（材料学专业论文）基因载体材料的仿生结构及制备.pdf

摘要 自然界经过5 亿年的进化，严密的自然选择使得无论是非常低等还是高度复杂的生 命体，都具有材料、构造、体系以及功能的多样性。天然材料的一个显著特点就在于它 们精雕细琢的外表之下，还具有诸如精密、小型化、逐级有序的组织、杂化，对环境的 抵抗力以及强的适应等特性。因此，对仿生材料的研究引起越来越多的关注。本文着眼 于对生物体的结构、功能以及过程的仿生材料研究，主要内容包括对b a b 型三嵌段共 聚物的仿生自组装行为、阳离子三嵌段共聚物用作基因载体以及仿生合成有机- 无机杂 化s i 0 2 粒子的研究与探讨 首先采用n c a s 开环聚合可控生成与生物体中脂质结构相似的b a i l 型三嵌段共聚 物聚( n - 苄氧羰基赖氨酸) 聚乙二醇聚( n c - 苄氧羰基赖氨酸) ，对其在共溶剂诱导 下的自组装行为进行了研究，发现共聚物的亲，疏水组成和选用的共溶剂均对自组装聚集 体的形态产生影响。当初始溶剂为d m f ，亲水链长度大于疏水链长度时，自组装形成 螺旋态为主的棒状结构，随着疏水链长度增加，自组装形态逐渐过渡为球形胶束以及多 种形态的一次胶束聚集体；改变初始溶剂为d m a c 时，嵌段共聚物的自组装形态与在 d b l f 中相比刚好相反亲水链长度小于疏水链长度时，自组装形成螺旋态为主的棒 状结构，反之则形成胶束及其聚集体；当共溶剂为d m s o 时，形成了类似于细胞膜结 构的囊泡。 将p l l ( z ) - p e g - p l l ( z ) 去保护后得到阳离子嵌段共聚物p l l - p e g - p l l ，反应过程中 共聚物的链长不发生变化。对p l l p e g p l l 用作基因载体的性质进行研究发现：聚 阳离子含量越高，对d n a 的包覆效果越好；形成的聚离子复合物可被胰蛋白酶降解， 实现对d n a 的释放；嬉) p l l - p e g p l l 对细胞系s f 9 和h e k 2 9 3 都转染成功，在s f 9 中，某些组成的共聚物转染效率与商业化试剂相比可达8 ( f a 以上；聚阳离子三嵌段共 聚物d n a 复合物的大小在纳米范围内，t e m 下形态多为球形，a f m 也观察到类似于 棒状的聚集体；细胞毒性测试的结果表明，降低阳离子含量可降低细胞毒性。 以反相乳液聚合方法合成了水合动力学粒径为5 9 8r o l l 的高分子微凝胶模板，然后 四甲氧基硅烷t m o s 为硅源，室温、中性水条件下，仿生合成s i 0 2 杂化粒子。对杂化 粒子的性质进行表征，得到以下结果：成功合成了以微凝胶为模板的有机无机杂化 s i c h 粒子，粒径大小与模板有关，s i c h 纳米粒子分布于整个微凝胶中，形成沟壑与孔洞 交织的网络结构；模板对s i 0 2 杂化粒子的生成起主导作用，决定整个有机无机杂化 粒子的形态和组装性能；t m o s 也对s i 0 2 的沉积有重要影响，t m o s 用量越大，形成 的杂化粒子表面越光滑，整个粒子结构越密实，反之则形成的粒子表面粗糙，结构疏松； 除了模板和t m o s 的影响，溶剂组成和反应时间等其他外界因素也对杂化粒子的性质 产生影响。通过改变溶剂组成和微凝胶浓度改变模板的溶胀程度，可改变粒子的结构和 表面形貌；随着反应时间的延长，杂化粒子从表面粗糙的疏松结构逐渐转变为表面光滑 的致密结构；随着s i 0 2 的沉积，粒子的z e t a 电势在测试p h 范围内出现等电点。t m o s 用量越大，等电点越低；b e t 测试表明，随着t m o s 投料量的增加，比表面积减小， t m o s 用量越小，粒子比表面积越大。对杂化粒子进行灼烧后，会增大其比表面积； 热重分析实验发现，同样的微凝胶浓度，加入t m o s 越多，单位时间内转化率越低，延 长反应时间可以提高反应的转化率；增加微凝胶的溶胀程度可提高催化效率，进而提高 反应转化率。 关键词：仿生材料；三嵌段共聚物；基因载体；微凝胶- s i c h 杂化粒子 a b s t r a c t h la i ll i v i n go r g a n i s m s w h e t h e rv e r yb a s i co r h i g h l yc o m p l e x , n a t u r ep r o v i d e sa m u l t i p l i c i t yo fm a t e r i a l s ，a r c h i t e c t u r e s ，s y s t e m sa n df u n c t i o n s f o rt h ep a s tf i v eh u n d r e d m i l l i o ny e a r sf u l l y p r o v e t lm a t e r i a l sh a v ea p p e a l e dr e s u l t i n gf r o ms t r i n g e n ts e l e c t i o n p r o c e s s e s am o s tr e m a r k a b l ef e a t u