海带多糖的含量测定方法正确性研究.doc

海带多糖的含量测定方法正确性研究作者：张忠山，张全斌，王晶，李智恩，徐祖洪【摘要】 目的探索正确测定海带多糖含量的方法。方法采用苯酚-硫酸法，按照不同糖溶液配制标准液在485 nm处测定多糖含量。结果按照多糖中褐藻糖与半乳糖比例为标准测得多糖含量为60.42%，介于两种组成单糖测定结果之间。结论按照多糖中单糖组成比例为标准测定多糖含量具有可比性，可用于海带多糖含量测定。 【关键词】 海带 多糖 苯酚 硫酸法Abstract：ObjectiveTo determine the content of polysaccharides in Laminaria japonica . MethodsWe used the method of vitrilic colorimetry, and detection wavelength was 485 nm.ResultsThe content of polysaccharides with the method which was according to the composing sugars was 60.42%. Conclusion This method can be used to determine the content of polysaccharides in Laminaria japonica.Key words：Laminaria japonica; Polysaccharides ; Phenol-vitriolic colorimetry 海带Laminaria japonica，又名纶布、昆布、江白菜，是多年生大型食用藻类。藻体为长条扁平叶状体，褐绿色，有两条纵沟贯穿于叶片中部，形成中部带，一般长1.53 m，宽1525 cm，最长者可达6 m，宽可达50 cm 。海带生于海边低潮线下2 m 深度的岩石上，人工养殖生长在绳索或竹材上，是我国、日本、朝鲜等东方人喜欢食用的经济藻类。我国海带养殖已发展成大规模产业，从辽宁一直到广东沿海，产量约占世界海藻的50，居世界第1位。海带成本低廉，功能众多，在有益物质提取和食品加工中作用明显，市场潜力很大1。 海带富含多种功能性成分，如碘、甘露醇、维生素A、维生素B、维生素C、牛磺酸、海带多糖等，其食用和药用价值很早即为世人所关注2。研究表明，海带对外界恶劣环境所表现出来的抗逆耐受能力与它们所含的海带多糖有直接关系，海带多糖还具有稳定细胞膜和蛋白质结构的功能。海带多糖在医药、食品、化妆品、农业等方面也具有广阔的应用前景3。我国在对海带多糖的研究中所用的实验材料多是粗制品，缺乏纯化和组成鉴定过程，对海带的利用也局限于提取褐藻酸、甘露醇等。许多文献中，测定海带多糖时用葡萄糖或其组成的主要单褐藻糖作标准溶液，造成结果与真实值相差太大。本文采用水提醇沉的方法对海带多糖的进行提取、纯化，并采用按照组成样品的单糖比例配制标准液的测定方法对其多糖含量进行测定，对几种测定方法进行比较和准确性评价。1 材料与仪器 海带采自青岛沙子口，经鉴定为 Laminaria japonica；95乙醇、浓硫酸、六水合氯化镁、氢氧化钠、三氟乙酸、盐酸羟胺等均为国产分析纯；5%苯酚（现配）；L褐藻糖（Sigma公司）；D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-果糖、葡萄糖、蔗糖等均购自于上海试剂二厂；肌醇（无锡默克尔精细化学品有限公司）。高压锅（山东新华医疗器械股份有限公司）；FA1004电子天平（上海天平仪器厂）；722型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；瑞士BCHI R114型旋转蒸发仪；东京理化EYELA FD5N型真空冷冻干燥机；电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；TDL40B离心机（上海飞鸽系列离心机厂）；HP5890 气相色谱仪（美国惠普公司），氢火焰离子化检测器（FID）。2 方法与结果2.1 海带多糖样品的制备采用水提醇沉法提取纯化海带多糖样品（自制）。2.2 样品组成单糖的确定2.2.1 气相色谱条件SGE AC225 2.5 mm30 m弹性石英毛细管柱；柱温215 ；进样口温度250 ；检测器温度250 ；分流比1001；高纯氮气为载气，流速1 ml/min。2.2.2 标准糖样衍生物的制备分别称取46 mg的L-褐藻糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、葡萄糖、L-鼠李糖以及1 mg的肌醇置1 ml的离心管中，加入10 mg盐酸羟胺和0.5 ml的吡啶，在90 水浴中加热反应30 min，并不时振荡。取出后冷却至室温，加入0.8 ml的乙酸酐，于90水浴中继续进行乙酰化反应30 min，并不时振荡，冷却后即得适于气相色谱分析的标准单糖衍生物4。2.2.3 样品水解称取多糖样品各1份，分别置于10 ml水解管中，加10 ml 2 mol/L的三氟乙酸 (TFA)溶液溶解，封管，100 水浴中水解4 h,减压浓缩至干。2.2.4 组成样品单糖的确定根据色谱图，确定组成样品的单糖为:鼠李糖、褐藻糖 、阿拉伯糖 、木糖 、甘露糖、葡萄糖 、半乳糖，但褐藻糖和半乳糖含量远多于其它几种单糖，两者含量比例为1.831。结果见图12。2.3 多糖含量测定2.3.1 标准曲线的绘制准确称取葡萄糖、L-褐藻糖和D-半乳糖各50 mg，分别溶于容量瓶中配成100 ml溶液。按褐藻糖与半乳糖比例1.83:1，从两个标准溶液中各取64.66 ml和35.34 ml形成混合溶液为标准液。 分别精密吸取葡萄糖标准溶液、褐藻糖标准溶液、半乳糖标准液和混合标准溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml置于具塞试管中，加水使每管总体积为2.0 ml，然后分别加入5苯酚液1.0 ml，混合均匀后快速加入95浓硫酸5 ml,室温放置30 min，在485 nm下测定吸光度。以蒸馏水试管为空白对照，绘制吸光度与浓度标准曲线。其相应标准曲线见图3。2.3.2 样品含量测定准确称取干燥至恒重的样品100 mg，置于100 ml容量瓶中，加水至刻度。吸取样品溶液0.15 ml置于具塞试管中，然后按照标准曲线制作的步骤，测得样品吸光度，根据上述4种标准曲线计算糖含量。经计算，样品含量分别为30.17，72.95，43.51，60.42。2.3.3 方法正确性验证已知蔗糖组成的单糖比例为葡萄糖:果糖11,从已经配好的葡萄糖和果糖两个标准液中各取相同适量配成混合标准液。按照上述比色条件分别以葡萄糖、果糖和混合标准液做标准曲线测定多糖含量，得到其含量分别为114.37，83.64和100.65。由此证明按照组成多糖的单糖比例作标准液测定含量具有一定的准确性。3 讨论 由图3可知，同一样品用不同的标准溶液所作的标准曲线是不重合的，由此测得含量值是不同的。从图中标准曲线看出，混合液的标准曲线的斜率位于组成两种单糖的斜率之间。对杂多糖而言，测定值总是与真实值有差别，但对于未知确切组成比例的样品，可用主要组成单糖为标准；若知道其确切比例，就可以用混合液作标准。实际测定时，根据所选取的标准溶液做的标准曲线的斜率偏差，选取适当的方法作为测定方法可得到近似结果。 海带多糖为杂多糖，