荆芥挥发油对LPS所致大鼠急性肺损伤模型肺组织中NF-κB IκBTNF-α和IL1-β含量的影响.doc

荆芥挥发油对LPS所致大鼠急性肺损伤模型肺组织中NF-B， IB，TNF-和IL1-含量的影响 作者：解宇环 沈映君 金沈锐 徐世军【摘要】 目的观察荆芥挥发油（VOHS）对脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）大鼠模型肺组织中核因子-B(NF-B)，IB-，IL1-和TNF-含量的影响，探讨荆芥挥发油抗炎作用的细胞信号调控转导机制。方法雄性SD大鼠60只随机分为6组，分别为空白对照组，模型对照组，阳性对照组（地塞米松），荆芥挥发油高、中、低剂量组。尾静脉注射LPS(1.0 mg/kg体重)或生理盐水，6h后处死动物，酶联免疫吸附法（ELISA）测定肺组织NF-B p65、磷酸化IB-、IL1-和TNF-含量。结果与模型对照组比较，VOHS高、中、低剂量组均可显著降低大鼠肺组织中的NF-B p65和磷酸化IB-含量，差异有统计学意义（P<0.05， P<0.01, P<0.001），同时VOHS各剂量组也可显著降低大鼠肺组织中IL1-和TNF-含量，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.001）。结论荆芥挥发油抗炎作用机制之一可能是抑制IB-磷酸化降解和NF-B活性，进而减少炎症相关细胞因子IL1-，TNF-的合成和释放。 【关键词】 急性肺损伤 脂多糖 荆芥挥发油 抗炎机制Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of the volatile oil of Herba Schizonepetae on level ofNF-B , IB， IL1- and TNF- in lung tissue of ALI rats induced by LPS ,so to explore the modulator mechanisms of the volatile oil of Herba Schizonepetae in signal transduction of inflammation. MethodsSixty male rats were randomly divided into six groups: normal control group, model group,LPS+Dex group and three volatile oil of Herba Schizonepetae groups. LPS was injected intravenously to prepare ALI model. The level of NF-B ,IB , IL1- and TNF- in lung homogenates were measured by ELISA. ResultsThe level of NF-B in rat lungs significantly increased after LPS stimulation than that of the normal group (P<0.05， P<0.01, P<0.001); the Volatile oil of Herba Schizonepetae groups could decrease the level of NF-B ,IB , IL1- and TNF- in rat lungs of the model groups（P<0.01，P<0.001）.ConclusionThe volatile oil of Herba Schizonepetae can inhibit the IB- phosphorylation and NF-B activivty, then reduce the synthetise and release of cytokines(IL1-,TNF-). This may be one of the mechanism that VOHS has the effect of anti-inflammation .Key words:Acute lung injury; Lipopolysaccharide; The volatile oil of Herba Schizonepetae; Mechanism of anti-inflammation荆芥为常用解表药，前期的实验已经证实其挥发油对多种炎症动物模型均具有良好的抗炎作用1,2。核因子-B对前炎症因子IL1和TNF的基因表达调节起重要作用,而NF-B的活化受NF-B抑制蛋白IB的调控3，荆芥挥发油能否通过干预NF-B信号转导途径达到抗炎作用，目前尚无研究报道。本研究应用脂多糖（LPS）复制大鼠急性肺损伤（ALI)模型，通过观察荆芥挥发油 (VOHS) 对大鼠肺组织中核因子B p65，IB-，IL1-和TNF-含量的影响进一步探讨荆芥挥发油抗炎作用机制。1 材料1.1 荆芥挥发油荆芥(Herba Schizonepetae)购自成都市中药材公司，由我校中药鉴定教研室王光志博士鉴定符合现行中国药典药用标准，按中国药典2005版部附录D挥发油测定法中甲法提取，得淡黄色澄明油状液体，气味芳香，挥发油含量为1.2%，无水硫酸钠充分脱水后，密闭贮存于棕色瓶中,4冰箱保存备用，实验时用0.5%吐温-80溶液配制使用。前期实验测得VOHS小鼠灌胃给药LD50为1.10 ml/kg，实验中所用VOHS剂量约为LD50的1/10,1/20,1/40。1.2 动物健康SD雄性大鼠（SPF级），体重180220 g，由成都中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK（川）2004-12。