发根农杆菌k599侵染黄瓜形成转基因毛状根的初步研究及orf14基因的克隆.pdf

m a s t e rd i s s e r t a t l 0 n p r e l i m i n a r ya n a l y s i so nt r a n s g e n e i ch a i r yr o o ti n d u c e d f r o mc u c um b e r b ya g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e sk 5 9 9 a n d c l o n i n go fo r f l 4g e n e b yc a o q i n g f e n g s u p e r v i s o rp r o f x i a n gt a i h e c o l l e g eo fl i f ea n de n v i r o n m e n ts c i e n c e s h a n g z h o un o r m a lu n i v e r s i t y h a n g z h o u c h i n a 0 i l lilllll ul u l l ll l l l l l l l l l l l i l l l l l l y 2 13 2 0 8 2 生塞淦塞题旦 发褪盛盘菌k 量窆窆堡鎏黄丛坦盛莹基旦 垂达褪鲍塑生盈究及坌丝望基因煎直隆 论文作者签名 指导教师签名 论文评阅人1 评阅人2 评阅人3 评阅人4 评阅人5 答辩委员会主席 委员1 委员2 委员3 委员4 委员5 答辩日期 杭州师范大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果 也不包含为获得杭州垣菹太堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 签字日期 年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解楦划堙菹太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 本人授权杭捌垭菹太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播 可以采用影 印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 导师签名 签字日期 年月 日签字日期 年 月 型竖塑型塑一 鍪塑 一 一 q 致谢 时光如驹 三年的研究生生活已近尾声 在学业即将完成之际 特借此机会向 三年来给予我关心和帮助的每一位老师和同学表示深深的感谢 首先 我要衷心感谢我的指导老师向太和教授 本论文是在向老师的悉心指导 和大力支持下完成的 无论是在论文的选题 构思和资料的收集方面 还是在论文 的研究方法以及成文定稿方面 都得到了向老师耐心细致的指导和无私的帮助 特 别是他广博的学识 深厚的学术素养 严谨的治学态度和一丝不苟的工作作风使我 受益终生 不止在科研学习中 在生活上 向老师也给了我很多建议和指导 为我 今后的人生指明了方向 祝愿向老师在学术领域取得更大的成就 培育更多的人才 同时 我要感谢王利琳教授 王慧中教授 庞基良教授 沈波教授 金孝峰副 教授等在专业课学习上对我的指导 感谢俞美琴老师 任山章老师等在研究生事务 上给予我的的关心和照顾 感谢张道祥 孟莎莎 李佩菡 杜苏瑞 王沙沙等同门 在实验和生活上对我的帮助 感谢沈少华 徐京 周国艳 贾飞飞 陈博 王珍华 李颖 鲍林文等同学在我遇到困难时给予我的帮助 是你们的存在才使我的研究生 生活如此美好 感谢室友阳广凤 王鸿杰 周硕在生活点滴中带给我的快乐与感动 谢谢你们 让我在杭师大度过了忙碌而又幸福的三年 感谢父母这些年来对我的学业和生活上的支持 感谢他们对我的宽容 感谢兄 弟姐妹们对我的关心照顾 祝福所有人健康快乐 曹庆丰 2 0 1 2 年5 月2 2 日 原书空白页 不缺内容 杭州师范大学硕士学位论文 摘要 摘要 发根农杆菌 a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s 侵染植物外植体能诱导产生转基因毛 状根 h a i r yr o o t 获得的毛状根起源于单细胞而无嵌合体 并能在无植物激素的 培养基上自主性快速生长 毛状根可直接作为植物根部线虫等病虫害的宿主 还可 应用于环境修复 也可以作为生物反应器 用于生产外源基因表达的蛋白产物和药 用植物的活性成分 毛状根是发根农杆菌r i 质粒中的t d n a 插入 整合到植物细 胞基因组中表达的结果 转基因植物中外源基因的稳定遗传和高效表达是毛状根具 有利用价值的前提条件 本研究利用发根农杆菌k 5 9 9 侵染黄瓜不同外植体获得毛状根 对t d n a 在毛 状根中整合的完整性进行了分析 并对长期培养的毛状根中外源基因的稳定性及其 表达进行了分析 此外 从发根农杆菌k 5 9 9 中克隆了其t d n a 上的o f f l 4 基因 构建了p r l l 0 1 一a n o r f l 4 g 币植物表达载体 d 4 基因与g f p 形成融合蛋白 便于 o f 1 4 基因功能的分析 主要研究结果如下 1 