基因芯片技术在耐药检测中的研究概况.doc

基因芯片技术在耐药检测中的研究概况马小林，李英伦(四川农业大学动物科技学院 药理实验室 雅安625014)摘要：基因芯片技术是近几年在国际上迅猛发展起来的一项高新技术，是生物技术与芯片技术相结合的产物。它在耐药检测研究中的应用将对耐药机制的研究、新的耐药基因的发现以及耐药个体化诊断具有极大的促进作用。关键词：基因芯片；耐药性；生物技术；病原微生物；耐药肿瘤The function of gene chip technology in the medicine examination Ma xiao-lin，Li ying-lun(College of Animal Science and Veterinary Medicine，Pharmacology laboratory，Sichuan Agricultural University，Ya an 625014，China)Abstract: The gene chip technology is an international swift and violent development high-tech in recent years, it is the associated production of biological technology and the chip technology, it has the enormous promot in the study and research about drugs resistance and the application in the drugs resistance mechanism research, the discovery drugs resistance newly gene, as well as the drugs resistance individual diagnosis .Key words：Gene chip；Drugs resistance；Technology of biology；Pathogenic microorganism； Bears the medicine tumor基因芯片技术是利用生物遗传法则，根据体内核酸中碱基配对、转录原理发展起来的一项新技术。至今，芯片技术已在医学领域中显示了其巨大的发展潜力并取得了一定的成功，为病原微生物的分子诊断技术提供了良好的发展前景。随着多种微生物全序列测定的完成，基因芯片技术的日臻完善，使基因芯片不仅能监测体外生长的细菌，而且可进行细菌的诊断、鉴别诊断、耐药性检测，亦可用于潜伏期或感染过程中的研究。本文就基因芯片在耐药检测中的应用和研究现状及其应用前景作一概述。1. 基因芯片和基因芯片技术概述1.1 概念 基因芯片(gene chip)，又称DNA微阵列(DNA microarray)，是近几年发展起来的一项前沿生物技术1。它是指通过光蚀刻、化学合成及微细加工工艺技术等方法，在很小的介质(如硅片、玻璃、尼龙膜等)表面合成，固定核酸、蛋白质及多肽序列形成高密度的点阵，与样品来源制备的探针杂交后，通过特殊的装置检测信号，并由计算机进行分析、综合，从而获得大量的生物信息，进行功能基因组的研究，更多地揭示基因之间表达变化的相互关系。其优势体现在快速、高效、高通量处理生物学信息的能力。基因芯片技术的开发始于90年代初期，其技术的发展得益于二项关键技术的发明，其一为非孔的固相支持介质，如玻璃片的使用，使微量和荧光检测技术的实现成为可能；其二是高密度原位合成寡核苷酸的方法，如Steve foder研究小组采用半导体制作技术中的光路印刷屏蔽技术，生产高密度的寡核苷酸芯片，在仅20wm的玻片表面合成，固定达400000个寡核苷酸探针2 。1.2 分类 基因芯片有多种分类方法，根据基因芯片的用途不同，可以分为表达芯片(expression chip)、基因组芯片(genomic chip)和测序芯片(sequencingchip)；根据芯片上核苷酸的长度不同，可分为寡核苷酸芯片(oligo-chip)、cDNA芯片和基因组芯片。尽管分类方法有很多，但其制作过程不外乎二种，一是原位合成寡核苷酸制备芯片，二是将制备好的DNA片段排列到固相载体上。 作者简介：马小林(1980- ),男,四川泸州人,在读硕士,主要从事新兽药研究与开发。1.3 应用1.3.1 基因表达研究：主要方法是从不同来源的个体、组织，不同的细胞周期、细胞发育阶段及分化程度，不同的病变，各种刺激(包括不同诱导，不同治疗阶段)的细胞内的mRNA或逆转录为cDNA后，与表达谱基因芯片进行杂交，通过这些在不同条件的检测对象与正常对照之间的综合比较、分析和判断，同时进行成千上万个基因的研究，迅速而准确地将某些基因与疾病建立联系，同时明确这些基因功能及确立这些基因间内在的相互作用关系。