检测灵敏度高等无可比拟的优点。以gfp基因作为启动子活性检测的报告基因，只要检测荧光的存在，就可以证明启动子的启动活性，真实、方便、可靠。此外，基因工程技术的长足发展，特别是保证DNA体外正确切割和连接技术、外源DNA转化细胞技术、目的DNA转运所需的载体、凝胶电泳技术、PCR技术、DNA序列测定技术的突破，为本研究提供了可靠的技术支持和现实条件。先进性及独特之处：目前，由于基础研究较少，背景知识匮乏，导致食用菌生物技术研究相对很少。虽然食用菌生产已成为我国农业中种植业、养殖业、菌物业三大产业之一，但是基础研究却相对滞后。目前的食用菌研究大多只是集中在常规的菌种选育，引种驯化，引进开发，技术推广上。基因工程作为生物技术的核心，其研究已深入到各个生物产业，本研究立足于食用菌基础研究，研究结果将有益于我国食用菌生物技术的发展。食用菌基因工程的研究滞后的主要原因是缺乏有效的启动子和稳定的遗传转化体系，从而导致了食用菌转化效率低，外源基因表达水平低等难题。目前基因工程技术在食用菌中的应用主要集中在生物反应器研究，即通过转入特定基因，表达有价值的外源蛋白，使其具有各种抗性能力或提高生理代谢能力。这些方面的应用都涉及外源基因的表达问题。要使外源基因在食用菌内得到高水平的表达，高效的启动子是必不可少的。本作品的目的就是通过构建灵芝gpd启动子串连gfp基因的表达载体转化灰盖鬼伞，通过Southern杂交检测和绿色荧光观察，检验灵芝gpd启动子的活性，最终证明我们所克隆到的灵芝gpd启动子确实具有很强的启动活性，可以应用于食用菌外源基因表达系统的构建，解决食用菌基因工程中的瓶颈难题。目前，未见有对灵芝gpd启动子在灰盖鬼伞中功能活性的研究报道，因此本研究具有先导意义。作品的实际应用价值和现实意义1. 利用灵芝gpd启动子建立灰盖鬼伞的遗传转化体系。2. 用于研究灵芝gpd启动子的功能活性。3. 用于研究食用菌的遗传特性。4. 为食用菌基因表达调控研究提供功能性分子工具元件。文章摘要（技术、发明写出作品的技术特点和优势，提供该作品的适用范围及推广前景的技术性说明）本实验将从灵芝中克隆得到的gpd启动子片断与gfp基因在体外进行基因重组，得到pGg-gfp启动子功能型检测载体。以色氨酸营养缺陷型为筛选标记，通过PEG介导将启动子功能活性检测质粒pGg-gfp与辅助质粒pCc1001共转化色氨酸营养缺陷型灰盖鬼伞菌株LT2粉孢子原生质体。共转化之后，经过选择培养基筛选，获得一批色氨酸营养恢复型（trp+）的假定转化子。 从所得到的转化子中小量提取基因组DNA，利用克隆灵芝gpd启动子基因的上游引物和gfp基因的下游引物进行PCR检测，扩增出900bp的检测条带。检测结果显示有12个阳性转化子。将12个阳性转化子进行液体扩大培养，收集菌丝。利用FDEB法大量提取基因组DNA。对gfp基因361-998之间序列PCR产物进行标记制作探针，进行Southern杂交，结果表明有8个转化子有杂交信号，其中一个有双拷贝信号。利用荧光显微镜对有杂交信号转化子进行荧光检测，结果表明：有7个转化子有绿色荧光信号。综合分析表明，灵芝gpd启动子在灰盖鬼伞中有转录活性。作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励（技术、发明写出专利情况）2007年11月广州市微生物学年会所做“银耳外源基因表达系统的建立”报告中有提及本结果，但该结果目前尚未在学术期刊上发表。推荐教师意见gpd启动子是食用菌外源基因表达的重要顺式元件。刘志明同学2004年5月参与本课题组的国家自然科学基金“食用菌外源基因表达系统的建立”课题的研究工作。该生思维敏捷，做事认真，责任心强，有较强的科研创新意识。本参赛作品“灵芝股gpd启动子功能活性分析”中是刘志明、李昭萍共同研究的结果，结果数据可靠、真实，有很好的应用