利用发根农杆菌k 5 9 9 属于黄瓜碱型 带内生质粒p r i 2 6 5 9 和外源质粒 p r i l 0 1 一a n g f p 侵染黄瓜不同外植体 其中活体下胚轴和上胚轴的生根效率最高 诱导率均达到了1 0 0 同时获得了较细 分枝多 生长快 i 型 粗壮 分枝少 生长较慢 i i 型 两种不同形态的毛状根 本研究建立了一种快捷 高效的毛状根诱 导方法 而且为毛状根发生的分子机理的研究以及t d n a 整合规律与毛状根形态 相关性的研究提供了材料 2 对3 0 个独立培养的毛状根根系 进行了p c r 检测 分析了t d n a 在毛状 根中整合的完整性 内生质粒p r i 2 6 5 9t d n a 上的11 个基因d 啦 d 帕 d 矽 d 卯 r o m r o l b r o l c r o l d r o l e o f f l 4 c i i s 以及外源质粒p r l l 0 1 一a n g f pt d n a 上 的外源基因g f p 都插入整合到了植物基因组中 初步分析了发根农杆菌k 5 9 9 介导 的转基因过程中t d n a 插入的完整性 3 对固体培养基上培养3y 的黄瓜转g y p 基因毛状根进行分析 由组成型启动 子3 5 s 驱动的脚基因在转录水平上能正常表达 而且能够翻译出编码蛋白 此外 培养3y 后的毛状根 能扩增出与毛状根形态构成有关的r o l 系列基因 本研究结 杭州师范大学硕士学位论文 摘要 果表明长期培养的毛状根能保持其遗传稳定性 这为利用毛状根长期工厂化生产外 源基因表达的蛋白产物和药用植物的活性成分提供了理论依据 4 从发根农杆菌k 5 9 9 成功克隆了其t d n a 上的o r f l 4 基因 并构建了 p r l l 0 1 a n o r f l 4 g f p 植物表达载体 其中o r f l 4 能与g f p 形成融合蛋白 这为进 一步分析o r f l 4 基因及功能提供了基础 关键词 黄瓜 发根农杆菌k 5 9 9 t d n a 毛状根 长期培养 i v 杭州师范大学硕士学位论文a b s t r a c t ab s t r a c t a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s w h i c hi n f e c t e de x ph n t sa n di n d u c e dh a i r yr o o t sa tt h e s i t eo fp l a n tw o u n d h a i r yr o o t sd e r i v e df r o ms i n g l e c l o n e sa n dc a np r o p a g a t er a p i d l y p l a n td i s e a s e sa n di n s e c t s s u c ha sr o o t k n o tn e m a t o d ec a nh o s ti nh a i r yr o o t sf o r p m p a g a t i o r th a k yr o o t sc o u l db eu s e f u li np h o t y r e m e d a t i o n h a k yr o o t sa l s oc a nb e u s e da sab i o r e a c t o rf o rt h ep r o d u c t i o no f b o t he x o g e n o u sp r o t e i n sa n da c t i v ei n g r e d i e n t s o fm e d i c i n a lp l a n t s t d n a r e g i o ni si n t e g r a t e di n t ot h ep l a n tg e n o m et oc a u s eh a 时r o o t d i s e a s e t h eu t i l i z i n gv a l u eo f t h et r a n s g e n i ch a i r yr o o t sd e p e n d so nt h es t a b i l i t ya n dt h e h i g h e f f i c i e n c ye x p r e s s i o no f t h ee x o g e n o u sg e n e i nt h i ss t u d y w ea n a l y z et h ei n t e g r a l i t yo ft d n ai nh a k yr o o t sw h i c hw e r ei n d u c e d f r o md i f f e r e n te x p l a n t sb ya g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e sk 5 9 9 i d e n t i f i c a t i o nt h ee x o g e n o u s g e n e sw e r es t a b l ya n dh i g h l ye x p r e s