r eo fn a t u r a l l yo c c u r r 吨m a t e r i a l si st h e i rf m e l yc a r v e d a p p e a r a n c e w h i c hc o m b i n e sm a n yi n s p i r i n gp w p e r t i e ss u c ha ss o p h i s t i c a t i o n , m i n i a t u r i z a t i o n , h i e r a r c h i c a lo r g a n i z a t i o n s , h y b r i d i z a t i o n , r e s i s t a n c ea n d a d a p t a b i l i t y m o r ea n dm o l ea t t e n t i o n h a sb e e np a i dt o i n v e s t i g a t i o no fb i o m i m e t i ca n db i o i n s p i r e dm a t e r i a l s 1 1 i i sp a p e rw 硒 f o c u s e do nt h eb i o m i m e t i em a t e r i a l sr e l a t e dt os l r u c t u r e s , f i m c t i o n sa n dp l o c c s s c s ，w h i c ha r e m a i n l ya b o u tb i o m i m e t i cs e l f - a s s e m b l yb e h a v i o ro fb a bb l o c kc o p o l y m e r s ，a p p l i c a t i o no f p o l y c a t i o n i c c o p o l y m e r sa sg e n ec a r r i e r sa n db i o m i m c t i cs y n t h e s i so f h y b r i dp a r t i c l e s b a bt r i b l o c k c o p o l y m e rp o l y ( b - b e n z y i o x y c a r b o n y ll - l y s i n e ) - p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) - p o l y ( - b e n z y l o x y c a r b o n y ll - l y s i n e ) ，w h i c hr e s e m b l e sl i p i d sa r c h i t e c t u r ei no r g a n i s m s , w a s c m t r o l l e ds y n t h e s i z e db ya n i o nr i n go p e n i n gp o l y m e r i z a t i o n t h ed e t a i l e ds t u d i e sa b o u tt h e i r s e l f - a s s e m b l yb e h a v i o rs h o w e dt h a tb o t hh y d r o p h i l i c h y d r o p h o b i cc o m p o s i t i o na n dc o s o l v e n t s p e c i e sh a di n f l u e n c eo nm o r p h o l o g i e so f n g g r e g a t e s w h e nt h ei n i t i a ls o l v e n tw a sd m fa n d c h a i nl e n g t ho f h y d r o p h i l i eb l o c kw a sl o n g e rt h a nt h eo t h e rb l o c k , t h ea g g r e g a t e sf o r m e dw e r e r o d s w i t hh e l i c a l g r i c u i i c s ，w h i l es p h e r i c a lm i c e l l e s a n d a g g r e g a t e s w i t h m u l t i p l e m o r p h o l o g i e sw e r ef o r m e di ft h ec h a i nl e n g 吐io fh y d r o p h o b i cb l o c ki n c r e a s e d i na n o t h e r c o s o l v e n t o f d m a c ，l f - a s s e m b l