培养基性能测试指南.doc

惠山疾控作 业 指 导 书编号：HSCDC/ZN-06-2009 培养基性能测试指南版本 / 修改次：1/0第 1 页 共 4 页 1. 目的规范本中心微生物实验室对培养基性能测试的方法。2. 适用范围本指南适用于固体和液体培养基的性能测试方法。3. 职责3.1 检验人员：按照本指南规定的方法对培养基性能进行测试。3.2 科室负责人：负责指导、监督检验人员对培养基性能进行测试。4.培养基性能测试方法4.1概述通常使用半定量和定性测试方法就能满足实验室对培养基性能测试的要求；评价新的培养基或新的供应商的产品时，应采用定量方法。本指南中所提到的接种环是直径为3mm的接种环。4.2测试菌株4.2.1工作菌株的使用及管理工作菌株的使用及管理详见作业指导书菌种管理工作指南HSCDC/ZN-05-2009。4.2.2 工作菌株的制备工作菌株是将标准储备菌株接种到非选择性肉汤（如营养肉汤）中所制备的处于稳定生长期的纯菌株。4.2.2.1 工作菌株定量菌液的制备4.2.2.1.1标准储备菌株接种到营养肉汤中培养1824小时，用生理盐水配成0.5麦氏单位，再用生理盐水稀释至实验所需的稀释度。4.2.2.1.2 0.5麦氏比浊管对应的菌液浓度约为108/mL，以下是几种常用细菌的比浊标准（0.5麦氏单位）。肺炎双球菌3108/mL痢疾志贺氏菌8108/mL大肠埃希氏菌8108/mL福氏志贺氏菌8108/mL铜绿假单胞菌10108/mL宋内氏志贺氏菌8108/mL甲型副伤寒沙门氏菌10108/mL甲型溶血性链球菌2108/mL乙型副伤寒沙门氏菌10108/mL霍乱弧菌18108/mL伤寒沙门氏菌10108/mLEL-Tor O1群霍乱弧菌18108/mL4.2.2.2 麦氏比浊管4.2.2.2.1 0.5麦氏比浊管的配制0.5mL BaCl2（1.175%,w/v）99.5mL H2SO4（1%,v/v）充分混匀后，每管分装46ml,封口后置室温暗处保存。也可购买使用麦氏标准比浊管。4.2.2.2.2 0.5麦氏比浊管的校准用光径为1cm比色杯在分光光度计上以波长625nm处测其吸光度，0.5个麦氏单位的比浊管吸光度在0.080.1之间为合格。4.2.2.2.3 麦氏比浊管的使用（1）使用前，将比浊管摇匀，目测其外观浊度应均匀一致。若有大颗粒出现，此标准管应更换。每月需更换比浊管或复验比浊管的浊度。（2）无菌操作将待用的肉汤培养物加到与标准管相同直径（大小）的无菌试管中。（3）以无菌操作向被测定试管加入无菌生理盐水（NaCl），直到浓度与所要求的麦氏惠山疾控作 业 指 导 书编号：HSCDC/ZN-06-2009培养基性能测试指南版本 / 修改次：1/0第 2 页 共 4 页 比浊管的浓度相同（找张白纸，打上平行直线，然后观察比较两管的浊度）。 4.2.2.3生长率测试用工作菌株目标菌的定量、半定量和生长率试验常用每平板（或每试管）的接种水平为10CFU100CFU。4.2.2.4选择性测试用工作菌株培养基选择性试验是将浓度为104CFU/mL106CFU/mL的非目标菌工作菌株悬浮液接种到平板或试管上。4.2.2.5培养条件按相关标准或要求规定的条件对接种后的培养基进行培养。4.3固体培养基测试方法4.3.1定量测试方法（Miles-Misra法）4.3.1.1按4.2.2 的方法制备工作菌株菌液。4.3.1.2测试平板和参照平板划分为4个区域并标记（也可不划分四个区域）。4.3.1.3从最高稀释度开始 ，分别滴一滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域4.3.1.4将稀释液用L-玻璃棒涂满整个1/4区域，按标准规定的培养条件培养平板。4.3.1.5对易计数的区域计数，按公式计算结果PR和SF生长率PR的计算： PR = NS/NONS：从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数。N0：从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应100cfu ）。选择因子SF的计算： SF = DO - DSDO：能在参考培养基上生长至少10个菌落的最高稀释度。DS：能在测试培养基上显示生长的最高稀释度。非选择性培养培养基上目标菌的生长率最低应为0.7; 选择性培养培养基上目标菌的生长率最低应为0.1；非目标菌在选择性培养培养基上的SF 至少为2。4.3.2半定量测试方法（改进的平板划线法）该方法适用于固体和液体培养基的性能测试，但仅能作为固体培养基的补充测试。4.3.2.1按4.2.2 的方法制备工作菌株菌液。4.3.2.2用3mm接种环按图1划线平板，A、B、C部分用接种环按0.5cm的间隔各划4条平行线，最后在D区内划一条连续的曲线。划线时可将模板放在平板下面。4.3.2.3按标准规定的培养条件培养平板。4.3.2.4计算生长指数G ：每条有菌落生长的划线记作1分。