基于表达序列标签的玉米单核苷酸多态性标记开发毕业论文.doc

基于表达序列标签的玉米单核苷酸多态性标记开发毕业论文目 录1 文献综述.1 前言.11.1 分子标记概述.11.1.1 DNA分子标记的概念.11.1.2 分子标记的主要类型.21.2 SNP在玉米遗传育种中的应用及研究进展.41.2.1 构建高密度遗传连锁图谱.41.2.2 遗传图谱和物理图谱的整合.41.2.3 基因型与表现型关联分析.41.2.4 种质资源遗传多样性研究和保存.51.2.5 物种进化和生物多样性研究.51.3 SNP位点的生物信息学发掘.51.3.1 基于EST序列的SNP发掘.61.4 SNP的实验室检测方法.81.4.1 直接测序.81.4.2 变性梯度凝胶电泳（DGGE）.81.4.3 变性高效液相色谱法（DHPLC）.81.4.4 等位基因特异寡核苷酸片段分析（ASO）.81.4.5 TaqMan技术.91.4.6 基因芯片技术.91.4.7 高分辨率溶解（HRM）.91.5 现有的SNP数据库.101.6 研究目的及方法.102 材料和方法.122.1 本地化数据分析系统的构建.122.1.1 实用数据提取系统的构建.122.1.2 本地化序列比对系统的构建.142.1.3 SNP分子标记开发系统的构建.172.2 SNP分子标记的开发.192.2.1 原始数据来源.192.2.2 EST序列前期处理.192.2.3 与CDS同源的EST序列聚类.192.2.4 EST序列拼接与SNP位点发掘.202.2.5 保守序列的获取及引物设计.212.2.6 电子PCR及引物筛选.212.2.7 多态性信息含量计算.212.2.8 SNP分子标记数据库建立.222.2.9 供验证SNP分子标记挑选.222.3 SNP分子标记的验证.232.3.1 玉米材料.232.3.2 实验仪器.252.3.3 玉米基因组DNA的提取及检测.252.3.4 SNP分子标记验证HRM技术.273 结果与分析.293.1 SNP分子标记开发.293.1.1 SNP标记及其数据结构.293.1.2 SNP标记在染色体上的分布.293.1.3 SNP位点的多态性信息含量.313.2 SNP分子标记验证.313.2.1 高分辨率熔解曲线.313.2.2 自交系间SNP分型.374 讨论 .434.1 SNP的高多态性及适应性.434.2 本地化数据分析系统构建的必要性.434.3 EST序列质量控制.444.4 EST-SNP位点发掘.444.5 SNP位点的多态信息含量.454.6 高分辨率熔解技术用于SNP检测的优势.454.7 PCR引物质量与特异性.464.8 SNP分型.46参考文献.49致谢.55551 文献综述玉米是我国最重要的禾谷类作物之一，也是“粮-饲-经”多功能作物，并以其高产、营养丰富、可作为工业和医药原料等而居重要地位。我国玉米产量的增加很大程度上依赖于玉米育种水平的不断提高。尽管传统育种技术在作物遗传改良方面取得了显著成就，但由于其选择效率较低、周期较长，已不能满足当前玉米生产对优良品种的需求。利用基因组学和生物信息学，开展玉米分子标记育种研究，构建实用、高效的分子育种技术体系，选育高产优质多抗玉米新品种，已经成为玉米育种的重要研究方向。20世纪80年代是分子标记技术的发展期，这一时期，分子标记的运用仅仅局限于简单性状的改良，很少有针对复杂数量性状的分子辅助育种的实践。从90年代开始分子标记辅助育种进入应用时期，并证明分子标记辅助育种可以改善玉米自交系的一般性状和提高玉米杂交种的产量。随着玉米基因组测序的全面开展，单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）分子标记作为一种新型遗传学研究工具在玉米基因组的研究和玉米分子育种中得到广泛应用。由于SNP的高密度性，可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列的分子标记，比其他分子标记能够更加准确的定位某个基因，可以大大提高我们对基因进行定位的精细度，SNP标记很快成为玉米遗传育种研究最主要的分子标记。与生物信息学相结合，利用公共数据库中的冗余序列开发大量SNP分子标记，应用关联分析发掘玉米数量性状基因以及分子标记辅助选择已成为目前玉米分子育种的重要手段。 1.1 分子标记概述1.1.1 DNA分子标记的概念DNA分子标记是1980年发展起来的一种以DNA多态性为基础的遗传标记，它是DNA水平上遗传多态性的直接反映。它与传统的形态学标记、细胞学标记和同工酶标记相比能对处于不同发育阶段、不同环境条件下的不同个体、不同组织、不同器官甚至细胞进行检测，不受环境及基因表达与否的限制，所建立的遗传标记不仅数量大，且变异十分丰富 郑成木植物分子标记原理与方法湖南科学技术出版社，2003。1.1.2 分子标记的主要类型 RFLP标记限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）标记，它是指基因型之间限制性片段的长度差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的，这类分子标记被称为第一代分子标记。RFLP遍布于整个基因组，并且非常稳定；该标记性状为共显性，易于区分杂合体和纯合体；但RFLP实验操作繁琐、检测周期长、成本高、不适于大规模的分子标记开发和分子育种实践，并且在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的分子标记。 STS标记特定序列位点（Sequence-tagged Site，STS）标记是由特定引物序列所界定的一类标记。在生物的基因组中常存在大量的单拷贝序列，根据单拷贝DNA两端的序列设计特异引物对基因组DNA进行PCR扩增，所产生的一段序列在基因组中往往只出现一次，从而能够界定基因组的特异位点，将RFLP片段两端测序，设计一对专一引物即可获得STS标记。