1.3.2 基因分型研究：通过与基因芯片杂交结果的分析，可以了解同一种疾病的不同基因变化情况。由于患者基因型的个体差异性，使治疗方案复杂化，而有了基因芯片确立患者的基因分型，可以帮助临床治疗方案个体化，这在白血病等疾患中表现得尤为突出及有价值。比如，许多形态学相似的白血病亚型和淋巴瘤，有相似的临床表现，造成了诊断困难，并因此可能引起治疗不当。有了基因芯片分型的帮助，可明确诊断，早期对症治疗，对延长病人的生存期、提高生存质量起到关键作用。1.3.3 基因突变检测：Hacia等3证实，疾病的发生和发展与基因突变有密切关系，采用由96000个20bp的寡核苷酸探针组成的杂交芯片，完成了对遗传性乳腺癌和卵巢肿瘤基因BRCA1中的第ll外显子345kb上的24个异合突变的检测，共检测15例，发现其中14例有基因突变，包括点突变、插入、缺失等，而在20个对照样品中没有假阳性结果的出现。Afynetrix公司与Oncormed公司合作研究了专用于监测与肿瘤相关的P53基因全长的编码序列，发现50 以上的肿瘤患者有P53基因的突变，这对于肿瘤的早期发现、早期治疗意义重大。1.3.4 DNA序列分析：芯片测序原理不同于传统的Maxam和Gibert的化学测序法及Sanger的末端终止法4，其原理为任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一系列碱基数固定，交叉重叠的寡核苷酸，依靠靶DNA片段与短的寡核苷酸探针杂交，通过重组交叉，重叠的寡核苷酸杂交谱，重建DNA序列。Mark等5利用不同的荧光标记，在一块固定有13 500个寡核苷酸探针(每个探针长度为25个碱基)的硅片上对长度为166kb的人线粒体DNA进行序列的重复测定，准确率高达99。2. 基因芯片在病原微生物耐药性检测方面的应用基因芯片可用于病原微生物耐药基因的表达谱检测、突变分析、多态性的测定。病原体的耐药基因的检测可通过两种方式：表达谱芯片检测药物诱导的基因表达改变来分析其耐药性；寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点从而分析其耐药性。美国Stanford大学的EAWinzeler等6，以两种不同菌株的酵母(S96和YJM789)作为实验材料，对控制酵母对放线菌酮的抗药发挥的基因进行分析。将含有酵母150000个DNA片断的基因芯片分别与这两株酵母活化转录的mRNA分子杂交，S96几乎全部吻合，而YJM789与芯片上的探针组存在较大的差异，约有3000个位点没有杂交显色。由于S96对放线菌酮有抗药性而YJM789的抗药性则弱得多，因此可以判定控制这一抗药性的基因的所在。而后，通过对S96和YJM789杂交后产生的抗药子代的遗传标记的分析，进一步确定控制该抗药性的基因位于15号染色体，是一长约57000个碱基的片断。目前已制备的耐药性基因探针如TMD耐药性基因、氨基糖苷类抗生素耐药性基因以-内酰胺酶基因等均已使用于临床7。Michael Wilson等8使用包含有肺结核杆菌基因组PRF 97序列的基因芯片，对应用抗结核药物异烟肼诱导的前后表达的变化进行检测，结果证明肺结核杆菌中脂肪酸合成酶、fbpC、efpA、radii23、fadE24和ahpC 基因发生的改变与耐药性有关。现在，结核杆菌耐药性检测芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。我国浙医一院传染病科俞云松、陈亚岗教授负责的科研小组检测到一种抗生素新耐药基因，世界基因库已将其正式命名为SHV28。只要在病人身上取血、尿或痰等标本进行检测，就可知道三代头孢类抗生素对治疗能否起作用。乙肝病毒(HBV)有较多亚型，HBV基因的多个位点如S，P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间检测一次，能指导用药，防止乙肝病毒耐药性很有意义。目前在肝炎的抗病毒治疗中产生的病毒耐药突变，最典型者为拉米夫定(3TC)抗HBV治疗中出现的YMDD变异。基因芯片针对引起YMDD变异的众多基因突变位点设计探针，将之结合于同一张芯片或与上述分型基因芯片合并，从血清样本中抽取病毒DNA，经体外扩增后与芯片探针杂交，依据杂交信号判定HBV的YMDD变异，得出是否产生耐药性的结论。现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3l2个月后常出现耐药，其原因是RT、PRO基因产生一个或多个点突变8。