yo f c o p o l y m e r s w a s j u s t o p p o s i t e t o t h e b e h a v i o r s i n d m f , h e l i c e sw 啪f o r m e dw h e nh y d r o p h i l i eb l o c kw a ss h o r t e rt h a nt h eh y d r o p h o b i c a n dm i c e l l e s a n dm u l t i p l ea g g r e g a t e sw f f b f o r m e dw h e r e a sh y d r o p h o b i cb l o c kw a sl o n g e r v e s i c l e sl i k e c e l l - m e m b r a n es t r u c t u r e sw e r eo b s e r v e dw h e ni n i t i a ls o l v e n tw a sd m s o p o l y c a t i o ni r i b l o c kc o p o l y m e r sp l l - p e g p l lw f r eo b t a i n e da f t e rd e p r o t e c f i o no f p l l ( z ) - p e g - p l l ( z ) ，a n dc o m p o s i t i o no fb l o c k sw a sr e t a i n e d c h a r a c t e r i z a t i o no fi t s a p p l i c a t i o n g e n ec a r r i e r sw a sc o n c l u d e d 舔f o l l o w s ：( 1 ) t h ee n c a p s u l a t i o na b i l i t yo f p l l p e g - p l lw a se n h a n c e dw i t hc o n t e n to f p o l y c a f i o ni n c r e a s i n g a n dc o p o l y m e r sc o u l d b e d e g r a d e db yt r y p s i nt or e l e a s ed n a ；( 2 ) i r a n s f e c t i o no f p o l y i o nc o m p l e x e s ( p l c ) f o rc e l l l i n e s s f 9a n dh e k 2 9 3w a ss u c c e s s f u l i nc e l l l i n es f 9 ，t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yo fs e v e r a lp i cw a s a m a z i n g l yu p t o 8 0 c o m p a r i n gt oc o m m e r c i a la g e n t ；( 3 ) t h ed i m e n s i o no ft r i b l o c k c o p o l y m e r s d n aw a sa tn a n o m e t e rs c a l e ，a n dm o r p h o l o g i e sw e f fs p h e r e sw h i c hc o n f i r m e d b yt e m r o d - l i k ea g g r e g a t e sw a sa l s oo b s e r v e du n d e ra f m ；“) e x p e r i m e n t a lo fc e l l t o x i c i t y i n d i c a t e dt h a tt o x i c i t yo f t r i b l o c kc o p o l y m e r sc o u l db ed e p r 器s e db yd e c r e a s i n gt h ec o n t e n to f c a t o n i cb l o c k p o l y m e rm i c r o g a l s w e r e s y n t h e s i z e db y i n v e r s ee m u l s i o n p o l y m e r i z a t i o n w i t h h y d r o d y n a m i cd i a m e t e ro f5 9 8r i m , w h i c hw a su s e da st e m p l a t e ，a n dt e t r a r a e t h y lo r t h o s i l i c a t e ( t m o s ) a sr e s o u r c