1.3 试剂LPS（E. Coli 0111：B4）Sigma公司产品；地塞米松磷酸钠注射液，西南药业股份有限公司，批号66040099；Rat NF-B p65 ELISA Kit， Rat IB- ELISA Kit，批号0504； Rat IL1-ELISA Kit，批号0509；Rat TNF- ELISA Kit，批号0509，以上均由上海康成生物有限公司提供。1.4 仪器Multiskan MK3酶标仪, Thermo公司；JY96-超声波细胞粉碎机，宁波新芝科器研究所。2 方法与结果2.1 LPS致大鼠ALI模型的制备取SD雄性大鼠（SPF级）60只，按体重分层，随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组（地塞米松），VOHS高、中、低剂量组，每组10只。除阳性对照组第5天予地塞米松腹腔注射1次给药外，其他组均连续灌胃给药5 d，1次/d，空白对照组和模型对照组灌相同体积的生理盐水。末次给药后1 h，每鼠尾静脉注射LPS 1.0 mg/kg体重，6 h后处死动物，在无菌条件下取出肺脏，用无菌滤纸吸干肺脏表面的血液后锡箔纸包裹，-70保存。2.2 肺组织总蛋白的抽提及指标的检测称取肺组织250 mg,并加入预冷的蛋白质抽提试剂，以超声波细胞粉碎机低速粉碎细胞，低温冷冻离心14 000 r/min,15 min后，取上清液，按BCA法测定蛋白浓度。用ELISA Kit，参照试剂盒说明测定活化的NF-B p65和磷酸化的IB-以及IL1-,TNF-含量：采用双抗体夹心法。酶标板上已包被捕获抗体。待测样品加入微孔孵育后加检测抗体孵育，随后加HRP偶联的抗小鼠二抗，最后加TMB显色。酶标仪450 nm处读OD值，OD值大小与蛋白的量成正比。2.3 统计方法实验数据均以s表示,统计采用单因素方差分析（ANOVA）。2.4 结果2.4.1 VOHS对 LPS诱导的大鼠ALI模型肺组织中NF-B p65，IB-含量的影响结果见表1。结果表明，造模各组与空白对照组相比，NF-B p65含量升高，且差异有统计学意义（P<0.05， P<0.01, P<0.001）。与模型对照组比较，VOHS高、中、低剂量组均可显著降低大鼠肺组织中的NF-B p65含量，差异有统计学意义（P<0.05， P<0.001）；VOHS高、中、低剂量组均可降低大鼠肺组织中的磷酸化IB-含量，差异有统计学意义（P<0.05， P<0.01, P<0.001）。表1 VOHS对ALI大鼠肺组织NF-B p65及 IB-含量的影响（略）2.4.2 VOHS对 LPS诱导的大鼠ALI模型肺组织中TNF-，IL1-含量的影响结果表明，造模各组与空白对照组比较，TNF-，IL1-含量明显升高，且差异有统计学意义（P<0.001）。与模型对照组相比，VOHS各剂量组均可降低大鼠肺组织中IL1-和TNF-含量，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.001）。结果见表2。表2 VOHS对ALI大鼠肺组织IL1-及TNF-含量的影响（略）3 讨论急性肺损伤(ALI)是临床常见的危重病症, 其病理基础是由多种炎症细胞(巨噬细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞等)介导的肺脏局部炎症反应和炎症反应失控所致的肺毛细血管膜损伤，是多器官功能障碍综合征(MODS)或全身炎症反应综合征(SIRS)中最常出现的一种器官组织损伤4。革兰氏阴性细菌内毒素的主要成分脂多糖(LPS)具有明显的致ALI作用5。LPS可引起中性白细胞(PMN)在肺内聚集、激活,黏附于内皮细胞,释放氧自由基、蛋白水解酶等而参与ALI的发生6。研究表明，LPS的这些作用是通过一系列细胞信号转导途径实现的7，其中NF-B信号通路是与机体免疫及炎症反应最为密切的相关的信号通路。NF-B是一种几乎存在于所有真核细胞中的核因子,对细胞的生长、分化、黏附、凋亡及炎症反应等具有十分重要的调节作用。典型的NF-B复合体由两个亚单位P50、P65/c-Rel组成，并主要通过与其抑制蛋白IB紧密结合以无活性的形式存在于细胞浆中。外源性损伤或毒性物质(如细菌毒素)都可诱导NF-B的活化，进而调控免疫炎性基因的转录8。细菌LPS通过与血浆中急性期蛋白的脂多糖结合蛋白(LBP)形成LPS-LBP复合物,后者能与单核-巨噬细胞膜上的CD14受体紧密结合。但是,CD14为糖基化磷脂酰肌醇膜蛋白,锚定在细胞膜上,无胞内区不能独立进行信号转导9。近年研究已经证实,TOLL样受体(toll-likereceptor,TLR)4在CD14和LBP存在时可作为LPS的信号转导受体,使TLR4聚合而活化,通过其胞质结构域募集细胞内髓样分化蛋白88(MyD88)和IL1受体相关激酶发生自身磷酸化,引发酶系级联反应,使IB磷酸化与NF-B解离。正常时，NF-B的P50、P65亚基与抑制性亚基IB形成三聚体存在于胞浆中。IB磷酸化后被非特异性蛋白酶水解，从而使RelA蛋白的核定位信号暴露，导致NF-B被激活后转位入核,活化后其亚基p50、p65由细胞质进入细胞核内,与其目的靶基因的启动子或增强子上特定的B系列特异结合，启动和调控一系列参与炎症反应的炎症因子基因表达（如促炎细胞因子、黏附分子、环氧化酶等）从而介导多种炎症性疾病的产生8 。 在机体对组织损伤和感染的炎症反应中，炎性细胞因子(IL1-、TNF-等）介导的反应是创伤、感染反应的基本部分，但在炎症免疫反应过程，机体在重度感染时，在内毒素刺激下过量释放IL1-、TNF-，进一步激活多形核白细胞和内皮细胞等效应细胞，释放炎性介质，形成瀑布效应10，从而导致多脏器功能障碍及衰竭11,12，如能阻断炎性细胞因子的过量产生，则能阻止损害性炎症反应的发生和发展。本研究证实， LPS刺激后，大鼠肺组织中NF-BP65、磷酸化IB-、IL1-和TNF-含量显著升高，这说明LPS可能通过