第9章蛋白质组学.ppt

第九章蛋白质组学 第一节概述第二节蛋白质组学研究的内容第三节蛋白质组学研究的技术方法第四节蛋白质组研究的应用与发展趋势 曹运长博士 副教授南华大学生化与分子生物学教研室email caoychang tel蛋白质组学的含义 蛋白质组 proteome 指的是由一个基因组或一个细胞 或一种生物表达的所有protein 蛋白质组学 proteomics 旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式 内容包括 蛋白质的表达 定性鉴定 定量检测 存在方式 细胞内定位 相互作用研究等 最终揭示蛋白质功能 是基因组dna序列与基因功能之间的桥梁 第一节概述 一 蛋白质组学 proteomics 的发展简史 基因组研究已经取得了举世瞩目的成就 已完成了大肠杆菌 酿酒酵母 果蝇 线虫 河豚 水稻 小鼠等十多种生物基因组dna的全序列分析 人类基因组计划在2002年完成 但是新问题也随之产生 大量的这些新基因编码的蛋白质有什么生物学功能 在细胞合成蛋白质之后 这些蛋白质还要经历翻译后的加工修饰 即一个基因对应的可能是几种甚至是数十种 包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的 或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作 如何相互作用 相互协调的 这些问题远不是基因组研究所能回答得了的 正是在此背景下 蛋白质组学应运而生 蛋白质组概念的提出 蛋白质组 proteome 一词最早由澳大利亚学者wilkins和williams于1994年提出 源于蛋白质 protein 与基因组 genome 两个词的杂合 意指proteinsexpressedbyagenome 即 一个基因组 一个细胞或一种生物表达的所有protein 蛋白质组学 proteomics 是研究与基因相对应的蛋白质组的学科 一个基因主要通过mrna选择性剪接 rna编辑 蛋白翻译后加工等方式 可编码多个蛋白 因此人类基因组包括3 4万个基因 但蛋白质组估计在10万个左右 dna 基因组 基因组学 mrna rna组 rna组学 蛋白质 蛋白质组 蛋白质组学 细胞功能 基因组学和蛋白质组学的生物化学关系 从mrna水平不一定能预测细胞中相应蛋白质的水平 因为 各种mrna不同的稳定性和不同的翻译效率能够影响新蛋白质的产生 存在mrna选择性剪接 rna编辑 翻译后加工和修饰等方式 对应于基因组的所有蛋白质构成的整体 不是局限于一个或几个蛋白质 同一基因组在不同组织 不同细胞中的表达情况各不相同 在空间和时间上动态变化着的整体 蛋白质组的特点 蛋白质组学 proteomics 的概念 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学 其目的是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份 表达水平与修饰状态 了解蛋白质之间的相互作用与联系 揭示蛋白质功能与细胞生命活动的规律 80年代固相化ph梯度的发明 改善了双向凝胶电泳的重复性和上样量 80年代后期发明的电喷雾电离质谱和基质辅助激光解吸电离 飞行时间质谱 成功应用于蛋白质分析 蛋白质双向凝胶电泳图谱的数字化和分析软件的发明 建立了各种蛋白质数据库 当今蛋白质组研究的蓬勃发展 归功于三大主要技术突破 第二节蛋白质组学研究的内容 一 蛋白质组学研究的内容 表达蛋白质组学研究某种细胞或组织中蛋白质组的组成成分 即实现所有蛋白质的分离 鉴定及其图谱化 支柱技术 双向凝胶电泳 质谱技术 生物信息学 结构蛋白质组学测定蛋白质的三维 阐明结构与功能的相互关系 蛋白质结构分析技术有 x射线晶体衍射法 核磁共振法 功能蛋白质组学揭示蛋白质之间的相互作用 建立细胞内信号转导通路的相互作用网络图 研究技术有 酵母双杂交 免疫共沉淀 表面展示技术 spr等 与基因组研究比较 蛋白质组研究更为复杂和困难 蛋白质组的多样性 不同细胞 