s e di nl o n g t e r m 3 y e a r o l d c u c u m b e rt r a n s g e n i c h a i r yr o o t s t h eo r f l 4 i nt d n aw a sc l o n e da n dap l a n t e x p r e s s i o n v e c t o r p r l l 0 1 a n o r f l 4 g f pw a sc o n s t r u c t e dw h i c h c a ne x p r e s st h ef u s i o np r o t e i no fo r f l 4 a n dg f et h er e s u l t sa sf ol l o w s 1 c o m p a r i s o no f t h ef r e q u e n c yo f h a i r yr o o t sf o r m a t i o ni nt h ec u c u m b e rd i f 凳r e n t e x p l a n t si n o c u l a t e d w i t h w i l d t y p ea g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s k 5 9 9 h a r b o r i n g p r l l 0 1 a n g f p h a i r yr o o t s i n d u c e df r o mh y p o c o t y l sa n de p i c o t y l sw i t hah i g h f r e q u e n c yo f10 0 t w ot y p e so fh a i r yr o o t sw e r eo b t a i n e d t h a t i st y p e i h i g h l y b r a n c h e da n df a s t g r o w i n gf m er o o t sa n dt y p e i i l o wb r a n c h e da n ds b w g r o w i n gt h i c k r o o t s ac o n v e n i e n ta n dh i g h e f f i c i e n c ym e t h o df o rh a i r yr o o t si n d u c t i o nw a se s t a b l i s h e d t h er e s u l t sl a yf o u n d a t i o nf o rs t u d y i n gt d n ai n t e g r a t i o nr e l a t e dw i t hh a i r yr o o t s m o r p h o l o g ya n dd e v e l o p i n gr m c h a n i s m o f h a i r y r o o t s 2 t h i r t yi n d e p e n d e n t e dc u l t u r eh a i r yr o o t si n d i v i d u a lw e r ea n a l y s e db yp c r b o t h t h et d n ai n n e rg e n ei n c l u d e dd 妮 o r f 3 o f f 4 叨留 r o l a r o l b r o l c r o l l r o l e o r f l 4 c i i sa n dt h ee x o g e n o u sg f pw e r ei n t e g r a t e d i n t ot h ep l a n tg e n o m e t h er e s u l t s h o w e dt h a ta l lg e n e si nt h et d n a c a ni n t e g r a t e di n t oh a i r yr o o t s 3 w ei n v e s t i g a t e dt h eg e n e t i cs t a b i l i t yo f 酢一t r a n s g e n ei nt h eh a i r yr o o t st h a th a d v b e e nc u l t u r e do ns o l i dm e d i u mf o r3y e a r s t h ee x p r e s s i o no f g f pt h a tw a sd r i v e nb yt h e c o n s t i t u t i v ep r o m o t e r3 5 sw a sr e l a t i v e l yn o r m a la tb o t hm r n aa n dp r o t e i n l e v e l s f u r t h e r m o r e t h eh a i r yr o o t s a f t e r3 y e a rc u l t u r i n gw e r e s t i l la