STS标记的检测只包括PCR扩增和产物电泳两个步骤，实验操作非常简单；但将RFLP标记转移成STS标记以后，多态性会降低，因此需要再用限制性内切酶酶切扩增产物，产生扩增产物的RFLP，从而提高STS的多态性检测能力。 RAPD标记随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）标记是利用随机引物(一般为810个碱基)对基因组DNA进行PCR扩增，然后电泳检测PCR产物的多态性。RAPD扩增所需的模板DNA量少，操作简单，合成一套引物可用于不同实验室、不同物种的检测。但RAPD标记是一种显性标记，不能区分杂合与纯合基因型，且受反应条件影响大，结果不稳定，重复性较差。 AFLP标记扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）标记是RFLP与PCR两项技术相结合的产物。AFLP的原理是基于对基因组DNA双酶切经PCR扩增后的限制性片段进行选择。基因组DNA经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，酶切后的DNA片段被连上人工接头形成带接头的特异片段，作为PCR扩增的模板，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计PCR引物，通过接头序列和PCR引物的识别，只有那些与引物的选择性碱基严格配对的DNA片段才能被扩增出来，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对特异的限制性片段进行分离。AFLP标记所检测的是由酶切位点的变化或酶切片段DNA序列的插人与缺失所引起的多态性，本质上与RFLP一致，但与RFLP技术相比，AFLP技术可以检测微量的DNA样品，灵敏度高，可以观察到的多态性片段较多，适合用于生物遗传背景的比较分析。 SSR标记简单序列重复（Simple Sequence Repeats，SSR）又叫微卫星DNA标记。它是指基因组中存在的由25个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，这种序列广泛分布于真核生物基因组。由于串联重复序列重复次数的不同就产生了等位基因之间的多态性，由于SSR两端多为相对保守的单拷贝序列，通过设计引物可以进行PCR扩增。SSR标记具有共显性、高多态性和易于检测等优点，是一种理想的分子标记，被称为第二代分子标记。它克服了RFLP和RAPD的缺点，且完全符合作物种质鉴别的4个基本准则：即环境的稳定性、种质间变异的可识别性、最小的品种内变异和实验结果的稳定可靠性，可用来高效准确地检测生物体中的遗传变异，因此被广泛应用于许多作物的基因定位和QTL分析、DNA指纹和品种鉴定和分子标记辅助育种等。 SNP标记单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是由单碱基颠换、转换、插入或缺失引起的DNA序列变异 Lander ES. The new genomics: global views of biology. Science, 1996, 274: 536-539。在一个物种的群体中，SNP一般只有两种等位型，但其中最少一种等位基因型的频率不小于1%。SNP在基因组内可划分为两种形式 Venter JC, Adams MD, Myers EW, et al. The sequence of the human genome. Science, 2001, 291: 1304-1351：一是遍布于整个基因组的大量单碱基变异；二是出现在基因编码区的功能性突变，由于这类SNP分布在基因编码区，故又称其为cSNP（Coding Single Nucleotide Polymorphism，cSNP），这类SNP比较少，大概只有1%可引起表达蛋白的多态性变异 Kavita G, Philip G, Deborah AN. Identification of Candidate Coding Region Single Nucleotide Polymorphisms in 165 Human Genes Using Assembled Expressed Sequence Tags. Genome Res, 1999, 9: 1087-1092。根据其对生物的遗传性状的影响，cSNP又分为2种 Stitziel NO, Tseng YY, Pervouchine D, et al. Structural location of disease-associated single nucleotide polymorphisms. J Mol Biol. 2003, 327: 1021-1030：同义cSNP（Synonymous cSNP），这类SNP的出现并不影响其所翻译蛋白质的氨基酸序列，突变与未突变碱基的含义相同；非同义cSNP（non-synonymous cSNP），这类SNP的出现可使翻译蛋白质的氨基酸序列改变，影响蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。出现在非编码区中基因表达调控区的SNP，可能会影响基因的表达调控，也被称为功能多态性。