同一细胞不同状态时 蛋白质种类不确定 蛋白质数目大大超过基因数目 蛋白质组的动态性 随时间和空间而变化 蛋白质组学研究技术的缺陷 如低丰度蛋白 极酸极碱蛋白 极大分子量蛋白 难溶蛋白 如膜蛋白 等的分离与分析 当前主要任务 发展高通量 高灵敏度 高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务 二 蛋白质组学研究的难点 对机体或细胞的所有蛋白质进行鉴定和功能分析 所用的技术方法包括两个方面 一 蛋白质分离技术二 蛋白质分析和鉴定技术双向凝胶电泳 以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学 图像分析 数据分析 数据库和计算机网络 分析 第三节蛋白质组学研究的技术方法 一 蛋白质分离技术 一 样品的制备方法 要尽量保持其原有的活性和生物学功能 1 一般分离方法2 激光捕获显微切割技术 不同发育时期 不同生理 病理状态下不同细胞类型其蛋白表达不一致 因此蛋白表达分析应该精确到细胞和亚细胞水平 lcm可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群 即是一种原位切割技术 优点 快速简单 高效直观 减少交叉污染 保持分离样品结构完整 缺点 用于显微切割的组织必须脱水干燥 捕获大量组织细胞需要大量时间 组织标本缺乏盖玻片与屈光介质 使得观察模糊 激光捕获显微切割技术 lasercapturemicrodissection lcm 二 二维凝胶电泳技术 two dimensionalelectrophoresis 2 de 为1975年由farrel和klose发明 利用蛋白质的等电点和分子量 结合凝胶化学特性 分离各种蛋白质的方法 原理 第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦 ief 再在第一向垂直方向上进行第二向sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳 sds page 特点 可分离10 100kd分子量的蛋白质高灵敏度和高分辨率便于计算机进行图像分析处理可与质谱分析匹配 2 de技术的缺点 分辨能力还有待提高 极酸 极碱性蛋白质 疏水性蛋白质 极大蛋白质 极小蛋白质 低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离 质谱分析时需要将蛋白质酶解 而胶内酶解过程费时 费力 难于与质谱联用实现自动化 发明的新型非凝胶技术 液相色谱法 liquidchromatography lc 毛细管电泳 capillaryelectrophoresis ce 二 蛋白质分析和鉴定技术 一 图谱分析技术双向凝胶电泳根据等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白质 经染色后蛋白质再page上可形成密度不同 分布不均的复杂点图谱 如何有效的对双向凝胶电泳图像分析 如何对图谱上的蛋白质点进行检测 定量 比较 分析和归类 挖掘有价值的蛋白质点的信息是通过图谱分析软件来实现 目前常用的软件有 melanieii pdquest imagemaster等 满天星 式的2 de图谱分析不能依靠本能的直觉 每一个图象上斑点的上调 下调及出现 消失 都可能在生理和病理状态下产生 必须依靠计算机为基础的数据处理 进行定量分析 在一系列高质量的2 de凝胶产生的前提下 进行以下典型流程 首先 采集图象通常所用的系统是电荷耦合ccd照相机 激光密度仪 phospho或fluoro imagers 对图象进行数字化并成为以象素为基础的空间和网格 其次 在图象灰度水平上过滤和变形 进行图象加工 以进行斑点检测 最后 进行背景消减 斑点配比 数据的呈递和数据库的构建 典型流程 凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递2 de数据库的建立 凝胶的图像处理分析及细胞蛋白谱的建立 