每个仅一半的线有菌落生长记作0.5分。没有菌落生长或生长量少于划线的一半，则记作0分。 图1 改进的平板划线法接种模式图惠山疾控作 业 指 导 书编号：HSCDC/ZN-06-2009培养基性能测试指南版本 / 修改次：1/0第 3 页 共 4 页 4.3.2.5结果解释目标菌的生长指数G值大于6时，培养基可接收。非选择性培养基的G值通常较高。 目标菌在培养基上应呈现典型的生长，而非目标菌的生长应部分或完全被抑制 4.3.3 定性测试方法（平板接种观察法）作为固体培养基性能测试的补充4.3.3.1按4.2.2 的方法制备工作菌株菌液。4.3.3.2用3mm接种环取测试菌培养物，在测试培养基表面划平行直线。可同时在一个平板上接种多个菌株，但划线不能交叉。4.3.3.3按标准规定的培养条件培养平板。4.3.3.4 结果解释培养后按以下方法计分：0表示无生长;1表示微弱生长;2表示生长良好。目标菌得分应为2，并有典型的菌落外观、大小和形态。非目标菌的生长应部分或全部被抑制。4.4液体培养基测试方法4.4.1定量测试方法4.4.1.1测试步骤4.4.1.1.1按4.2.2 的方法制备工作菌株菌液。4.4.1.1.2从每批液体培养基中选择适当数量的试管或每份10mL的培养基进行测试。4.4.1.1.3接种目标菌：按每管10CFU100CFU接种测试肉汤和参考肉汤，混匀。4.4.1.1.4接种非目标菌：按每管大于1000CFU接种测试肉汤和参考肉汤，混匀。4.4.1.1.5接种目标菌和非目标菌混合培养物：目标菌按每管10CFU100CFU接种于测试肉汤和参考肉汤，同时在每个试管中接种大于1000CFU的非目标菌，混匀。4.4.1.1.6按标准规定的培养条件对接种后的试管进行培养。4.4.1.1.7培养后，从每一种肉汤中移取一定量的菌液，必要时按4.2.2.1稀释至所需的稀释度，按4.3.1定量测试方法（Miles-Misra法）涂布于非抑制性琼脂平板上，按标准规定的培养条件对平板培养后进行计算。4.4.1.1.8稀释液和运输培养基：按每管100CFU1000CFU接种测试菌，混匀。稀释液在室温下放置45min后进行平板计数；运输培养基按常规培养时间和温度对接种后的试管进行培养，然后进行平板计数。注：检测混合菌时，应在能够鉴别这些菌株的非选择性平板上涂布接种，当非选择性琼脂平板不能鉴别出混合菌时，应使用经性能测试合格的选择性琼脂培养基。4.4.1.2结果解释培养后，对目标菌和非目标菌进行计数，以区分不同的培养基。并根据不同的测试目的，进行计算和解释。4.4.1.2.1 按PR和SF值对参考肉汤和测试肉汤进行比较和解释。目标菌的PR值不应小于0.1（测试培养基与参考培养基菌落总数的差别不超过一个数量级）；非目标菌的SF值至少应达到2；混合菌中，目标菌株的生长不应收到非目标菌生长的抑制，即目标菌始终应为优势菌。4.4.1.2.2在混合菌中目标菌数量的最低值及非目标菌的最高值应符合以下要求：目标菌的最低浓度应达到106CFU/mL108CFU/mL；惠山疾控作 业 指 导 书编号：HSCDC/ZN-06-2009培养基性能测试指南版本 / 修改次：1/0第 4 页 共 4 页 在非选择性肉汤培养物中非目标菌的最高浓度不应低于104CFU/mL。4.4.1.2.3稀释剂和运输培养基不应引起目标菌和非目标菌数量太大的变化。微生物在这些培养基中培养后的数量变化应在最初计数的50%的范围内。4.4.2半定量测试方法4.4.2.1测试步骤4.4.2.1.1按4.2.2 的方法制备工作菌株菌液。4.4.2.1.2从每批液体培养基中选择适当数量的试管或每份10mL的培养基进行测试。4.4.2.1.3接种目标菌和非目标菌混合培养物：目标菌按每管10CFU100CFU接种于测试肉汤，同时在每管中接种大于1000CFU的非目标菌，混匀。4.4.2.1.4接种非目标菌：按每管大于1000CFU接种测试肉汤，混匀。4.4.2.1.5按标准规定的培养条件对接种后的试管进行培养。4.4.2.1.6 用3mm接种环取一环混合菌培养液划线接种到特定目标菌选择性平板上。4.4.2.1.7用3mm接种环取一环非目标菌培养液划线接种到非选择性平板（如TSA）上。4.4.2.1.8 将两个平板按标准要求培养。4.4.2.2结果解释选择性平板上有至少10个目标菌菌落生长，则表示液体测试肉汤的生长率为良好。非选择性平板上没有菌落生长（或者10CFU），则表示液体测试肉汤的选择性为良好。4.4.3定性测试方法单管定性法适用于液体培养培养基的性能测试。该项测试不能用于四硫磺酸盐肉汤等混浊培养基。4.4.3.1测试步骤4.4.3.1.1用3mm接种环取一环工作菌株培养物直接接种到用于性能测试的液体培养基中。4.4.3.1.2按标准规定的培养条件对接种后的试管进行培养。4.4.3.2结果解释用目测的浊度值（如02）评价培养基。0表示无混浊；1表示很轻微的混浊；2表示严重的混浊。目标菌的浊度值应为2。注：如果微生物生长后聚集成细胞团，沉积在试管底部