基因工程的操作步骤ppt课件.ppt

1 基因工程的基本操作程序 2 基因工程的基本操作程序 1 目的基因的获取2 基因表达载体的构建3 将目的基因导入受体细胞4 目的基因的检测与鉴定 3 4 知识点一 1 原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 启动子 位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列 没有启动子 基因就不能转录 终止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断 它能阻碍RNA聚合酶的移动 并使其从DNA模板链上脱离下来 使转录终止 RNA聚合酶 能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质 以模板转录然后脱落 5 不能转录为信使RNA 不能编码蛋白质 能转录相应的信使RNA 能编码蛋白质 编码区 非编码区 原核细胞的基因结构 有调控遗传信息表达的核苷酸序列 在该序列中 最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 6 7 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子 内含子 外显子 知识点一 2 真核细胞的基因结构 8 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 外显子 能编码蛋白质的序列内含子 不能编码蛋白质的序列 有调控作用的核苷酸序列 包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点等 非编码序列 包括非编码区和内含子 9 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质 原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗 连续 不连续 编码区 非编码 10 1 目的基因的获取 2 基因表达载体的构建 3 将目的基因导入受体细胞 4 目的基因的检测与鉴定 知识点二 基因工程基本操作的四个步骤 11 12 一 获取目的基因 1 获取目的基因的途径A 从自然界已有的物种中分离B 人工合成2 获取目的基因的方法A 从基因文库中获取B 利用PCR技术扩增C 利用化学方法人工合成 目的基因主要是 编码蛋白质的结构基因 13 一 目的基因的获取 一 从基因文库中直接获取 1 基因文库 概念见P9 2 基因文库的分类 按外源DNA片段的来源分类 种类 基因组DNA文库 含有一种生物的全部基因 部分基因文库 只包含了一种生物的部分基因 如 cDNA文库 3 基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下 便于获得所需的目的基因 4 获取目的基因的根据 见课本P9 14 提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶切 一定大小的DNA片段 将DNA片段与载体连接 导入受体菌中储存 基因组文库 5 基因文库的构建方法之一 1 直接分离法 鸟枪法 cDNA合成过程 第一步 反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链 形成RNA DNA杂交分子 第二步 核酸酶H使RNA DNA杂交分子中的RNA链降解 使之变成单链的DNA 第三步 以单链DNA为模板 在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链 形成双链DNA分子 5 基因文库的构建方法之 基因组文库和部分基因组文库 cDNA文库 比较 17 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 2 利用PCR技术扩增目的基因 18 四种脱氧核苷酸 dNTP 一对引物 热稳定DNA聚合酶 Taq酶 模板DNA 需含有目的基因 Mg2 激活剂 条件 缓冲溶液 一对寡核苷酸序列 与目的基因的起始段互补 一段已知目的基因的核苷酸序列 以便根据这一序列合成引物 前提 利用PCR技术扩增目的基因 原理 DNA双链复制前提 要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列 以便合成引物 20 过程 高温变性 解旋为单链 低温退火 引物与单链互补结合 适温延伸 在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链 重复循环 预变性 增加DNA变性的概率 21 2 具体过程 22 PCR 多聚酶链式反应 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 条件 等 原理 方式 以 方式扩增 即 n为扩增循环的次数 结果 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 前提条件 过程 a DNA变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 退火 复性55 65 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 25 PCR技术扩增与DNA复制的比较 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板 能量 酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 26 目的基因的mRNA 单链DNA cDNA 双链DNA 即目的基因 反转录 合成 1 反转录法 以目的基因转录成的信使RNA为模板 反转录成互补的单链DNA 然后在酶的作用下合成双链DNA 从而获得所需的基因 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 2 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 3 人工合成的目的基因 27 二 基因表达载体的构建 基因工程的核心 1 目的 所需物质 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可以遗传给下一代 同时使目的基因能够表达和发挥作用 2 基因表达载体的组成 复制原点 目的基因 启动子 终止子 标记基因 29 启动子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片断 它是RNA聚合酶识别和结合的部位 有了它才能驱动基因转录出mRNA 最终获得蛋白质终止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断 能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因 从而将有目的基因的细胞筛选出来 载体与表达载体的区别 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段 表达载体在载体基础上增加了目的基因 启动子 终止子三部分结构 用到的工具酶 既用到限制酶切割载体 又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接 两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子 终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞 必需以表达载体的方式携带进去 注意 三 将目的基因导入受体细胞 植物细胞 农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法 易感染双子叶植物和裸子植物 对大多数单子叶植物没有感染能力 将目的基因导入受体细胞 动物细胞 显微注射法 将目的基因导入受体细胞 微生物细胞 Ca2 处理使细胞处于一种能吸收周围环境中的DNA 感受态细胞 四 目的基因的检测与鉴定 检测 是否插入目的基因 DNA分子杂交技术 是否转录 mRNA分子杂交技术 是否翻译 抗原 抗体杂交技术 鉴定 功能活性鉴定抗性鉴定 分别提取什么进行检测 归纳步骤 35 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段 将两种生物的DNA分子的单链放在一起 如果这两个单链具有互补的碱基序列 那么 互补的碱基序列就会结合在一起 形成杂合双链区 在没有互补碱基序列的部位 仍然是两条游离的单链 归纳 基因工程的基本操作程序 获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因 启动子 终止子 标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法 显微注射法目的基因的检测与鉴定检测 是否插入 转录 翻译 基因操作的基本步骤 基因操作的基本步骤 40 练习1 2008理综山东卷 为扩大可耕地面积 增加粮食产量 黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注 我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系 1 获得耐盐基因后 构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处 DNA连接酶作用于处 填 a 或 b a a 41 练习1 2008理综山东卷 为扩大可耕地面积 增加粮食产量 黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注 我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系 2 将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法 3 由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术 该技术的核心是和 4 为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功 既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测 又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性 基因枪法 花粉管通道法 植物组织培养 脱分化和再分化 耐盐基因 一定浓度盐水浇灌 1 以下说法正确的是 A 所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B 质粒是基因工程中唯一的运载体C 运载体必须具备的条件之一是 具有多个限制酶切点 以便与外源基因连接D 基因控制的性状都能在后代表现出来 C 练习 2 不属于质粒被选为基因运载体的理由是A 能复制 B 有多个限制酶切点C 具有标记基因D 它是环状DNA D 练习 3 有关基因工程的叙述中 错误的是 A DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B 限制性内切酶用于目的基因的获得C 目的基因须由运载体导入受体细胞D 人工合成目的基因不用限制性内切酶 A 练习 4 有关基因工程的叙述正确的是 A 限制酶