与其他分子标记相比，SNP具有分布密度高、遗传稳定、与表型性状相关性强、检测简便、易于实现自动化分析等优点 Botstein D, White RL, Skolnick M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet, 1980, 32: 314-331-, Becker J, Heun M. Barley microsatellites: allele variation and mapping. Plant Mol Biol, 1995, 27: 835-845, Authony B. SNP attack on complex traits. Nature Genet, 1998, 20: 217-218, Gupta PK, Roy JK, Prasad M. Single nucleotide polymorphisms: a new paradigm for molecular marker technology and DNA polymorphism detection with emphasis on their use in plants. Curr Sci, 2001, 80: 524-535, Ching A, Caldwell KS, Jung M, et al. SNP frequency, heliotype structure and linkage disequilibrium in elite maize inbred lines. BMC Genetics, 2002, 3: 19, Feng Q, Zhang Y, Hao P, et al. Sequence and analysis of rice chromosome 4. Nature, 2002, 420: 316-320, Lijavetzky D, Cabezas JA, Ibez A, et al. High throughput SNP discovery and genotyping in grapevine (Vitis vinifera L.) by combining a re-sequencing approach and SNPlex technology. BMC Genomics. 2007, 8: 424, Ganal MW, Altmann T, Roder MS. SNP identification in crop plants. Curr Opin Plant Biol, 2009, 12: 211-217，成为继RFLP，SSR后的第三代分子标记，在遗传学分析中得以广泛应用。1.2 SNP在玉米遗传育种中的应用及研究进展1.2.1 构建高密度遗传连锁图谱SNP反映的是相应染色体水平上的遗传多态性，因此可用于绘制染色体遗传图谱。在玉米基因组上，SNP的分布密度比人类（1/1900 bp）、拟南芥（1/3300 bp）、水稻（1/268 bp）、大豆（1 SNP/200 bp）的都要高 Coryell VH, Jessen H, Schupp JM, et al. Allele-specific hybridization markers for soybean. Theor Appl Genet, 1999, 101: 1291-1298-, Deutsch S, Iseli C, Bucher P, et al. A cSNP map and database for human chromosome 21. Genome Res, 2001, 11: 300-307, Feng Q, Zhang YJ, Hao P, et al. Sequence and analysis of rice chromosome 4. Nature, 2002, 420: 316-320, Sachidanandam R, Weissman D, Schmidt SC, et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature, 2001, 409: 928-933，在第1号染色体上平均每104 bp就有1个SNP Tenaillon MI, Sawkins MC, Long AD, et al. Pattern of DNA sequence polymorphism along chromosome 1 of maize. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 9161-9166, Zhao W, Canaran P, Jurkuta R, et al. Panzea: a database and resource for molecular and functional diversity in the maize genome. Nucleic Acids Res, 2006, 34: 752-757，Dinakar等 Dinakar B, Maureen D, Mike H, et al. Insertion-deletion polymorphisms in 3 regions of maize genes occur frequently and can be used as highly informative genetic markers. Plant Molecular Biology, 2002, 48: 539-547研究表明，在玉米的3 非编码区（Un-Translated Region，UTR）区域中，每48 bp出现1个SNP；而在编码区域内，每130 bp出现1个SNP。可见玉米属于高多态性作物，可以很容易地用SNP绘出基于EST序列的遗传图谱。Davis等 Davis G, Long MJ, Lee M, et al. Theintermated B73Mo17 genetic map. a community resource: /, 2001人成功地用B73Mo17这一高分辨率的作图群体和SNP Pyrosequencing检测技术完成玉米EST遗传图谱的绘制。随着新的SNP标记的发现和定位，遗传连锁图谱标记密度将日益升高。标记密度越高，提供的信息越丰富，能够将数量性状位点（Quantitative Trait Loci，QTL）定位于更小的染色体区域内，为新主效基因的发现、定位和克隆打下基础。