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摘要 葡萄糖木糖混合发酵乙醇研究 摘要 燃料乙醇是公认的最有发展前景的可再生清洁能源之一。利用木质纤 维素生物转化生产乙醇是目前研究的热点，而对木糖和葡萄糖的有效利用 又是其中的关键环节之一。因此，高糖利用率和高耐抑制物能力的共代谢 木糖和葡萄糖发酵菌种的选育一直是该领域的热门课题。本论文对共代谢 木糖、葡萄糖菌种的生理生化特性进行了研究，并根据其发酵特性对该菌 株进行木糖发酵驯化，以增加其木糖发酵产乙醇的能力。同时对驯化后筛 选到的菌株进行了发酵混合糖产乙醇的工艺进行了优化，为该菌株在纤维 素燃料乙醇生产工艺中的应用奠定了一定基础。 对自筛菌株1 1 2 5 3 进行驯化、得到一株性能稳定的菌株c 7 ，对糖的 利用率可达9 9 4 3 ，乙醇产量达1 2 2 3 酊，乙醇得率5 0 4 3 ，糖醇转化 率为0 2 4 6g 乙醇儋糖。( 酵母代谢木糖的理论得率为0 4 6g 乙醇儋木糖， 葡萄糖乙醇发酵理论得率0 5 1g 乙醇儋葡萄糖) 其乙醇得率、乙醇含量 和糖利用率比出发菌株分别提高了3 0 4 0 、2 5 6 4 、2 4 8 7 。测定菌株 c 7 的生长曲线后对菌株进行发酵参数的优化。研究c 7 的生长和发酵条 件得出，菌株c 一7 的最适生长温度为3 0 。c 、p h 范围为4 5 - 5 0 。最适发 酵温度为3 3 。c ，p h 保持在5 0 5 5 之间最为理想。菌株c 一7 的种子液的培 养时间为1 4 h ，接种量8 发酵结果最佳。溶氧对发酵结果也存在较大影 响，发酵的过程中适当地提高溶氧有利于代谢朝乙醇产生的方向发展，摇 瓶发酵时，采用纱布外包一层塑料膜的发酵条件下发酵液中的乙醇含量最 高，而且提高幅度很大，乙醇产量能达到2 0 9 6 l ，乙醇得率高达8 7 3 6 ， 1 北京化工大学硕士学位论文 糖醇转化率为0 4 1 9 2 9 乙醇儋糖，但此时乙醇挥发的较快。 玉米秸秆经过酶水解之后能达到理想的发酵结果，糖醇转化率能达到 了0 3 8 3 0g 乙醇儋糖。采用不同的脱毒方法处理玉米秸秆酸水解液后发 酵效果差异也比较明显，经过c a c 0 3 处理的水解液，在发酵过程中糖醇 转化率达到了0 2 8 0 3g 乙醇儋糖。由于发酵至第三天发酵液中的残糖浓 度仍较高，所以可以延长发酵时间，以获得更高的乙醇产量。 关键词：木糖、乙醇发酵、玉米秸秆、菌种选育 n 摘要 t h e s t u d yo fe t h a n o lc o - f e r m e n t a t i o nw i t hg l u c o s ea n dx y l o s e a b s t r a c t f u e le t h a n o li sr e g a r d e da so n eo ft h em o s tp r o m i s i n ge n v i r o n m e n t a l l y r e n e w a b l ee n e r g yr e s o u r c e d - x y l o s ei st h em o s ta b u n d a n tm o n o s a c c h a r i d ei n l i g n o c e l l u l o s eh y d r o l y s a t ea f t e rg l u c o s e c o n s e q u e n t l y ，e t h a n o lf e r m e n t a t i o n o fx y l o s ei so fm a j o rc o n c e r no ft h ee f f i c i e n tu t i l i z a t i o no fl i g n o c e l l u l o s i e h y d r o l y s a t e st op r o d u c ef u e le t h a n 0 1 t h e r e f o r e ，t oo b t a i nab a c t e r i a ls t r a i n t h a tc a nl a r g e l yu s ex y l o s et op r o d u c ee t h a n o li sa l w a y sah o t t o p i cw i m i l lt h i s a r e a ab a c t e r i u mw h i c hc a nf e r m e n tx y l o s et op r o d u c ee t h a n o lw a sf i l t e r e d f r o mn a t u r a le n v i r o n m e n t i tw a si d e n t i f i e db ya n a l y z i n gi t sp h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n da p p l y i n gs e v e r a lm o l e c u l eb i o l o g i c a lm e a n s i t w a sd o m e s t i c a t e db ym e a n so fi t sz y m o l y t i cc h a r a c t e r i s t i ct oi m p r o v ei t s a b i l i t yo fz y m o l y s i s t h e nt h ep a r a m e t e r so ft e c h n i q u eo ff e r m e n t i n gx y l o s et o p r o d u c ee t h a n o lw e r eo p t i m i z e dt ol a yaf o u n d a t i o no nt h ec e l l u l o s et ot h e a l c o h o lp r o d u c t i o nt e c h n i q u e t h em a i nc o n t e n to ft h i sr e s e a r c hi sa sf o l l o w s a f t e rd o m e s t i c a t i o na n ds c r e e n i n go fs t r a i n112 5 3 ，s t r a i nc - 7w a s u l t i m a t e l yf i l t e r e do u tw i t hh i g h e s tu t i l i z a t i o nr a t eo fx y l o s ea s9 9 4 3 ，y i e l d o fe t h a n o la s 1 2 2 3 酣，p r o d u c t i o n r a t eo fe t h a n o la s5 0 4 3 a n dt h e t r a n s f o r m a t i o nr a t ei s0 2 4 6ge t h a n o l gs u g a r t h et h e o r e t i c a ly i e l d so fy e a s t f e r m e n t a t i o ni nx y l o s ea r eo 4 6ge t h a n o l gx y l o s ew h i l ei ng l u c o s ea so 51g e t h a n o l gg l u c o s e i ti s f o u n dt h a tt h ep r o d u c t i o nr a t eo fe t h a n o l ，t h e i h 北京化工大学硕士学位论文 a l c o h o l i c i t ya n d u t i l i z a t i o nr a t eo f x y l o s ew e r ei m p r o v e db y3 0 4 0 、2 5 6 4 、 2 4 8 7 r e s p e c t i v e l y t h ep a r a m e t e r so ff e r m e n t a t i o nw e r eo p t i m i z e da f t e r d e t e r m i n et h eg r o w t hc u r v eo fs t r a i nc - 7 ，i tw a sc o n c l u d e dt h a tt h eo p t i m a l t e m p e r a t u r eo fg r o w t hi s3 0 cw h i l et h ep h i sa r o u n d4 5 5 0 ，t h e r e a f t e rt h e o p t i m a lt e m p e r a t u r eo ff e r m e n t a t i o ni s3 3 。