RT基因四个常见突变位点是ASp67Asn、Lys70Arg、Thr215Phe、Tyr和Lys219Glu，四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加。如将这些基因突变部位的全部序列构建为基因芯片，则可进行快速而有针对性的检测。3. 基因芯片技术在疾病耐药性检测中的作用基因芯片技术对于疾病耐药性检测应用主要有以下几个方面。3.1 多药耐药基因的表达检测肿瘤治疗中对细胞毒素药物的抗性是引起治疗失败的重要原因，是限制化疗的重要因素。机制是复杂的，由肿瘤的综合特征决定。另外，其他促进DNA修复和抑制细胞凋亡的基因表达改变也可能导致多药耐药。检测多药耐药基因表达的变化不但可以研究恶性肿瘤的不同耐药机制，还可以用于指导制定治疗方案。目前已建立的方法一次只能对一个基因进行研究效率低，难以定量检测耐药基因表达增加的幅度。基因表达谱芯片可同时对成千上万的基因表达进行检测，可以大大加速这方面的研究。另外基因芯片还可以帮助发现新的耐药基因。3.2 病原体耐药性检测多重耐药菌(MDR)感染在全球的状况十分严重。细菌对抗菌药物的耐药机制可有多种。采用基因芯片技术找到耐药菌的耐药基因。从而根据这些耐药基因设计新型抗生素或将耐药菌分成不同的亚型。针对不同的亚型在临床上使用相应的抗生素达到改善治疗效果的目的：检测耐药菌基因的改变提供了新药物作用的靶目标，并指导抑制这些靶目标试剂和药物的合成。用基因芯片不仅可以同时检测耐药菌的多个耐药基因，还可以同时对多个耐药菌的多个耐药基因进行检测。3.3 细菌耐药性检测耐药性又称抗药性，一般是指病原体的药物反应性降低的一种状态。这是由于长期应用抗菌药，病原体通过产生使药物失活的酶、改变原有代谢过程等，而产生的一种使药物效果降低的反应，因而作用的剂量要不断增加。对病原体耐药性的分子遗传学基础研究表明，细菌可通过不同机制产生遗传变异和对抗菌药物的改变。 微观的变化，在某一核苷酸碱基对中发生了点突变，导致抗菌药物作用靶位的改变，因而产生耐药性； 宏观的变化，导致DNA的一大片全部重排，包括倒位、复制、插入、中间缺失或细菌染色体DNA 的大段序列从原来部位转座至另一部位，此种转座系通过一种特殊的遗传物质，即转座子或插入顺序来完成； 由质粒或噬菌体或其他遗传片段所携带的外来DNA 片段，导致细菌产生耐药性。一般检测耐药性的方法有：药物敏感试验、质粒消除试验、质粒指纹图谱技术、基因探针、Southern blot，PCR，RTPCR 等方法，但是这些方法只能对少量样品进行分析，而基因芯片却可以克服此缺点，提高检测效率。基因芯片技术对于耐药基因的检测可从两个方面实现：一是通过基因表达谱芯片检测药物诱导基因表达的改变来分析其耐药性；二是寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点来分析耐药性。4. 基因芯片技术在耐药性检测中的应用和研究现状4.1 利用基因芯片技术快速检测结核杆菌的耐药性 结核病在全球的回升及耐药结核杆菌的出现，再次唤醒了人们的警觉，又重新将注意力集中到结核病和耐药结核杆菌，并进行广泛的研究。特别是对耐药结核杆菌耐药性的分子基础研究取得了令人鼓舞的进展。结核杆菌耐药性的出现是基因突变的一种表达方式，结核杆菌内耐药的位点在染色体上，不同药物的耐药突变株存在的突变频率各不相同。耐药性有多种不同的程度，根据决定耐药基因数量的不同，可分为单基因型和多基因型两类。前者不同程度的耐药性是一个基因的不同突变的结果,一次突变就可使结核杆菌产生高水平的耐药；多基因型不同程度的耐药性则是不同基因突变累积的结果，系由多基因突变所致。结核杆菌耐药基因突变的类型主要是点突变，其实质是1个基因内部的1个或几个核苷酸的插入、缺失或取代，致使核苷酸错误的密码编出错误的氨基酸顺序。近年来，学者们采用分子生物学技术对结核杆菌耐药基因的位置和基因突变位点的定位，促进了快速鉴定耐药突变株结核杆菌方法的建立9，例如：Gingeras、Tresch等10用分枝杆菌DNA杂交图像进行基因分型与菌种鉴定，对利福平抗药性基因进行了筛选检测等。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂，自动化程度低，操作序列数量少，检测效率低等不足，而且通过设计不同的探针阵列，使用特定的分析方法使该技术具有多种不同的应用价值。目前将基因芯片技术用于检测分子突变，不仅可准确地确定突变位点和突变类型，更主要的是它的快速高效是目前其它方法无法比拟的，并且它可以同时检测多个基因乃至整个基因组的突变。