b l et o e x p r e s st h e m o r p h o l o g y r e l a t e dr o lg e n e s o v e r a l l t h i ss t u d yp r o v i d e di m p o r t a n tl a b o r a t o r ys u p p o r t s f o ru s i n gh a i r yr o o t si nt h el o n g t e r mi n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fp r o t e i n s a n da c t i v e i n g r e d i e n t so f m e d i c a lp l a n t s 4 t h eo r f l4g e n ew a ss u c c e s s f u l l yc l o n e df r o ma g r o b a c t e r i u mr hi z o g e n e sk 5 9 9b y p c rm e t h o d ap h n te x p r e s s i o nv e c t o ro f p r i l 0 1 a n o r f l 4 一g 币w a sc o n s t r u c t e d w h i c h c a ne x p r e s sg f pf u s i o np r o t e i n i ti sh e l p f u lt oa n a n l y zt h ef u n c t i o no fo r f l 4 k e yw or d s c u c u m b e r a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s t d n a h a i r yr o o t s l o n g t e r m p r o p a g a t i o n v i 杭州师范大学硕士学位论文目次 目次 致谢 i 摘 要 一i a b s t r a c t v 目 次 v i i 第一章文献综述 1 1 发根农杆菌与毛状根 1 1 发根农杆菌的生物学特性与分类 1 2r i 质粒的结构 功能及毛状根诱导的分子机理 2 3 发根农杆菌的转基因策略 5 1 4 发根农杆菌的转基因方法 7 1 5 转基因毛状根的培养与繁殖 8 1 6 转基因毛状根及再生植株的鉴定 9 1 7 发根农杆菌介导转基因毛状根诱导的影响因素 i o 8 毛状根的应用 1 2 2 本论文课题的提出 1 5 第二章发根农杆菌k 5 9 9 侵染黄瓜不同外植体产生毛状根的研究 1 7 1 材料与试剂 7 2 实验方法 1 7 2 发根农杆菌k 5 9 9 侵染离体子叶 上胚轴 下胚轴诱导生根 1 7 2 2 发根农杆菌k 5 9 9 侵染活体子叶 上胚轴 下胚轴诱导生根 1 9 2 3 转基因毛状根的荧光观察 9 2 4 转基因毛状根的分子检测 1 9 3 结果与分析 2 l 3 1 发根农杆菌k 5 9 9 侵染黄瓜不同外植体及毛状根的产生 2 l 3 2 转基因毛状根的荧光观察与分子鉴定 2 3 4 讨论 2 5 第三章黄瓜转基因毛状根中t d n a 插入整合完整性的初步分析 2 7 l 材料与试剂 2 7 2 实验方法 2 7 2 1 引物设计 2 7 2 2 转基因毛状根基因组d n a 提取 2 8 2 3 转基因毛状根的分子检测 2 8 l 杭州师范大学硕士学位论文目次 3 实验结果 2 9 3 1 除菌分析 2 9 3 2t d n a 整合完整性分析 3 0 4j 寸论 3 2 第四章长期培养的黄瓜毛状根中外源基因遗传稳定性的分析 3 3 1 材料与试剂 3 3 2 实验方法 3 4 2 1 毛状根的继代培养 3 4 2 2 咖基因和r o l r o o tl o c i 位点系列基因的p c r 扩增 3 4 2 3 加基因的荧光定量p c r 分析 3 5 2 4w e s t e r nb l o t 杂交以及荧光观察 3 5 3 实验结果 3 6 3 1 长期培养的毛状根中诉基因和r d 系列基因p c r 扩增结果 3 6 3 2 长期培养的毛状根中g f p 基因的表达结果 3 6 4 讨论 3 8 第五章发根农杆菌k 5 9 9o f f l 4 基因的克隆 4 0 1 材料与试剂 4 0 2 实验方法 4 0 2 1o f f l 4 基因的克隆 4 0 2 2 植物转基因表达载体p r l l 0 1 a n o r f l 4 g 币的构建 4 4 3 实验结果 一4 7 3 1o f f l 4 基因的克隆和测序分析 4 7 3 2 植物转基因表达载体p 1 0 1 a n o r f l 4 g 争的构建 4 8 4 讨论 4 9 参考文献 5 0 附录一英文缩写 5 7 附录二常用培养基和抗生素配制方法 5 8 作者简介 6 0 l i 杭州师范大学硕士学位论文 文献综述 发根农杆菌与毛状根 第一章文献综述 发根农杆菌似 r h i z o g e n e s 和根癌农杆菌似 t u m e f a c i e n s 慝 属于根瘤菌科 均为 革兰氏阴性细菌 