pdquest软件简介 pdquest软件是显示 imaging 分析 analyzing 双向电泳图谱与数据库查询的一个软件包 pdquest双向凝胶图像分析软件为bio rad公司开发 pdquest2 d分析软件系统分析流程包括 一图象采集与加工 二斑点检测三斑点匹配四数据分析及输出 pdquest软件 二 生物质谱技术 质谱技术应用于蛋白质分析鉴定的原理 将蛋白质酶解成肽 得到许多肽段 通过质谱测定每一个肽段的分子量 经数据库比对根据其分子量 即可知该肽段的氨基酸序列 大多数含有6个或6个以上氨基酸的肽序列在一个生物的蛋白质组中是唯一的 因此 根据肽段的信息 在数据库中再进行蛋白质序列的匹配 可以鉴定相关的蛋白质 新型蛋白质鉴定技术 质谱 ms 法基本原理 气体分子或固体 液体的蒸气受到一定能量的电子流轰击或强电场作用 丢失价电子生成分子离子 这些带正电荷的离子在电场和磁场的作用下 按质荷比 即质量与电荷比值m z 的大小分开 排列成谱 记录下来即为质谱 质谱分析技术的类型 离子阱质谱 飞行时间质谱 四级杆质谱 傅里叶转换回旋共振质谱 两种常用的质谱仪 1 基质辅助激光解吸电离 飞行时间质谱 matrix assistedlaserdesorption ionizationtimeofflightmassspectrometry maldi tofms 主要用以测定多肽的质量 电喷雾电离质谱 electrosprayionizationmassspectrometry esi ms ms仪器工作原理 一质谱仪的三个基本部分 1 离子源 由样品产生离子 2 质量分析器 根据离子质荷比 m z 分离离子 3 检测器 检测由质量分析器分离的离子 二质谱仪的其他部分1 复杂计算机 处理数据 2 真空泵系统 保证质量分析器处于高真空 分析蛋白质和肽的质谱仪 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 maldi tofms 一 简介组成 第一部分maldi指离子源 tof指质量分析器 二 maldi离子源工作原理待分析样品与化学基质混合 将样品和基质的混合物固定到一个小板或玻片上 离子源装有激光 向混合物发射光束 基质化合物吸收射线光子形成激发电子 多余的能量转移到样品中的肽片段或蛋白质 使他们从靶表面射入气相 这种过程产生正离子和负离子 这取决于样品的性质 tof质量分析器 功能 tof分析器测定离子从分析器的一端飞行到另一端并撞击检测器所用的时间 maldi tofms常用于肽指纹图谱 peptidemassfingerprinting pmf 的鉴定流程 2 d电泳 原位酶切 转印至pvdf 质谱 得到pmf 查询数据库 鉴定蛋白质 简介esi是指在仪器离子源中产生离子的过程 串联质谱是指可以进行多级质量分析的仪器 esi串联ms仪器中使用不同类型的质量分析器 最常用的是四极杆 离子井和tof质量分析器 2 电喷雾电离串联质谱 esi ms 基本原理 用esi分析的样品为水溶液中的肽或蛋白质 肽在溶液中以离子存在是因为肽片段上的某些功能基团在不同ph溶液中发生电离 在酸性ph ph3 5或更低 溶液中 胺的质子化使肽和蛋白质带有总的净正电荷 在碱性ph溶液中 胺和羧基的去质子化产生总的净负电荷 肽离子上的正电荷容易使肽裂解 而且在酸性ph下可以提高肽的hplc层析特性 因此肽的esi大都是在酸性样品的正离子模式中进行的 样品通过液流流动 通常从hplc 进入离子源 穿过有持续高压的不锈钢锥体或进样针 随着液流离开进样针样品分散为细雾状微滴 微滴含有肽离子以及hplc流动相组分 水 乙腈 醋酸等 离子源进一步从溶液组分中分离肽离子 将离子转移到质量分析器 肽质量指纹图谱是指蛋白质被酶切位点专一性的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱 用实验测得的蛋白质酶解肽段质量在蛋白质数据库中检索 寻找具有相似质量的肽从而鉴定蛋白质 将简单的方法与稳定的高通量仪器操作 特别是maldi tofms 相结合 很适合分析蛋白质组学 