eo fs i l i c af o rs y n t h e s i so fh y b r i dp a r t i c l e s t h er e a c t i o nw a sp e r f o r m e di n a q u e o u ss o l u t i o na tr o o mt e m p e r a t u r et os y n t h e s i z es i l i c ae m p l o y i n gb i o m i m e d cm e t h o d s r e s u l t so fc h a r a c t e r i z a t i o no fh y b r i dp a r t i c l e s 黜l i s t e db e l o w ：( 1 ) o r g a n i c i n o r g a n i ch y b r i d p a r t i c l e sw e r es u c c e s s f u l l ys y n t h e s i z e db yu s i n gm i c r o g e la st e m p l a t e ，t h ed i a m e t e ro fw h i c h w a sd e t e r m i n e db ym i c r o g e l s s i l i c an u n o p a r t i c l e sw e r ed i s t r i b u t e di nt h ew h o l em i c r o g a l p a r t i c l ea n df o r m e dn e t - w o r ks d m 咖嘲c o m p o s e do fc h a n n e l sa n dc a v e s ；( 2 ) t h et e m p l a t e s p l a y e dl e a d i n gr o l ei nt h ep r o c e s so fh y b r i ds i l i c ap a r t i c l e sf o r m a t i o n , w h i c hd e t e r m i n et h e m o r p h o l o g ya n da s s e m b l yp r o p e r t i e so fo r g a n i c - i n o r g a n i ch y b r i dp a r t i c l e s t i v i o sa l s oh a s i m p o r t a n ti n f l u e n c eo nt h ed e p o s i t i o no fs i l i c a ：t h es u r f a c eo fh y b r i dp a r t i c l e sw a sr o u g ha n d w h o l ep a r t i c l ew a st i g h ti f t h eq u a n t i t yo f t m o sw a sl a r g e ，w h e r e a st h ep a r t i c l e sf o r m e ds i c l o o s ea n dt h es u r f a c eo f w h i c hw a ss m o o t hw i t hd e c r e a s i n go f t m o s ( 3 ) b e s i d e si n f l u e n c eo f t e m p l a t e sa n dt m o s ，e x t e r n a lf a c t o r ss u c ha ss o l v e n ta n d r e a c t i o np e r i o da l s oh a se f f e c to n p r o p e r t i e so f h y b r i dp a r t i c l e s t h es w a l l o w e x t e n to f m i c r o g a l sc o u l db ec o n t r o l l e db ys o l v e n t c o m p o s i t i o na n dc o n c o n u a t i o nt om o d u l a t es u r u c t l i f c sa n ds u r f a c em o r p h o l o g i e s ；“) a f t e r d e p o s i t i o no fs i l i c a , t h ei s o c l t r i cp o i n to fp a r t i c l e sl r o s ca n dc o n e l a t i o np hd e c r e a s e dw i t h q u a n t i t yo ft m o sa d d e di nt h er e a c t i o n ；( 5 ) t h eb e t s u