它们都可以侵染植物细胞 但引起不同的病症 根癌农杆菌侵染 植物细胞后诱导冠瘿瘤及合成冠瘿碱 故称为瘤诱导t i 质粒 t u m o ri n d u c i n g p l a s m i d 发根农杆菌侵染植物细胞会产生许多不定根 这种不定根生长迅速 呈 发状 故称为发状根或毛状 根 h a i r yr o o t r i 质粒为根诱导质粒 r o o ti n d u c i n g p l a s m i d 与t i 质粒相比 r i 质粒转化具有很多优点 1 r i 质粒可以不经 解除武 装 d i s a r m e d 进行转化 并且转化产生的毛状根能够再生植株 2 毛状根是一个 单细胞克隆 可以避免嵌合体 3 可直接作为中间载体 4 r i 质粒和t i 质粒可 以配合使用 建立双元载体 拓展了两类质粒在植物基因工程中的应用范围 5 毛 状根适用于进行离体培养 而且很多植物的毛状根在离体培养条件下都表现出原植 株次生代谢产物的合成能力 因此 r i 质粒不仅可以作为转化的优良载体 而且可 应用于有价值的次生代谢产物的生产 1 1 发根农杆菌的生物学特性与分类 发根农杆菌属于根瘤菌科 r h i z o b i a c e a s e 农杆菌属 也称土壤杆菌属 4 9 r o b a c t e r u i m 和根瘤菌属 r h i z o b i u m 的革兰氏阴性细菌 主要生活在土壤中 好 氧 但也能生长在低氧的植物组织中 最适温度2 5 3 0 c p h 生长范围4 3 1 2 0 最适p h 范围6 0 9 0 农杆菌细胞呈杆状 o 8 x 1 5 3 0l a m 以1 4 根周生鞭毛进行 运动 如果鞭毛仅为1 根 则侧生更为常见 常有纤毛 不形成芽孢 菌落无色素 随着菌龄的增加 光滑的菌落逐渐变成有条纹 也有一些菌落呈粗糙型 发根农杆菌含有致病质粒r i 质粒 它能够侵染大多数的双子叶植物和少数单子 叶植物形成转基因毛状根 据统计 目前已有数百种植物感染发根农杆菌之后能够 产生毛状根 不同类型发根农杆菌含有不同的r i 质粒 其侵染植物后合成不同的冠 瘿碱 据此可以将发根农杆菌分为四种类型 即 农杆碱型 a 印p i mt y p e 甘露碱 杭州师范大学硕士学位论文文献综述 型 t m n n o p i n et y p e 黄瓜碱型 c u c u m o p i n e t y p e 异黄瓜碱 m i k i m o p i n e t y p e k i y a k a w as 等 1 9 9 4 农杆碱型发根农杆菌r i 质粒含有两个t d n a n t l d n a n 1 5 2 0 k b 和t r d n a 两区域之间为一个非插入的d n a 区 图1 1 其他三种类 型的r 颁粒为连续的t d n a 本研究所使用的菌种为发根农杆菌k 5 9 9 属于黄瓜碱型 图1 2 黄瓜碱型r i 质粒只有单一的t d n a 区 其特点为 1 t d n a 结构虽然简单但含有生物碱合成 基因 能够为农杆菌的生长提供能源 维持和宿主的共生关系 2 不含有生长素 合成基n a u x 基因 排除了生长素的存在对生根的影响 3 t d n a 上含有与生根 相关的加 系列等11 个基因 结构简单 便于研究 t o d n at r d n a 图1 1 农杆碱型i 颂粒t d n a 结构 f i 9 1 1 m es t r u c t u r eo ft d n ao fa g r o p i n et y p e 卜 一l 黜 叫 o 1 2 o f f 3 甜绍阳姨 婚阳kr o t d 琏鞭釉 瓴络 图1 2 黄瓜碱型发根农杆菌k 5 9 9r i 质粒t d n a 结构 f i g l 2t h es t r u c t u r eo ft d n ao fc u c u m o p i n et y p ea r h i z o g e n e sk 5 9 9 1 2r i 质粒的结构 功能及毛状根诱导的分子机理 r 埙粒是发根农杆菌染色体外可自行复制的双链d n a 分子 大小 为2 0 0 一8 0 0 k b 已有研究表明 发根农杆菌r 颁粒与根癌农杆菌t i 质粒相似 可分为毒性区m 区 t d n a 区和复制起始区 o f i 区 以及分解冠瘿碱的功能区等 图1 3 和图1 4 一 荨 豇替 立 杭州师范大学硕士学位论文 文献综述 图1 3 农杆碱型硒质粒 p 弛 4 b f i g l 3t h es t r u c t u r eo fr ip l a s m i do fa g r o p i n e t y p e p r i a 4 b 图1 4 异黄瓜碱型i 踬粒 p r i l 7 2 4 f i 9 1 4 t h es t r u c t u r eo f r ip l a s m i do fm i k i m o p i n et y p e p r i l 7 2 4 v 哥区位于复制起点和t d n a 区之间 大约2 0k b 距离t d n a3 5 k b 左右 由7 个基因组成 分别称为v i r a v i r b v i r c v i r d v i r e 1 扮 v i r g z d r a v k o v i c k o r a c 等 