细菌分离纯化及鉴定protocol.doc

细菌分离纯化培养及鉴定protocol样品菌株分离：准备工作1 用报纸将平板包好（约12个一包）灭菌后放入烘箱烘干，最好隔夜；2 按照培养基的配方配制好液体培养基后，调pH值（注意灭菌后培养基pH会略有升高），其中一定体积液体培养基中加入1.5%的琼脂后，倒入锥形瓶并用滤膜封好待灭菌。注意培养基的体积总量不能超过锥形瓶的三分之二，约一半左右；剩余液体培养基加入试管中，每支5ml（其中3ml用于保种，2ml用于提取菌株基因组DNA），用胶塞封好，与加入琼脂的锥形瓶一起灭菌；3 将无菌超净台打开紫外灯灭菌约20分钟，将灭好菌的培养基放置冷却到不烫手后，在超净台中操作倒入到已烘干的培养皿中，每块板中倒入约20ml，厚度约为培养皿的1/31/2之间。倒好后的培养皿叠放在超净台内，待培养皿中培养基冷却凝固之后即可使用。暂时不用的，可先用封口膜封好并标记好培养基名称存放好。4 在培养皿上写清样品名称，标注日期，姓名。用枪加入100uL液体样品到培养皿上，尽量把培养皿托平，将涂布玻棒插入酒精中取出在酒精灯外焰灼烧完全，待冷却后，在酒精灯下将液体涂布均匀（最好涂布至培养基将液体全部吸收）。5 将涂好的培养皿正置培养2小时后，用封口膜封好，倒置培养。定时观察平板，描述菌落的颜色、形状，记录菌落数并拍摄照片。划线分离纯化：1 待涂布好的培养皿上长出单菌落后，用挑取同一培养皿中不同颜色、不同形状的菌落进行划线分离纯化，挑取的菌落用记号笔标出。2 将接种针在酒精灯外焰灼烧完全，稍冷却后，在平板上进行Z字形三个方向划线。3 若在新板上又长出新菌落，再次分离划线4 划线需做至少23次，直至菌落完全纯化（纯化步骤很关键）保种：1将已纯化的细菌用灭菌的牙签蘸取接种入试管内（注意要取单菌落），摇床150r/min， 28培养，直到其生长至指数期2 在2ml冻存管（预先灭菌并烘干）中加入1ml 30%甘油（甘油预先配置好灭菌后待用），再加入1ml上述1中的菌液，盖紧管盖，混匀后在管壁做好样品标记和日期，同时在实验记录本上做好记录3 以上每个样做三管，做好记录，放入冷存盒，放入80度冰箱内，记录存放位置。4 将同一试管内剩余的2ml细菌培养液加入到灭过菌的2ml试管中待提取DNA。DNA的提取：可采用细菌基因组DNA抽提试剂盒或手提的方法进行手提法步骤如下：1、取2mL,8000r/min离心10分钟,弃去上清。2、加入2 ml无菌水离心洗涤两次，用2ml无菌水悬浮菌体,混匀,-20保存备用。 3、取0.7ml菌悬液，加入37l 10%SDS，混匀，加入7.4l 10mg/ml蛋白酶K，混匀，37温育1小时4、加入148l 5mol/L NaCl，再加入102l CTAB/NaCl（质量浓度50 g/ L CTAB ,0.5 mol/ L NaCl）,混匀，65温育10分钟。5、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。6、上清中加入等体积的酚氯仿异戊醇(25241),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。7、加入0.6倍的异丙醇,混匀,-20静置20分钟以上，10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。8、用50 l 无菌水溶解DNA,4保存。比较了几种方法，该方法对我们实验室的纯菌DNA的提取较好，能提到较高浓度的DNA。16S PCR反应及其测序：将已提取的细菌基因组DNA作为模板，1492r，27f作为引物，用TAKARA高保真taq酶做16s PCR反应，其PCR产物纯化（纯化试剂盒）后，即可送去测序；也可以将产物直接拿给测序公司由他们帮忙纯化并测序，其费用会略