r f a c ea r e ad e c r e a s e dw i t hq a n t i t yo f t m o si n c r e a s i n g a n di te n l a r g e da f t e rc a l c i n a t i o n s ；( 6 ) t g ad a t as h o w e dt h a ta ts a m e c o n c e n t r a t i o no fm i c r o g e l c o n v e r s i o no fs i l i c ad e a a s e dw i t hm o r et m o sa d d e d , w h i c h c o u l db ei m p r o v e db yp r o l o n g i n gr e a c t i o np e r i o aa n di n c r e a s i n gs w a l l o we x t e n to f m i c r o g a l s k e y w o r d s ：b i o m i m e t i cm a t e r i a l s ；t r i b l o c kc o p o l y m e r s ；g u n ec a r r i e r s ；m i c r o g e l s i l i c ah y b r i d p a r t i c l e s i v 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名： 日期： 】虱备 砷年岁月斗日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的 印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影印、缩印、数 字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学 位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名：同务 艚瓤戤昏v 硝迸 f ，r ”、- 日期：”7 岁坪 日期： 第一章文献综述 第一章文献综述 自然界存在的天然生物材料有着人工材料无可比拟的优越性能。地球上所有的生 物，都是由一些简单且廉价的无机和有机材料通过逐级组装形成的具有形态和功能兼备 的生命体。如贝壳、蚕丝、骨骼、肌肉等都是经历了亿万年的进化形成现有的结构与功 能。虽然这些天然材料的基本组成单元很平常，但往往具有适应环境及功能需要的复杂 超结构组装，所表现出的优异强韧性、功能适应性及损伤愈合的能力，这是传统人工合 成材料无法比拟的。迄今为止，再高明的材料科学家也无法做出具有高强度和高韧性的 动物牙釉质以及海洋中色彩斑澜、坚固又不被海水腐蚀的贝壳。从材料化学的观点来看， 从生物大分子到细胞、组织直至各种器官，仅仅利用极少的元素，主要是碳、氢、氧、 氮等组合而成，便能形成复杂的结构和多样的功能，实在是令人叹服。仿生材料的研究 是人类向自然学习的重要步骤，也是生物科学给材料科学带来的重大机遇 比较系统的现代仿生研究，从2 0 世纪6 0 年代开始逐步活跃起来。材料仿生研究则 相对较晚，英文起初用b i o n i c s 一词，它由建立在具有生命之意的希腊语b i o n 上，加上 有工程技术涵义的i c s 组成，主要着重于电子系统的研究。9 0 年代出现了b i o m i m c t i c s 一词，意思是模仿生物。近年来国外出现的。b i o i n s p i r e d ”一词，意为“受生物启发” 而研制的材料或进行的过程。这个含义较广，更为贴切，因而被更为广泛的应用。因此 仿生材料的定义可以认为是受生物启发或模仿生物的各种特性而开发的各种材料。 蝴蝶翅膀的变色效应，促使了人们对光子晶体结构到功能应用的一系列研究【i j ；后 口类生物体独有的发光性质，引起了对生物发光体组成、结构及发光机理的研究和新型 发光材料以及光学器件的开发1 2 - 4 ；水珠在莲叶表面不发生浸润，对其微观结构的研究 使得具有自清洁效应的涂层及表面随之诞生哪】；壁虎贴壁行走自如，对其足底刚毛结 构的研究促发了对干的黏结表面的开发应用 9 - ”1 自然界中数不胜数的现象及独特的 生物性能，其微观分子结构和聚集形态及内在规律的揭示，对于新型功能材料的开发可 谓取之不尽的宝贵财富 近年来。材料科学通过与生命科学交叉，对生物材料的形成过程进行研究，从研究 中得到启示，将传统的人造材料的领域扩大到生物材料领域，涉及生物大分子、生物合 成、基因技术等。 材料仿生的研究范围广泛，包括微结构、生物组织的形成机制、结构与工程的相互 关系，并最终利用所获得的结果进行材料的设计与合成。从材料学的角度可以把材料仿 湖北大学硕士学位论文 生分成几大方面：成分和结构仿生、过程和加工制备仿生、功能和性能的仿生等。 