2 0 0 4 v 哥区对t d n a 的转移起介导作用 当发根农杆菌侵染植株时 植物伤口 细胞会产生一些小分子的酚类物质 从而活化了v i r 区的y 护系列基因 引起农杆菌 的致病性 研究表明 v 五区在转基因毛状根的诱导过程中发挥很重要的作用 其虽 然不直接插入整合到宿主植物基因组中 但v 堪因编码的产物负责接受外界信号 杭州师范大学硕士学位论文 文献综述 t d n a 加工 转移和整合等功能 v i r 区 的缺失或突变 将导致菌株丧失侵染能力 无法诱导产生转基因毛状根 李洪清等 1 9 9 9 v i r 区基因的存在与否以及激活程度 将对农杆菌菌种的侵染能力起决定性作用 毛状根的产生是农杆菌感染植株后 t d n a 吾 v 整合到宿主植物基因中并表 达的结果 m i t ef 等 1 9 8 7 对农杆碱型发根农杆菌的研究表明 在r 顷粒转化植物 细胞产生毛状根中 t l d n a 尤其是其上的r o b 起着十分重要的作用 在没有 t r d n a 存在时 单独使用t l d n a 转化多种植物时 同样可以产生毛状根 再生 植株表现出典型的 毛状根综合症 如 叶子皱缩 节间缩短 弱的顶端优势等 但是单独用t l d n a 转化胡萝i 块根时 却表现出对生长素的依赖性 它只能在块 根上部产生毛状根 其下部不能诱导出毛状根 但添加外源生长素之后t l d n a 转 化对胡萝卜块根下部 可以诱导出毛状根 由此可见 t r d n a 上仅有与t i 质粒t m s 同源的口瓤基因编码的生长素参与生根过程 且可被添加的外源激素代替 s l i g h t o m 等 1 9 8 6 作了p r i a 4t l d n a 的序列分析 找出了1 8 个o r f s 通过缺失和转座子插 入失活研究 在农杆碱r i 质粒a 4 的t l d n a 区鉴定出了4 个与发根有关的位点 r o o t b c u s r o l a d 他们分别对应于o r f s1 0 1 1 1 2 和1 5 均参与和控制毛状根的诱导 t a y b r 等 1 9 8 5 用农杆碱型的r i 质粒感染 g l a n u c a 在转化细胞中确认t o d n a 有1 1 种转录产物 6 5 0 2 5 0 0b p 同时用缺失突变和部位指向突变确定农杆碱型r i 质粒 t d n a 上有功能的基因位置 结果显示 t r d n a 上有6 种m r n a 转录 其中有两种 和t i 质粒t d n a 上的生长素合成酶t m s l t m s 2 基因有相同的功能 在t l d n a 上有5 种m r n a 转录 其中有4 种 r o l a o t o 与肿瘤和毛状根形成有关 r o l a 基因不活化则 通常形成较多的不定根 而不形成毛状根 r o l b f t r o d 基因不活化则不出现病症或 者出现轻微病症 如果用去除t r d n a 的r i 质粒侵染烟草等 则无症状出现 用去 除m d n a 的r i 质粒感染烟草等 则和野生型一样产生毛状根 这一结果说明 t r d n a 上的生长素合成酶基因在转化初期有着重要作用 是产生不定根的关键 t l d n a 上的基因 加朋一加 可能对毛状根的形态特征及其生长有着重要作用 目前普遍认为 r 顿粒转化植物细胞的过程大致包括下列一系列复杂的生物学 过程 1 发根农杆菌识别受伤植物细胞释放的信号分子 如 双子叶植物在伤口 愈合过程中形成的乙酞丁香酮 a s 等酚类物质 与宿主细胞发生粘接并附着在植物 细胞上 2 信号分子诱导r 顿粒v i r 区域基因群活化 3 在活化的v i r 区域基因群 4 杭j 1 l g i t i 范大学硕士学位论文 文献综述 产物的作用下t d n a 被切下 并引导 d n a 穿过农杆菌的细胞膜进入宿主细胞的细 胞核 进而使 d n a 整合到植物基因组中 4 t d n a 基因在宿主细胞中转录与翻 译 发挥其机能并使宿主植物细胞形成毛状根 l 曲m a i 等 1 9 9 8 戴均贵等 1 9 9 9 图 1 5 1 图1 5 农杆菌与植物细胞内共生关系 p e t e r s 等 1 9 9 0 f i 9 1 5t h ee n d o s y m b i o s i sb e t w e e na g r o b a c t e r i u ma n dp l a n tc e l l p e t e r se ta l 1 9 9 0 发根农杆菌的转基因策略 t i 质粒作为载体进行基因转化时 必须先解除 武装 d i s a r m e d 因为嗽粒的 t d n a 上具有致病基因 该基因的表达和植物再生是不相容的 然而 r i 质粒的 t d n a 上的基因不影响植株再生 野生的r 顺粒可以直接作为转化载体 因此 r i 质粒的转基因策略与t i 质粒略有不同 但基本程序相同 即 1 中间表达载体的 构建 将目的基因 导 t d n a 2 r i 质粒的转化载体构建 将中间载体导入发根 农杆菌 3 利用发根农杆菌转化植物 诱导转基因毛状根 4 对毛状根进行筛选 检测和除菌 5 从毛状根再生转基因植株 杭州师范大学硕士学位笙文一 堕鐾 二 二 二 一 1 3 1 同源重组构建共整合载体 将目的基因导入p b r 3 2 