进行蛋白质鉴定的质量取决于ms数据的质量 数据库的准确性以及使用的检索算法和软件的功能 肽质量指纹图谱 peptidemassfingerprint pmf 3 与质谱相关的技术 肽质量指纹谱 概述 一 完整的蛋白质目录的获得获得某个生物的整个蛋白质组 用胰蛋白酶切割成不同大小的胰蛋白酶肽 每一个蛋白质用胰蛋白酶消化产生一定数量的有特定长度和序列的肽 而且这些肽有特定的质量 只要胰蛋白酶肽段混合物的每一个肽与其来源蛋白质和氨基酸序列位点相关联 蛋白质组的全部信息就得以保留 首先用胰蛋白酶肽消化未知蛋白质产生胰蛋白酶肽 消化后得到的每一肽段的质量各不相同 如果每一个胰蛋白酶肽消化产物的确切质量已知 那么取一定质量的胰蛋白酶肽段与整个目录进行比较 我们会发现目录中有与之质量完全一样的肽片段 如果在全部肽质量的目录中 这种匹配是唯一的 我们几乎可以肯定这两个肽段是相同的 然后可以用未知蛋白质的第二个胰蛋白酶肽段以相同的方式与目录匹配 从目录中得到与未知肽段匹配的已知肽段和蛋白质 未知蛋白质的胰蛋白酶肽段质量与目录中胰蛋白酶肽段的多个匹配可以说明未知蛋白质的特性 二 某个生物的未知蛋白质的鉴定 三 肽质量指纹谱能否成的用于鉴定蛋白质的决定因素 1 必须能够精确测定肽质量2 必须由有效且精确的蛋白质序列数据库 例如 人血红蛋白 链的胰蛋白酶消化产生14个胰蛋白酶肽 其中序列为vgahageygae aler肽的单个同位素精确质量为1528 7348da 其单电荷粒子的m z值为1528 7348 这个肽对swiss prot数据库中所有小鼠和人蛋白质的检索 结果显示有478个来自小鼠和人蛋白质的胰蛋白酶肽为1529 1da 如果能对肽离子进行更精确m z值测定和使用更严格的质量误差极限 可以把最终匹配的数目缩小到两个肽 肽片段的部分测序 peptide edman法测序鉴定 氨基酸组分分析 微量测序 全自动氨基酸分析仪 高效液相色谱 edman法测序仍为经典的测序方法 目前其检测灵敏度可达到pmol水平 用肽序列标记搜索dbest库 cid谱和肽序列标记从dbest中搜索到的匹配序列 a 乳清蛋白的一个酶解肽段的cid谱翻译后修饰的自动解释的示意图 proteinsample imageanalysis proteiningel proteinonmembrane proteininsolution 2 dpage excision blotting elution partialdegradation peptidemixture massofprotein n terminalsequence ms edmandegradation peptidemassfingerprint peptidesequencems msdata databasesearching novelorpreviouslystudiedprotein characterizationofpost translocationmodifications 蛋白质组的分析流程 3 蛋白质组学过程 functionalanalysis state1 2de pmf ms ms lc ms ms databasesearch differentialanalysis 流感嗜血杆菌的蛋白质组研究大肠杆菌的蛋白质组研究致病微生物的蛋白质组研究酿酒酵母的蛋白质组研究 第四节蛋白质组研究的应用与发展趋势 一 原核及简单真核生物的蛋白质组研究 流感嗜血杆菌是第一个获得基因组全序列的生物 瑞士的一个小组通过2 dpage研究了流感嗜血杆菌的蛋白质组分 在ph3 10的范围内鉴定了约300个蛋白质组分 然后分离了很难分离到的5 20kd范围内的蛋白质 还鉴定了其中的80种 另外用肝素亲和层析将碱性蛋白质富集后 在ph6 11的范围内又鉴定了102个蛋白质 其中许多是核酸结合蛋白尤其是核糖体蛋白 华盛顿大学的另一个小组将双向电泳得到的流感嗜血杆菌303个蛋白质斑点进行质谱分析 确定了263个蛋白质 其中大部分是外膜蛋白 以及与能量代谢和大分子合成相关的蛋白质 另外发现了几种不能在基因组中找到对应序列的蛋白质 