1 1 嵌段共聚物溶液中的仿生自组装 1 1 1 嵌段共聚物溶液自组装的仿生意义 生命体最基本的单位细胞，是由脂质形成的包膜维持其稳定的结构，将生物大 分子如蛋白质、多糖以及核酸囊括其中以维持生命体的运作与生存这些大分子，也都 是由一级分子序列( 如氨基酸) 通过分子内作用力( 如氢键) 先形成的二级结构( 如多 肽) ，再次组装后形成具有三维构象的三级结构( 或者某些三级结构的蛋白质亚基再发 生非共价键缔合之后形成具有四级结构的聚集体) ，进而执行特定的生理功能f 1 2 】。 生物大分子的组装不仅仅是简单的分子堆积和捧列，更重要的是形成具有特定生理 功能的聚集体。如具有催化活性的酶、能够特异性识别的抗体- 抗原、能够运输小分子 的载体蛋白质生命体内组装结构的复杂性和功能的多样性，是传统人工材料所无法 比拟的。结构与功能紧密结合的特性，使得对自组装行为的研究具有重要的理论意义和 应用价值。 图i - l 天然高分子与合成高分子的复杂性与多样性对照【1 2 第一章文献综述 脂质作为组成细胞膜的主要成分，具有两亲性，其结构为一个亲水的头部和两条疏 水的尾巴，因此在水相中趋向于自发组装成双层膜结构。在细胞中，脂质形成的双层膜 具有很好的流动性和通透性，除了维持细胞形态的稳定，同时也担负起细胞内与胞外物 质自自交换功能，保证细胞正常的生理活动。对于脂质这种两亲结构基础上自组装形成具 有特定生理功能的亚微结构的研究，促使人们对于同样具有两亲特性的嵌段共聚物在溶 液中的自组装行为进行了大量且深入的研究，希望开发出能够维持稳定形态和( 或) 进 行内外物质交换的纳米反应器、运载体系或其它具有特定功能的超分子聚集体。 含有亲水片段和疏水片段( 或亲油片段) 的嵌段共聚物在不同的溶剂中会表现出不 同的性状。亲水片段倾向于在极性溶剂中发生链的伸展，疏水片段则倾向于分散到非极 性溶剂中。由于溶剂对其中亲水片段和疏水片段的溶解性不同，嵌段共聚物受分子间力 和自由能等的影响能够自发组装成不同的形态，如棒状、球形、螺旋状、各类胶束以及 囊泡等。这特性使其能够对小分子物质进行包覆和运载，特别是对于疏水性的药物， 通过与疏水片段结合包覆其中，亲水片段暴露在外面，在体内水环境中运送时能够避免 发生沉积或者被体液中的酶降解。除此之外，嵌段共聚物还在基因运送，生物传感器以 及细胞模拟等方面有很好的研究和应用前景。因此，研究嵌段共聚物在溶液中的自组装 行为，具有重要的仿生理论意义和实际应用价值。 1 1 2 嵌段共聚物溶液自组装的研究进展 自组装的定义主要是指分子在局部热力学平衡条件下，利用非共价键( 如氢键、离 子键以及范德华作用力) 自发结合形成结构精确可控的稳定的聚集体的过程1 】。在溶液 体系中，分子处于自身与溶剂的微环境下，其组装行为受到分子力与溶剂化效应的同时 作用，因此，任何因素产生的影响，即有可能对聚集体的结构与功能产生改变。 对脂质等表面活性剂的x 射线衍射检测发现，在三相体系中，受到共溶剂中不同组 分对嵌段共聚物中的不同片段的溶解性的影响，整个体系由于水油溶剂比例以及嵌段 共聚物含量的不同，按照水油的值从大到小，整个三相体系分别呈现胶束溶液( l i ) ， 胶束立方溶致液晶( 1 y o l r o p i cl i q u i dc r y s t a l ，l l c ，i i ) ，六方柱l l c ( h 1 ) 二次连续立方 l l c ( v i ) 以及片层l l c ( k ) 态【1 4 】。在这一变化过程中，其平均曲率h 不断减小直 至为0 ( 片层l l c ) 。随着溶剂中油组分含量的不断增加，体系转变为反相溶液，状态 又呈现二次连续立方l l c ( v 2 ) ，六方柱l l c ( h 2 ) ，胶束立方l l c ( 1 2 ) 和胶束溶液( k ) ， 而h 也是由0 转变为负值并不断减小，整个变化过程以片层l l c 为中点形成对称分布。 3 湖北大学硕士学位论文 由于嵌段共聚物中疏水组分( 或亲水组分) 的种类不同，每一片段的链长及单体( 或 片段) 结合方式等导致结构不同，或者是共溶剂成分的影响，整个三相体系的状态也会 有所不同i ”】。a l e x a n d r i d i s 等以含有亲水片段聚乙二醇( e ) 的嵌段共聚物( a b 和a b a ) 体系为例，采用的疏水片段分别为聚( 氧化丙烯) ( p ) ，聚( 1 ，2 氧化丁烯) ( b ) ，聚 四氢呋喃( t ) 和聚苯乙烯( s ) 。使用到的共溶剂为水有机溶剂( 分别为p _ - - q j 苯。n - 醋酸丁酯和1 丁醇) 。在2 5 c 时，同样是i 1 2 0 p - - - 甲苯为共溶剂，含有嵌段共聚物b i o e i 7 和e 1 3 p 3 0 e 1 3 的三相体系在整个变化过程中虽然都表现出了l i ，i l ，h l ，v i ，k ，v 2 ， h 2 ，1 2 ，l 2 的状态，但是在同一溶质、溶剂比例时，两个体系呈现的状态却不尽相同。 而在以水，1 丁醇为共溶剂，( e 6 5 s s ) i i 和( e t o s s ) 1 9 分别为溶质的三相体系中，前者出现了 一个一相区域，后面两个体系则出现了能发生双折射的凝胶和等方性的凝胶以及溶液状 态，由此表明嵌段共聚物的组成、结构对于三相体系的状态有很大影响，间接的对嵌段 共聚物的自组装形态也有影响。