2 p b i l 2 l 及p b l l 0 1 等带有加惯中加 r l o s t e r 和n p t 一 基因 的中间表达载体中 常用e 疗h b1 0 1 p r k 2 0 3 和野生型的发根农杆菌直接进行 三亲杂交 通过同源重组把中间表达载体整合到r i 质粒的t d n a 中 构成带有目的 基因的共整合载体 s t o u 躁r d 等 1 9 8 7 利用共整合载体将外源基因导入烟草 牛角花 番茄等植株中 并得到表达 m o r g a n 等 1 9 8 7 构建了中间载体p a m n e o 0 并利用p r i a 4 和 p a m n e 0 1 0 之间的共整合载体 成功获得了具有k m 抗性的番茄转基因毛状根和再生 植株 1 3 2 双元质粒载体的构建 植物双元表达载体 p l a n tb i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o r 是目前利用发根农杆菌进行基 因转化中 应用最为广泛的一种转基因策略 构建程序和t 顷粒基本相同 它的原 理主要是r i 质粒的v 护基因在反式条件下同样能驱动t d n a 的转移 茸p v i r 基因和 t d n a 分别在两个质粒上同样执行上述功能 双元质粒载体 除了含有r 顿粒之外 还含有一个外源质粒 外源质粒表达载体主要用于克隆目的基因片段 可在大肠杆 菌和农杆菌中复制 并可在二者之间转移 是一种穿梭质粒 外源表达质粒除了含 有目的基因外 还有选择标记基因 报道基因和转录水平上的修饰 徐纪明等 2 0 0 8 构建的p b i n 3 5 s g f p 外源表达质粒 转入发根农杆菌k 5 9 9 用于侵染植物外植体形 成转基因不定根 不定根能在蓝色激发光下发出强烈的绿色荧光 表明咖基因能在 转基因不定根中高效表达 用于转基因不定根的快速鉴定 该载体在c a m v 3 5 s 启动 子的两端各有一个多克隆位点 可以方便地进行启动子替换 用于研究不同启动子 的功能 此外 该载体在g f p 基因的5 端含有多克隆位点 在3 端含有e c o ri 和b s m i 两个单一酶切位点 可以方便地在5 端连接上目标基因 表达含g f p 的融合蛋白 进行目标基因编码蛋白的亚细胞定位 也可以方便地切除诉基因 连上需要的目的 基因进行转化 许明等 2 0 1 0 构建了以红色荧光蛋白基因肪船舶作为可视标记的双 t d n a 共转化载体p c d m a d s r e d 2 一邱t 该载体含有2 个独立的b d n a 结构区 其中一 个t d n a 区同时含有选择标记基因助f 和红色荧光蛋白基因历尺沈 另一个t d n a 区含有一个通用的多克隆位点 可任意插入目的基因 在多克隆位点两端含有两段 顺式重复的烟草r b 7 m a m a r s 表示核基质结合区 用来增强目的基因的稳定表 6 达 此载体可用于高效培育无选择标记的转基因植物 相比之下 双元载体系统的构建操作过程比较简单 外源基因的转化效率也明 显高于一元共整合载体 发根农杆菌的转基因方法 目前发根农杆菌的转化的方法很多 转化的过程是 1 发根农杆菌的纯化培 养 2 被转化植物材料的预培养 3 菌株在植物外植体上的接种和共培养 c o c u l t i v a t i o n 4 毛状根的繁殖 5 毛状根的筛选和鉴定 6 转基因毛状根的 植株再生培养 7 再生植株的生物测定和分析 上述是发根农杆菌转化的基本程 序 根据研究目的不同稍有差异 1 4 1 直接接种法 用新鲜菌液对发芽数日或2 周内的无菌幼苗或试管苗的茎部进行l 一3 次注射接 种 2 周后于注射处长出毛状根 茎切段一般取自大田或温室内的植株 将表面消 毒的茎切段插入培养基 用沾有发根农杆菌悬浮液的刀片刺穿或切伤茎切段的任何 部位 通过培养后在刺伤和切伤部位长出毛状根 利用愈伤组织进行直接注射菌液 也是一个很好的直接转化法方法 整株植物也可作为被侵染的对象 向太和等 2 0 0 5 利用野生型的发根农杆菌k 5 9 9 对属于不同科属的大豆 黄瓜和风仙花进行活体感染 实验 结果表明 发根农杆菌k 5 9 9 可使切割后的大豆 黄瓜和风仙花子叶形成不定 根 生根频率分别为1 0 0 6 5 和9 1 此外 发根农杆菌k 5 9 9 还可以使未进行创 伤切割的黄瓜腋芽处形成不定根 生根频率为1 0 1 4 2 外植体共感染接种法 常用的外植体有胚轴 子叶 子叶节 幼叶 肉质根 块茎等 首先对外植体 进行常规消毒 无菌苗不用消毒 然后将外植体在菌液中侵染数秒钟 重复1 3 次 然后进行共培养 下胚轴叶段倒插法是一种较为常见的方法 叶盘法也是常用的方 法 叶盘侵染后应以叶背面朝上放在培养基上 毛状根的发生部位常常在叶圆片的 周围切口处 施和平等 2 0 0 6 牙4 用毒性稍强的农杆碱型发根农杆菌粒p r i a 4 b a t c c 5 8 3 4 感染黄瓜 津研4 号 子叶外植体5d 后产生毛状根 毛状根可直接从叶片 外植体叶脉处产生 感染1 0d 后 不定根的诱导率达9 0 孟莎莎 2 0 1 0 等利用发根 农杆菌k 5 9 9 属于黄瓜碱型 含外源质粒p b 矾一3 5 孓g f p 侵染黄瓜 n c 一4 6 离体子 叶 1 0d 左右切口边缘长出白色小突起 1 5d 