令人惊奇的是 大约22 的被鉴定了的蛋白质表现出与预计不同的等电点与分子质量 显示它们可能经过了翻译后加工 流感嗜血杆菌的蛋白质组研究 大肠杆菌全部4000多个基因的dna序列已被测定 如果把双向电泳得到的蛋白质谱与基因组分析结果联合起来 建立蛋白质 基因联合数据库 可回答以下几方面的问题 a 所有编码基因的产物在双向图谱上的位置 b 各种蛋白质的丰度 c 不同条件下各种蛋白质表达水平及合成速率的变化 d 各种蛋白质在细胞内的定位 e 某些蛋白质翻译后修饰的方式及水平 目前 大肠杆菌联合数据库包括1600个蛋白质斑点的数据 其中约400个蛋白质斑点已与约350个基因相对应 有些基因可能有多个蛋白质产物 对于这些蛋白质 这个数据库可以提供基因名称 蛋白质名称 ec编号 功能范畴 swiss prot数据库编号 enbank序列号 基因图谱的位置 染色体上的转录方向以及一些生理信息 如在不同生长条件下该蛋白质在细胞内的丰度 大肠杆菌的蛋白质组研究 蛋白质组的一个重要应用是在阐明新抗生素作用机理的研究上 当今 细菌对大多数抗生素都有了抗性 寻找作用于细菌内新的靶子的研究工作已经展开 找到了许多有效的抗菌化合物 但目前遇到的困难在于难以揭示新的化合物的作用靶子及其作用机理 有时虽在体外发现新化合物能够使某种蛋白质失活 但在体内是否有这种现象和这是否是抗菌的主要机制仍然未知 现在双向电泳分析提供了一个有效手段 例如在研究抑制核糖体类抗生素对细菌的作用机制时 对12种作用于翻译过程的不同阶段和核糖体内不同分子的抗生素加以考察 发现其中8种诱导冷休克反应的一系列蛋白质 另4种诱导一系列热休克反应的蛋白质 因此预计新的作用于核糖体的化合物也是诱导这两种反应 并且籍此可以推测大肠杆菌对冷热的反应发生于核糖体水平上 蛋白质组研究的重要优势在于能够从整体水平上分析不同条件下蛋白质谱的变化 例如作为一种差异显示技术 这一技术已被用于比较结核分枝杆菌与牛结核分枝杆菌蛋白的不同 结果发现一些在基因水平上很类似的蛋白在蛋白质水平上有很大差别 这可能部分解释近年来牛痘作为结核病疫苗会出现失败的现象 致病微生物的蛋白质组研究 酿酒酵母基因组测序已完成 已建立德蛋白质数据库包括6000余个已知或推测的酵母蛋白 它包含以下几方面的信息 以序列为基础的已知和推测的酵母蛋白的特征信息 如分子质量 等电点 氨基酸组成 多肽片段大小等 一些研究得到的关于各种蛋白质在翻译后加工 亚细胞定位 功能分类方面的信息 从以往的超过5000篇关于酵母蛋白研究的文章中获得的有关各种蛋白质功能 相互作用 突变表型的信息 借助数据库的有力推动 在双向电泳蛋白质谱上最明显的蛋白质斑点的大部分得到鉴定 酿酒酵母的蛋白质组研究 正在丹麦进行的一项研究计划分别作出野生型和将基因系统缺失的缺陷型酵母的双向蛋白质图谱 初步的研究表明 缺失单一基因将导致的结果并不只是缺乏此基因编码的蛋白质 而是能导致其他一系列蛋白质量的改变 一些蛋白质减少而另一些蛋白质增多 当然还有一些蛋白质被加工修饰而导致性状改变 单一基因缺失的结果总是引起蛋白质组全局性的变化 大约20 的酵母基因缺失是致死性的 另外80 则不然 这时机体能通过调节蛋白质的表达来对抗这种内源性的变化 这种基因缺失的研究可能会告诉我们一些关于细胞内蛋白质分子间相互 对话 和 作用 的重要信息 如蛋白质间的物理联系 这些蛋白质可能会组成蛋白质复合物 信号传递途径 以帮助我们了解细胞是如何构成的以及是如何协同工作的 线虫的蛋白质组研究果蝇的蛋白质组研究人类的蛋白质组研究植物的蛋白质组研究 二 多细胞真核生物的蛋白质组研究 利用双向电泳技术 ini对线虫 elegans 进行了蛋白质组分析 在等电点3 5 9和分子质量10 200kd的范围内可分辨2000个以上的蛋白质斑点 然后利用edman法微量测序技术对其中24个斑点进行分析 得到其中12个蛋白质的 端序列 其余的由于 端封闭而未能测出序列 已测出的12个中有1个未能找到与其匹配的基因 另外11个与能量代谢 酸性核蛋白 蛋白等对应 线虫19000个基因已于1998年12月全部测出 预计会对蛋白质组的研究提供帮助 