使我们可以更精确地进行分子标记辅助选择（Molecular Assisted Selection，MAS）和分子标记辅助导入（Molecular Assisted Introgression, MAI） 郝岗平，杨清，吴忠义等植物的单核苷酸多态性及其在作物遗传育种中的应用植物学通报，2004，21(5)：618-624。先锋和孟山都公司都建立含有SNP标记直接用于分子育种的遗传连锁图，这些高通量的分子标记已经被广泛用于分子标记辅助选择，回交选择和轮回选择。 1.2.2 遗传图谱和物理图谱的整合物理图谱是由一系列按顺序排列的细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes，BAC）克隆重叠群组成。将物理图谱与传统遗传图谱进行整合时，需要筛选BAC 末端序列来找到没有重复序列的区域，然后在此区域发现作图亲本之间的SNP 多态性，这些SNP 标记再用于传统遗传作图。在玉米中，大约有20%的BAC末端序列为单或低拷贝序列区域 Meyers BC, Tingey SV, Morgante M. Abundance, distribution, and transcriptional activity of repetitive elements in the maize genome. Genome Res, 2001, 11: 1660-1676，可用于物理图谱与传统遗传图谱的整合。1.2.3 基因型与表现型关联分析关联分析是一种以连锁不平衡为基础鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法。在进行关联分析时，需要检测候选基因的等位基因与表型的关联性或者对全基因组扫描来确定与表型相关的区域，基因组扫描所需要的最少分子标记数目取决于连锁不平衡的染色体区域长度 Rafalski JA. Applications of single nucleotide polymorphismsin crop genetics. Current Opinion in Plant Biology. April 2002, 5(2): 94-100。对不同遗传背景玉米群体的连锁不平衡分析发现，玉米是连锁不平衡系数衰变很快的物种 Ersoz ES, Yu J, Buckler ES. Applications of linkage disequilibrium and association mapping in maize. In A. Kriz and B. Larkins, eds. Molecular Genetic Approaches to Maize Improvement. Springer, 2008，所以需要一套高密度的多态性分子标记进行系统的基因组扫描。SNP 因其高密度性、稳定性和易于自动化检测成为首选。Thomsberry等 Thomsberry JM, Goodman MM, Doebley J, et a1. Dwart8 polymorphisms associate with variation in flowering time. Nat Genet, 2001, 28: 286-89以Dwarf8为侯选基因，发现的9个SNP和InDel位点与开花期显著相关，开发了开花期相关的功能分子标记。1.2.4 种质资源遗传多样性研究和保存1970年玉米小斑病在美国大流行，超过1840年欧洲马铃薯晚疫病大流行造成的损失，作物遗传脆弱性及其遗传多样性成为种质资源研究者关注的热点。DNA水平上的遗传多样性研究有助于正确制定作物种质资源收集及保护方案。为提高种质资源遗传多样性研究中的检测效率，发展一套高效的分子标记技术鉴别体系是非常必要的。鉴于上述SNP的优点，让它在种质资源遗传多样性研究和保存中成为鉴别体系的首选标记。1.2.5 物种进化和生物多样性研究玉米的进化和多样性的形成与其基因组的突变和自然选择有密切关系，在漫长的进化过程中因适应环境的变化而形成自身特有碱基序列。所以，通过构建SNP图谱，比较玉米种间单碱基的差异，构建进化树，将促进其起源与进化的鉴定与分类研究 Wright SI, Schroeder SG, Yamasaki M, et al. The effects of artificial selection on the maize genome. Science, 2005,308: 1310-1314。Doebley等 Doebley JF. Molecular evidence and the evolution of maize. Economic Botany, 1990,44: 6-27用分枝玉蜀黍tb1位点的SNP来研究玉米的进化，他们对17个玉米基因型，12个玉蜀黍基因型和几个墨西哥玉蜀黍变种的tb1基因的编码区和非编码区进行了分析，表明在玉米的驯化过程中，选择压力对启动子区域的影响比编码区大，进而造成表型的改变。此外，植物病原微生物和昆虫在外来条件的选择压力下，基因常常会发生变异，使作物品种丧失抗性，药剂防治效果下降。采用基因突变检测技术，及时地监测病原微生物和昆虫基因的变异情况，对玉米的抗病虫育种以及病虫害防治均具有一定指导意义。1.3SNP位点的生物信息学发掘随着人类基因组计划和各种模式生物的基因组计划陆续开展，NCBI、EBI、DDBJ三大数据库中存储的DNA序列数据量飞速增长，这一不断增大的数据库资源成为寻找SNPs的重要宝藏。采用先进的生物信息学软件，利用计算机自动识别，从已有的DNA Database中搜寻SNP位点已经成为一种简单、有效、廉价的新策略。对于已经完成全基因组测序的物种，可以基于不同生态型或种质的全基因组序列对比来发现它们间的序列多态性位点 陈伟，张戈，张思仲基于生物信息学的SNP候选位点搜寻方法遗传，2001，23(2)：153-156。在2002，水稻的两个品种（粳稻品种日本晴和籼稻品种9311）和拟南芥的两种生态型（Col和Ler）已经完成全基因组序列测定，在当年建立了拟南芥全基因组序列SNP多态性数据库 Jander G, Norris SR, Rounsley SD, et al. Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiology, 2002, 129: 440-450，2004年建立了水稻的基因组序列SNP多态性数据库 Shen YJ, Jiang H, Jin JP, et al. Development of Genome-Wide DNA Polymorphism Database for Map-Based Cloning of Rice Genes. Plant Physiology, 2004, 135: 1198-1205；而对于大多数物种而言，虽没有全基因组序列数据，但有丰富的表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST） Zheng Y, James MP. The discovery and confirmation of single nucleotide polymorphisms in the human p53R2 gene by EST database analysis. Mutagenesis, 2004, 17(5): 361-364-, Mariana S, Diana B, Adhemar Z, et al. Single nucleotide polymorphisms identification in expressed genes of Schistosoma mansoni. Molecular Biochemical Parasitology, 2007, 154: 134-140, Schultz J, Doerks T, Ponting CP. More than 1000 putative new human signaling proteins revealed by EST data mining. Nature Genetics, 2000, 25: 201-204, Kim H, Schmid CJ, Deckerks, et al. A double screening method to identify reliable candidate non-synonymous SNP from chicken EST data. Animal Genetics, 2003, 34: 249-254, Schmid KJ, Sorensen TR, Strack R. Large scale identification and analysis of genome wide single-nucleotide polymorphisms for mapping in Arabidopsis thaliana. Genome Res, 2003, 13: 1250-1257, David C, Ksenija G, Ross NC, et al. Development of a set of SNP markers present in expressed genes of the apple. Genomics, 2008, 92: 353-358和序列标记位点（Sequence-Tagged Site，STS）资源 Marth GT, Korf I, Mark D, et al. A general approach to single-nucleotide polymorphism discovery. Nature Genetics, 1999, 23: 452-455, Taillon MP, Gu ZJ, Li Q, et al. Overlapping Genomic Sequence: A treasure Trove of Single- nucleotide Polymorphisms. Genome Res, 1998, 8: 748-754。在GenBank中，仅玉米的EST序列已经达到200多万条，它是SNP位点发掘的有一个重要资源；此外，一些物种的基因组序列在公共数据库中公布的序列的丰富度不高，很多实验室就自行构建cDNA文库进行SNP位点的发掘 Morales M, Roig E, Monforte AJ. Single-nucleotide polymorphisms detected in expressed sequence tags of melon (cucumis melo L.). Genome, 2004, 47(2): 352-360-, Coles ND, Coleman CE, Christensen SA, et al. Development and use of an expressed sequenced tag library in quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) for the discovery of single nucleotide polymorphisms. Plant Science, 2005, 168: 439-447, Fahrenkrug SC, Freking BA, Smith TP, et al. Single nucleotide polymorphism (SNP) discovery in porcine expressed genes. Animal Genetics, 2002, 33: 186-195, Fizsimmons CJ, Savolainen P, Amini B, et al. Detection of sequence polymorphisms in red junglefowl and white leghorn ESTs. Animal Genetics, 2004, 35: 391-396。1.3.1 基于表达序列标签的SNP发掘 表达序列标签概述表达序列标签是从已经建立好的cDNA文库中随机挑取克隆，从5 或者3 末端对插入的cDNA片段进行一轮单向测序，所获得的一段60500 bp大小的cDNA序列。