对同一种嵌段共聚物e i o o i 7 0 l 1 。在不同的水，油体系中 整个三相体系也会呈现不同的状态。例如，在2 5 水恤二甲苯作共溶剂时，整个组分 变化过程仅出现h i 、i 卜l 卜l 。和h 2 状态，在莉储酸丁酯作共溶剂时，则仅有h 卜i i 、 l l 和l 。态，而在刀v , i 丁醇作共溶剂时，还会出现l 2 态，并且在同一组分浓度时各体系 的状态也各有不同。因此溶剂组成对于三相体系的状态也有很大影响。此外，温度、p h 值、盐浓度外部因素等也会影响嵌段共聚物与共溶剂组成的三相体系的状态，相应地对 于嵌段共聚物的自组装形态也有影响。 对于嵌段共聚物溶剂体系的透射电镜观察也证实嵌段共聚物自身结构、溶剂种类和 组成都对其自组装形态有影响。r i e g e l 等人曾研究疏水性的苯乙烯( p s ) 与亲水性的季 铵化5 ( n ，n 二乙基氨) 异戊二烯( p a l ) 嵌段共聚物在选择性溶剂中的自组装形态， 实验结果表明二嵌段共聚物( p a i l l - b - p s v o ) 和三嵌段共聚物( p a l i i - b - p s n s - b - p a i , , ) 在 同种溶剂中自组装形态并不相刚1 6 1 。在不同的溶剂中，可以分别形成球形和棒状的一次 胶束，囊泡以及碗状结构。对三嵌段共聚物p a i l l - b - p s m s - b - p a i i i 溶于共溶剂的实验发现， 在共溶剂d m f t h f 的组分比例为9 9 5 ，嵌段共聚物初始含量为1w t 的体系中，随着 水含量的增加，嵌段共聚物依次组装为复合物胶束，碗状，囊泡和棒状共存以及大的囊 泡等形态。而在共溶剂d m f r r h f 比例为1 0 1 9 0 ，嵌段共聚物初始含量为1w t 的体系 中，随着水含量的增加，自组装形态分别为复合物胶束，一次胶束，片层结构以及囊泡 形态，在含水量为3 5w t 时还观察到类似于脊髓及其伸展轴突的自组装形态。 袁建军等对b a b 型三嵌段共聚物的水溶液自组装形态进行过相关研究，发现在不 4 第一章文献综述 同的共溶剂条件下，嵌段共聚物会表现出不同的聚集形态，如球形胶柬，蠕虫状胶束， 囊泡，以及引入疏水性聚肽片段所产生的独特的螺旋形态1 1 7 - 2 0 , 2 1 l 。对p s p e o p s 的自组 装研究发现，当采用d m f 为溶剂时，三嵌段共聚物p s 护p e 0 4 5 - p s 4 3 自组装形成胶束， 而采用t h f 和l ，4 二氧六环为起始溶剂体系时，体系形成囊泡。同时在t h f 为共溶剂 的体系中，还观察到了凹形囊泡的存在。改变链段组成，在二氧六环为起始溶剂的时， p s 4 9 - p 4 p s 4 9 三嵌段共聚物蠕虫胶束会发生二次聚集。除了链段结构和溶剂组成， 退火对聚集行为也会产生影响。 综上可见，影响嵌段共聚物溶液自组装的主要因素有二：一是嵌段共聚物的自身结 构，包括亲疏水片段的单体种类、长度、结合方式等等；二是溶剂的组成及性质包括 溶剂对亲疏水片段的溶解能力，共溶剂的组成比例、p h 值、盐浓度等等。此外还有一 些外界因素，如温度等也会对自组装形态造成影响。因此在对嵌段共聚物进行可控自组 装过程中，要充分考虑以上各种因素，以求找到适用于药物、基因运送，生物拟态等用 途的共聚物分子。 1 1 3 从胶束到囊泡 随着对两亲性物质自组装行为的研究不断深入，囊泡作为一种新的仿生结构引起了 广泛关注。由于其形态和结构特点，包装容量增加，抗血流和压力强度好，缓释效果以 及在模拟细胞活动等方面都有很好的应用前景。 图l - 2 从胶柬到囊泡转变的动力学模型，图来源于文献【2 2 】。 对于卵磷脂的自组装行为研究发现，在从胶束到囊泡的过程中，大致要经历以下几 个步骤【如图i - 2 ，2 2 】：在最初形成胶束后，很短的时间内( 匈) 胶束聚集形成半径为 5 湖北大学硕士学位论文 f l 的碟形结构。在此后一个较长的时间内，碟形结构的半径不断增大，达到某个临界值 ( r ) 时，迅速发生闭合( s ) ，形成囊泡。之后可能发生成熟化，融合或者裂分作用， 一些较小的囊泡会合并成更大的囊泡，但一般说来这个过程是可以忽略的，因此对其发 生时间并未进行过详细考察。要提到的是，在碟形结构增长的过程中，在某些条件下可 能发生层层堆积，再经过缓慢的转变( 大约几天) ，将会形成片层结构。 最初对嵌段共聚物的溶液自组装形态研究仅仅认识为各种形状的胶束，随着不断深 入的研究发现，在适当的条件下，嵌段共聚物也能够像小分子的脂质一样，自组装成囊 泡的形态，鉴于脂质膜结构与功能的紧密相关，两亲性物质形成囊泡的仿生自组装行为 引起研究者们的广泛兴趣1 2 引。相关的研究例子包括含富勒烯的表面活性剂】、两亲性树 枝状聚合物【2 ，】、阴离子型的表面活性剂【矧以及各种两亲性嵌段共聚物1 2 7 - 3 4 1 。 本节内容中将主要介绍预测囊泡形成的一些理论方法以及两亲性嵌段共聚物模拟 生物膜的研究现状的例子。 1 1 3 1 囊泡形成的理论性预测 常用的解释囊泡形成的理论是使用分子堆积参数这种概念，由i s r a e l a c h v i l i ，m i t c h e l l ， n i n n a m 等人提出【3 5 1 。