左右切口边缘长出肉眼可见的白色不 定根 不定根的诱导频率达7 6 7 转基因毛状根的培养与繁殖 发根农杆菌诱导外植体产生不定根之后 在繁殖培养之前要先除去毛状根上感 染的农杆菌 具体步骤为 切取转基因不定根根尖部分放在有抗生素的培养基上 每周继代培养一次 然后转入无抗生素培养基上观察 确定无菌后即可长期培养 抗生素对毛状根生长有影响 使生长停止或愈伤化 除去抗生素之后毛状根生长可 恢复 选用的抗生素浓度不同对毛状根生长影响也有差异 因此要根据具体情况选 用合适浓度是抗生素 既可以除菌又可以把对毛状根生长的影响程度降到最低 也 可用不含有抗生素的培养基多次截取毛状根根尖进行继代培养 也可达到除菌的目 的 除菌之后的转基因毛状根 需要长期继代培养应用于研究功能基因 外源基因 的遗传与表达稳定性 生产次生代谢产物等 转基因毛状根在合适的培养基中可迅 速增殖 根据培养基种类的不同 可将转基因毛状根的繁殖方法分为固体培养基繁 殖和液体培养基繁殖 不同种质外植体诱导产生的转基因不定根其形态和生长条件 或有差异 可对培养基成分进行增减 已达到适宜转基因毛状根生长的条件 刘传飞等 2 0 0 0 将除菌的野葛毛状根根尖接种于1 5 0m l 角瓶中 内装4 5m l p h5 7 1 2m s 液体培养基 暗培养温度2 8 c 摇瓶转速1 1 0r m i n 第1 周毛状根分 裂旺盛 生物量稳定增加 第2 周开始进入指数增长期 毛状根生物量急剧增加 第4 周进入停止生长期 毛状根老化加剧 生长减慢甚至停止生长 5 周以后生物量 开始下降 吴晓凤 2 0 0 8 等利用液体培养技术 研究了褐脉少花龙葵 s o l a n u mn i g r u m l v a r p a u c i f l o r u m 毛状根的生长特征及培养过程中培养基中氮源和钙的消耗变化 结果表明 少花龙葵毛状根液体培养0 5d 内处于生长迟滞期 5 1 5d 为快速生长期 1 5d 后进入生长平台期 培养基的硝态氮和铵态氮在毛状根液体培养过程中被逐渐 吸收和消耗 至培养1 5d 时铵态氮被消耗殆尽 而硝态氮仍剩余4 4 7 此时氮元素 的利用率达到了最大 培养基中钙的浓度在培养过程中虽逐渐降低 利用相对平缓 欧少云等 2 0 1 0 利用发根农杆菌a t c c l 5 8 3 4 诱导了南美蟛蜞菊毛状根的产生 并研 究了毛状根液体时的生长特征及培养过程中氮源 碳源 磷和钙的消耗变化 结果 杭州师范大学硕士学位论文 文献综述 表明 毛状根液体培养0 7d 内处于生长迟滞期 7 2 1d 为快速生长期 2 1d 后进入 生长平台期 在毛状根液体培养过程中培养基的蔗糖 硝态氮 p 0 4 3 c a 2 被逐渐 吸收和消耗 培养至7d 时 蔗糖被消耗近5 0 硝态氮含量只剩下起始硝态氮含量 的5 8 至3 5d 时 蔗糖和硝态氮含量分别约为其起始浓度的3 3 9 和1 8 2 与 c a 2 浓度变化不同的是 培养基的无机磷被快速消耗 培养至7d 时其浓度约为其起 始浓度的1 7 6 但培养至3 5d 时培养基中仍残存有占起始浓度约6 1 3 此外 利 用发根农杆菌诱导商陆产生毛状根 待毛状根长到2c m 左右将其切下置于m s 5 0 0 m g l 头胞噻肟钠中除菌培养后 毛状根可在无外源激素的m s 培养基上自主生 长 并且较多分枝和根毛 毛状根生长迅速 培养3 周后其鲜重增加约1 8 倍 施和平 等 2 0 0 3 虽然毛状根具有激素自主型生长特性 在培养时不需添加任何激素就能快速生 长 但不少报道表明外源植物激素或植物生长调节剂的加入对毛状根的生长 形态 和次生代谢物的合成均会产生影响 f a r k y as 等 2 0 0 8 l i m aj 等 2 0 0 9 张悦等 2 0 0 8 1 6 转基因毛状根及再生植株的鉴定 1 形态鉴定 毛状根在形态上有典型的特点 首先 毛状根能在无激素的培 养基上生长 其次这种根分生出不定根和侧根的能力很强 呈现毛状 毛状根趋向 于水平生长 向地性全部或部分的消失 大多数报道的由毛状根获得的再生植株表 现出了植株矮小 叶片皱缩 节间缩短 无顶端优势 m a r i eu 等 2 0 0 5 l e o no 等 2 0 0 1 2 冠瘿碱检测 在原核的发根农杆菌细胞中t d n a 上的t m s 基因是不表 达的 只有在转入宿主细胞之后 t m s 基因经真核生物启动子启动才表达合成冠瘿 碱 因此 可根据冠瘿碱的有无和种类可进行毛状根的筛选 通常采用高压纸电泳 或纸层析能够检测到冠瘿碱 s a v k a 等 1 9 9 0 但此方法存在缺陷 如 t d n a 中t m s 会在整合后随机性丢失 这样就会造成冠瘿碱检测时出现假阳性 一些被转化植物 本身就含有生物碱时 不可用此方法进行检测 3 t d n a 区基因检测 随着分子 生物学技术的进步 此方法的应用已十分广泛 即根据已经清楚的r i 质粒t d n a 序列 设计r o l 基因的特异引物 进行p c r 分子检测 或用s o u t h e r n b l o t 方法检测 m 基因 能更有力地证明t d n a 基因是否插入整合到了转基因毛状根中及其拷贝 堕丛堕翌查兰堡主兰垡笙茎 二塑堂 数 c o s t a n t i n o 等 1 9 8 4 王琳 2 0 0 9 4 外源基