Chee等11利用生物传感器与芯片技术相结合，通过改变探针阵列区域的电场强度已经证明可以检测到基因的单碱基突变，因此利用基因芯片技术检测结核杆菌耐药基因的突变，进而对其耐药性进行鉴定是可行的，例如，张万江等12通过结核杆菌耐药性检测基因芯片的制备；临床分离株结核杆菌培养和药敏检测；结核杆菌基因组DNA的制备和结核杆菌耐药基因的聚和酶链反应；基因芯片的杂交、洗涤、检测与分析。探讨了利用基因芯片技术检测结核杆菌的耐药性。其研究结果也证明了利用基因芯片技术检测结核杆菌耐药性，准确、快速、高效，为快速鉴定耐药突变株结核杆菌提供了一种新的方法。4.2 利用基因芯片技术研究乌头碱抗KBv200细胞耐药机制 肿瘤多药耐药性是导致化疗失败的主要原因之一13，也是急性白血病、恶性肿瘤缓解后复发的重要根源。陈信义等14通过在筛选中药抗肿瘤耐药逆转剂过程中，发现温阳散寒中药乌头、附子提取的有效成分乌头碱能够逆转KBv200细胞对长春新碱的耐药。为深入探索其可能的作用机制，他们采用基因芯片技术研究了乌头碱对相关基因的影响。经过实验，结果显示整张基因芯片5504个基因克隆，其中用药前高表达基因2O8个，占克隆总数的3.8，用药后高表达基因196个，占3.6。用药前后细胞凋亡相关基因、CDKS家族、SMADS家族、MAPK信号转导系统等的基因发生变化。结论乌头碱可能通过影响细胞凋亡相关基因和影响MAPK信号转导系统等机制，最后作用于Mdrl基因的表达，从而起到抗耐药作用15。由此表明，基因芯片技术在肿瘤耐药研究中的应用将对肿瘤耐药机制研究、新的耐药基因发现以及耐药个体化诊断具有极大的推动作用13。在众多的研究中，陈信义等14发现乌头碱有逆转KBv200细胞耐药作用，流式细胞术、免疫组化结果均显示其有明显降低PgP蛋白表达作用15，16。他们将基因芯片技术引入到肿瘤细胞的多药耐药研究领域，从更深层次上揭示乌头碱逆转肿瘤多药耐药的机制，甚至寻找到了药物作用的靶基因。4.3 基因芯片技术在恶性血液病研究中的应用 基因芯片可以进行高通量的生物信息处理，确立细胞的基因表达谱，被检测目标DNA密度高，样本用量极少，自动化程度高，便于筛选出新基因，大大提高了发现新基因的效率。Rusiniak等17在对急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的研究中，利用芯片技术发现B94是全反式维甲酸(ATRA)治疗的潜在的靶基因。B94最初被认为是TNFct在人类上皮细胞中被诱导的转录本，在骨髓分化中起到重要作用。在正常人和急性非淋巴细胞白血病(M0-M2)亚型中均有表达，但是在表达PMLRARa融合基因的APL中表达明显较低，但在经过ATRA作用后，抽提mRNA与芯片杂交，发现其B94表达明显升高。即说明B94在APL中是ATRA的一个治疗的潜在靶基因。白血病患者中常有因染色体易位而形成融合蛋白。Rozovskaia等18发现，急性淋巴细胞白血病(acutelymphocytic leukemia，ALL)和急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia，AML)患者中，因ALLl基因重排导致染色体易位，形成由ALLl氨基酸末端和其配偶体蛋白的羧基末端组成的融合蛋白；而在ALLl基因重排的染色体易位中最常见的为t(4，l1)的易位；利用DNA芯片技术发现，在ALL的t(4，11)患者中，Meisl、HoxA9表达明显升高，而临床表现相似，无染色体异常的ALL患者中却无此改变；利用半量化或量化RTPCR技术检测57名原发性AML、ALL患者的Meisl、HoxA9、AC133及另外五种Hox基因，发现1314位t(4，l1)易位的ALL患者，8/8位ALLl基因重排的AML患者有Meisl、HoxA9的表达，提示Meisl、HoxA9基因的上调可能在具有ALL-l融合基因的ALL及AML的发病中扮演了重要角色。Kapp等19利用芯片技术研究了霍奇金病(Hodgkin Sdisease，HD)的发病机制，在制作的芯片中包含涉及炎症和肿瘤的950条基因，从二种HD细胞株L428和KMH2中抽提并纯化mRNA，逆转录成cDNA用荧光素标记后分别与芯片杂交，同时以EB病毒永生化的B原始淋巴细胞样细胞株(LCLGK)作对照，芯片结果显示，L428和KMH2细胞株中ILl3ILl5高表达，而对照组LCL及EBV阴性的非霍奇金病细胞株并不表达ILl3，其结果由Northern blot及酶联免疫吸附分析所证实，并揭示另一HD细胞株HDLM2中ILl3亦高表达。通过对HD患者淋巴结组织的原位杂交显示，ILl3持续升高是HRS肿瘤细胞特异的。