其公式表示为n , - - - v o a , l o ，其中v o 和t o 分别是表面活性物质尾巴的 体积和长度，a e 是每个分子的末端基团在聚集体平衡时的表面积一般认为，n 。值越小。 自组装聚集体曲率越大当i 2 1 ) ，加入l 的胰蛋白 酶后，3 7 放置5 0r a i n 。然后加入0 6 倍体积的异丙醇，4 放置l p l 5m i n 后，1 0 0 0 0 r p m 离心1 0r a i n ，吸弃上清，3 7 烘干后以t r i s - h c i ( p i q7 4 ) 缓冲液溶解，与未加入 胰蛋白酶的复合物胶束一起上样电泳后观察结果。此步骤主要是检测胰蛋白酶能否降解 聚阳离子嵌段共聚物，同时也可检测聚阳离子对d n a 包覆的效果如何。 2 4 3 4 测试聚离子复合物胶束的转染效果 g f p b a c 对昆虫细胞系s f 9 的转染 用无血清的培养基( s f m ) 将p o l y m e r 与d n a 分别稀释至1 0 0 山，二者混合，2 7 温 育3 0 - 4 5m i n ，补加适量的s f m 。将上述混合液加到细胞培养平板中，2 7 培养4 - - 6h 后，吸去以上加入的混合液，再加入足量的完全培养基( 含血清) ，培养7 2h 后即可观察 转染结果。 ( 勤) c d n a 3 1 - g f p ( 5 k b ) 对哺乳动物细胞系h e k 2 9 3 的转染 用无血清的d m e m 将p o l y m e r 和d n a 分别稀释至5 0 0 山，混合，室温温育2 0m i n 后，将混合液加到细胞培养板中，置于5 的c 0 2 培养箱中3 7 培养，6h 后加入有血 清的培养基，2 4 - 2 8h 后即可观察结果。 2 4 3 5 形态及大小检测 d l s 检测溶液中聚离子复合物的水合动力学粒径；t e m 观测聚离子复合物形态及 真空状态下的大小；以云母片为支载，干燥后a f m 观测其表面形貌 第二章实验部分 2 a 3 6 细胞毒性检测 采用m t t 比色法检测三嵌段共聚物p l l - p e g - p l l 的细胞毒性。 培养h e l a 细胞于9 6 孔板( 1 2 8 ) ，每孔约5 0 0 0 个细胞。其中第1 列为空白列， 只加培养基，不培养细胞。待细胞生长至9 0 0 4 ，按照浓度梯度，第扣l l 列加入嵌段共 聚物溶液，同种p l l - p e g - p l l 样品平行加样4 - 8 行。培养2 4h 后，每孔加入2 0 山m 丌 ( 5 m g m 1 ) ，继续培养4 h 后，吸出m r r 溶液，每孔加入1 0 0 山d m s o ，3 7 放置2 0 m i n 使结晶溶解。用酶标仪在5 7 0 n l n 波长下测定其吸光度并计算存活率。存活率= 1 0 0 x ( 实 验组0 d 5 7 0 值平均数第l 列o d 5 7 0 值平均数) ，( 第1 2 列o d 5 值平均数- 第l 列o d 5 7 0 值平均数) 2 4 4 有机无机杂化s i 0 2 纳米粒子表征 2 4 4 1 结构表征 纳米s i 0 2 粒子生成过程中，微凝胶、纳米粒子( 烧前和烧后) 分别作f t i r 测试， k b r 压片；纳米粒子烧前作1 h n m r ，溶剂为d 2 0 ；烧前和烧后分别作固体2 9 s i m a s n m r 测试。 2 4 4 2 粒径检测及形貌观察 微凝胶粒子分散于水相中，d l s 检测激发波长为6 0 0n i n 时的粒径大小 将微凝胶、纳米s i 0 2 粒子( 烧前和烧后) 分别超声分散到乙醇中，铜网制样后t e m 观测形态及大, b - 杂化纳米粒子灼烧前后，分别作切片( 固体，环氧树脂包埋) 分析 s i 0 2 在整个粒子中的分布以及杂化粒子的内部构造；s e m 观测杂化粒子( 烧前和烧后) 的表面形貌。 2 443 z e t a 电势检测 取样品少许超声分散于lm l v ln a c i 溶液中，k o h 或h c i 溶液调节其p h 值，用微 电泳仪测试样品在不同p h 值下的z e t a 电势，同p h 值下测三次后取平均值，而后绘制 成历匦p h 曲线。 2 4 4 ab e t 比表面积测试 制取较多量s i 0 2 纳米粒子，采用静态氮气吸附法，7 7k 测得等温吸附曲线，按照 d - r 理论计算出不同纳米粒子的比表面积。 湖北大学硕士学位论文 2 4 4 5s i 0 2 转化率的测定 采用t g a 测试，将微凝胶s i 0 2 杂化粒子空气氛下加热到6 0 0 ，升温速度为2 0 c m i n ，根据t g a 曲线及反应投料量计算出s i 0 2 转化率。分别作转化率对时间和t m o s 用量的二维图 第三章结果与讨论 第三章结果与讨论 3 1b a b 型三嵌段共聚物仿生自组装行为研究 3 1 1 结构表征 3 l 1 1p e g 改性结构表征 自1 9 世纪7 0 年代r u t g e r s 大学的f r a n kd a v i s 教授将聚乙二醇( p