线虫的蛋白质组研究 不同性别果蝇 drosophililamelanogaster 成虫的头 胸 腹部的蛋白质组图谱已被分别作出 总共约有1200个蛋白质被检出 其中的大多数在头 胸 腹中是相同的 但也发现了一部分其部位 性别特异的蛋白质 果蝇的蛋白质组研究 人类的蛋白质组研究吸引了最多的注意力 由于人有着大量的组织 细胞类型和发育阶段 对人蛋白质组的研究主要聚焦在特异的组织 细胞和疾病上 已有的证据表明 尽管人的不同组织有着很大的功能差别 但其中的许多蛋白质是看家蛋白 因此它们的双向图谱可能也是近似的 这点与简单生物不同 简单生物在不同的发育阶段有着极不相同的蛋白质组 因此对于人类来说 一个高质量的基本的双向图谱是非常有用的 它可以作为其他组织 细胞的参照图谱 人的各种组织 器官 细胞乃至各种细胞器已被广泛研究 人类的蛋白质组研究 人的各种体液 血液 淋巴 脊髓 乳汁和尿等 都被用于研究与某些疾病的关系 最近澳大利亚科学家利用双向电泳技术研究眼泪中的蛋白质与生理状态的关系 他们发现了一种新的蛋白质 这个蛋白质非常相似于在乳腺癌细胞里高表达的另一种蛋白质 这个发现可能会提供疾病诊治的新的手段 在一项利用蛋白质组研究技术进行的酒精对人体毒性的研究中发现 乙醇会改变血清蛋白糖基化作用 导致许多糖蛋白的糖基缺乏 如转铁蛋白 肿瘤至今仍是人类的一个顽敌 癌细胞不仅有许多特异蛋白质产物 而且这些产物还会影响其他蛋白质的翻译后加工及许多蛋白质的表达水平 肿瘤的蛋白质组研究能提供一些以往其他技术所不能提供的早期诊断依据 例如利用不同细胞组织的特征蛋白质谱 可以判别一些难以判定来源的肿瘤细胞的来源 丹麦的一个小组利用蛋白质组研究技术结合组织冰冻切片技术分析了150例膀胱癌病人的组织 发现在所有的鳞状细胞瘤的尿液中均能发现一种化学引诱剂 银屑素 推测其极可能作为这种肿瘤的早期标志物 基因组计划无疑为医疗 医药领域带来一场革命 但也应该看到 单纯的遗传分析很难诊断多因素的疾病 复杂的基因间相互作用 细胞内活动和环境的影响都会影响基因的表达及蛋白质的翻译后加工 因此 可靠的诊断和治疗应基于机体渐进发展过程的调控及失调 并且必须考虑到环境因素的影响 蛋白质组的研究正是探索这一领域的有力武器 人们不难预期 基因组计划的不断推进会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库 生物信息学的发展会给蛋白质组计划提供更方便有效的计算机分析软件 国际互联网会使各国各领域科学家有关蛋白质组研究的成果出现新的集成 新的技术会不断涌现 蛋白质组研究方法会象pcr技术一样易于操作 并渗透到人类活动的方方面面 对工业 农业 医疗卫生各行各业带来新的革命 蛋白质序列库 swiss prot内容丰富 提示详尽http www expasy ch sport pir较http www nbrf georgetown edu pir pir psi htmltrembl embl的翻译 http www expasy ch sprot owl 非冗余库 http www biochem ucl ac uk bsm dbbrowser owl owl html核苷酸数据库 embl欧州分子生物学http www ebi ac uk ebi docs embl db ebi topembl htmlgenbank美国生物工程信息中心http www ncbi nlm nih gov web search index htmldbestcdna序列标记http www ncbi nlm nih gov dbest 模体与域 prosite序列模体http www expasy ch sport prosite htmlblocks保守序列http www blocks fhcrc org prodom蛋白质域http protein toulouse inra fr prodom htmlsbase蛋白质域http base icgeb 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