将ILl3中和抗体作用于HD细胞株，显示HRS细胞增生受剂量依赖性抑制，说明HRS细胞通过自分泌机制分泌IL一13，同时ILl3反过来刺激了HRS细胞生长，为今后通过对ILl3信号传导系统调控治疗HD指明了方向。Hofmann等20研究了血液系统另一种恶性肿瘤套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)的发病。利用寡核苷酸芯片在MCL患者的淋巴结和良性高原始细胞淋巴结(nonmalignant hyperplastic lymphnodes，HLs)标本中作基因表达的比较，共研究5例MCL及4例HLs的标本，发现在MCL中有42条基因下调，其中有关凋亡途径基因的改变尤其引人注意。FADD基因作为诱导凋亡的关键基因在MCL中有超过10倍的下调，而另一些与凋亡途径相关的基因，如DAXX、CASP2、RAIDD 等，在MCL中均有下调，提示除了已知的促进细胞周期的周期素D1过度表达外21，与凋亡相关途径的失调在MCL的发病中亦起到相当的作用。在生理和病理状态下，每一个基因都不是单独起作用的，各基因在细胞分化、个体发育的复杂过程中，在时空及表达量上都作为统一的整体进行调节。在疾病的发生发展的各个环节和阶段中，往往都具有基因群的改变。利用基因芯片技术同时检测这些相关基因的表达变化，对于疾病的控制、更有效的治疗、改善预后具有重大意义。4.4 基因芯片技术对血液病中多药耐药基因的表达检测 血液系统恶性肿瘤目前治疗的主要手段仍是化疗，而对化疗药物的耐药是白血病治疗失败的重要原因。耐药机制相当复杂，由肿瘤的综合特征决定，如存活细胞的比例，多药耐药表型，MDR1、MRP、LRP等基因的过度表达，拓扑异构酶和谷胱甘肽代谢的改变等，另外促进DNA修复和抑制细胞凋亡的基因表达改变也可导致多药耐药。用基因芯片可同时对众多基因进行检测，有助于发现新的耐药基因，寻找药物及时进行耐药基因的逆转，提高白血病复发患者的疗效。顾春红等22应用基因表达谱芯片，研究硫化砷作用前后K562细胞基因的表达变化，CML细胞株K562经硫化砷作用前后，mRNA分别用Cye3、Cye5来标记，与芯片杂交的结果，红色表示高表达，绿色表示低表达，黄色表示表达水平无改变。经上述筛选标准处理后得出，K562细胞在硫化砷处理前后共有ll条基因表达有显著改变，其中表达上调的有7条，表达下调的有4条。周期素G2的表达上调和周期素E2的表达下调尤应引起重视，G2作用机理可能是蛋白质的氨基酸末端与P27或相应的CDKIS作用，激活CDKIS活性，或促使其他CyclinCDKS复合物解体，使细胞周期受到阻滞。而周期紊E2是促进细胞从Gl期向S期的进程，G2的上调和E2的下调共同作用，使细胞周期受到阻滞，进而引起凋亡，为硫化砷的抗白血病机制提供了有力的线索。5. 总结与展望目前，基因芯片技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。另外基因芯片在农业、食品监督、环境保护、司法鉴定等方面都将作出重大贡献。基因芯片的飞速发展引起世界各国的广泛关注和重视。鉴于基因芯片的巨大潜力和诱人的前景，基因芯片已成为各国学术界和工业界研究和开发的热点。随着现代微加工技术的进步和纳米技术的发展，生物芯片在容纳更多信息的同时日趋微型化和价格普及化，其在疾病诊断和药物筛选等方面的应用前景将更加广阔。基因芯片的深入研究和广泛应用，将对21世纪人类生活和健康产生极其深远的影响。参考文献：1Ramsay G.DNAchips:state-of-theartJ.Nat Biotechnol,1998,16(1):40-44.2梁国栋,主编.最新分子生物学实验技术M.北京:科学出版社.2001.336-3373Hacia JG,Brody LC,Chee MS.et a1.Detection of heterozygous mutations in BBCAI using high density oligonucleotide arrays and two-colour lurescence aoalysisJ.Nature genetics supplement.1999,21:42-47.4颜子颖,王海林,译.精编分子生物学实验指南M. 北京:科学出版社,1998:186-189.5Chee M,Yang R,Hubbell E,et a1.Accessing genetic information with high density DNA arayJ. 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