每一条EST序列均代表文库建立时所采样品特定发育时期和生理状态下的某个基因的部分表达序列 Adams MD, Kelley JM, Jeannine D, et al. Complementary DNA sequencing expressed sequence tags and human genome project. Science, 1991, 252: 1651-1656.。EST可用于搜寻同一物种中基因家族的新成员 Still IH, Vince P, Cowell JKThe third member of the transforming acidic coiled coil-containing gene family TACC3, maps in 4p16, close to translocation breakpoints in multiplemyeloma and is upregulated in various cancer cell lines. Genomics, 1999, 58(2): 165-l70；搜寻不同物种间功能相同的基因 刘春宇，张春玲，夏家辉数据综合分析鉴定人类Auxilin基因生物化学与生物物理进展，1998，25(5)：434-439；搜索已知基因的不同剪切模式 Modrek B, Resch A, Grasso C, et al. Genome-wide detection of alternative splicing in expressed sequences of human genes. Nucleic Acids Res, 2001, 29 (13): 2850-2859；搜索等位基因在基因表达中的变异 Lanfranchi G, Muraro T, Caldara F, et a1. Identification of 4370 expressed sequence tags from a 3-end-specific cDNA library of human skeletal muscle by DNA sequencing and filter hybridization. Genome Res, 1996, 6(1): 35-42等。公共数据库中的EST序列来自不同机构的不同文库，这些EST序列往往体现着很高的多态性，因而可用于发掘表达序列中存在的SNP位点，这些SNP在进行遗传、表型相关性分析时是非常重要的。 常用的SNP发掘软件（1）Polybayes Polybayes是在UNIX环境下开发来专门检测SNP的软件，可对任意DNA序列的突变碱基进行检测。SNP等位基因频率、序列准确度、EST序列长度及PSNP最小值的选择都对其灵敏度有很大影响，被分析序列的准确度和SNP等位基因频率越高，所包含EST序列越短，选择PSNP的最小值越大，则Polybayes计算法检测SNP灵敏度越高，可达100% March GT, Korf I, Yandell MD, et al. A general approach to single- nucleotide polymorphism discovery. Nat Genet, 1999, 23: 452-456。（2）SNPpipelineSNPpipeline是利用信息学工具设计的检测任意DNA序列中SNP位点存在情况的一套半自动装置，分为PHRED，PHRAP和DEMIGIACE三个部分。PHRED负责分析大量基因组序列，收集含有EST的序列，并去除不准确的序列；PHRAP进行集中排列PHRED所选择的有多态性位点的序列；连接色谱仪，此时选择某一个特定核苷酸，显示器会给出其色谱仪洗峰、等位基因频率、洗峰振幅等信息，然后根据峰度的不同判定SNP位点；最后用DEMIGIACE进行筛选、检验并确认真正的SNP，去除错误的信息，敏感度在99%以上 Touching base: More SNPs in the pipeline. Nat Genet, 1999, 22: 221。Buetow等 Buetow KH, Edmonson MN, Cassidy A B. Reliable identification of large number of candidate SNPs from public EST data. Nat Genet, 1999, 21: 323-325利用该软件发现了10000个候选SNP；Cheng等 Cheng TC, Xia QY, Qian JF, et al. Mining single nucleotide polymorphisms from EST data of silkworm, Bombyx mori, inbred strain Dazao. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 34: 523-530以来自12个不同cDNA 文库的81635条家蚕EST序列，用Phred/Phrap软件包发现了101个高质量SNP候选位点以及27个单碱基的插入/缺失位点。Yamamoto等 Naoki Y, Taneaki T, Manabu W, et al. Expressed sequence tags from the laboratory-grown miniature tomato(Lycopersicon esculentum) cultivar Micro-Tom and mining for single nucleotide polymorphisms and insertions/deletions in tomato cultivars. Gene, 2005, 356: 127-134，用Phrap在35824条番茄得EST序列中发现2039个SNP位点，和121个插入/缺失（