cw h i l et h ep h i sa r o u n d5 5 5 5 t h eb e s tf e r m e n t a t i o nr e s u l to fs t r a i nc 一7w a sa c h i e v e dw h e nt h es e e dl i q u i d w a sc u l t i v a t e df o r14h o u r sa n dt h ei n o c u l a t i o na m o u n tw a s8 s i n c e d i s s o l v e do x y g e ni sv i t a lt ot h ef e r m e n t a t i o nr e s u l t ，i n c r e a s i n gt h ed i s s o l v e d o x y g e nd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o ni sb e n e f i tf o rt h ep r o d u c t i o no fe t h a n 0 1 t h e y i e l do fe t h a n o lw a sg r e a t l yi m p r o v e dt o2 0 9 6e g la n dt h ep r o d u c t i o nr a t eh i t 8 7 3 6 ，t h et r a n s f o r m a t i o nr a t ei s0 4 19ge t h a n o l gs u g a rw h e nu s i n gt h e g a u z ea n dp l a s t i cm e m b r a n ed u r i n gf e r m e n t a t i o n ，m e a n w h i l et h ev i t a l i z a t i o n o fe t h a n o la l s oi n c r e a s e dab i t t h et r a n s f o r m a t i o nr a t ef r o m s u g a r t oe t h a n o li ns t a we n z y m e h y d r o l y s a t e f e r m e n t a t i o ni s0 38 3 0 g g i t w a sa l s of o u n dt h a tt h e f e r m e n t a t i o nr e s u l t so fs t r a wa c i dh y d r o l y s a t ea f t e rd i f f e r e n td e t o x i f i c a t i o n w e r eq u i t eu n l i k e t h et r a n s f o r m a t i o nr a t eo f x y l o s ed u r i n gf e r m e n t a t i o nw a s f o u n dh i g h e ra s0 2 8 0 3ge t h a n o l gx y l o s ei ft h eh y d r o l y s a t ew a sd i s p o s e db y c a c o s a st h ec o n c e n t r a t i o no fr e s i d u a ls u g a rw a ss t i l lh i g ha f t e r3d a y so f f e r m e n t a t i o n ，t h ey i e l do fe t h a n o lc o u l dy e tb ei n c r e a s e db ye x t e n d i n gt h e f e r m e n t a t i o np e r i o d k e y w o r d s ：x y l o s e ，e t h a n o l ，f e r m e n t a t i o n ，c o r ns t r a w ，s t r a i ns c r e e n i n g i v 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：睦墼日期： 神3 、参釜、况 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论 文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单 位属北京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公 布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名：垒垂 导师签名：喜拓止 日期：坦乞：竺：兰鱼 日期：华生， 第一章绪论 第一章绪论 半纤维素是一种较丰富的可再生资源，它可以在半纤维素酶系的作用下产生以木 糖为主的还原性戊糖类，进而在酵母菌的作用下转化形成乙醇。木糖一直被认为不能 被微生物发酵生产乙醇【l 】，直到1 9 8 0 年w a n g 等人发现木糖可被一些微生物发酵产生 乙醇 2 1 。在能源日益紧张的今天，富含纤维素和半纤维素的植物纤维资源是最有潜力 的乙醇生产原料，在植物纤维原料中，戊聚糖占2 0 - 3 0 ，在植物纤维水解液中，戊 糖占3 0 左右【3 】。因此戊糖乙醇发酵是决定植物纤维资源生产乙醇经济可行的关键之 一。然而针对目前发酵生产乙醇的菌种如乙醇酵母( s a c e h a r m y c e sc e r e u i s i a e ) ，仅可以 利用己糖发酵，而对戊糖( 如：木糖) 却不能利用；以及一些能发酵戊糖的酵母发酵木糖 的乙醇产率较低的问题，近年来，国内外掀起了研究的热潮。研究发现半纤维素经预 处理和酶解后都会产生混合糖，混合糖根据来源的不同包括木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、 甘露糖、海藻糖和鼠李糖 4 1 。尽管传统的酿酒酵母( s a c c h a r o m y e e sc e r e r i s i a e ) 和运动发 酵单胞菌( z y m o m o n a sm o b i l i s ) 可轻易将葡萄糖发酵为乙醇，但却不能将木糖和阿拉 伯糖发酵为乙醇，而管囊酵母( p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s ) 、树干毕赤酵母( p i c h i as t i p i t i s ) 和假丝酵母( c a n d i d i as h e h a t e ) 具有将木糖发酵为乙醇的能力例。 1 1研究木糖发酵产乙醇的意义 随着世界人口的增长和可利用土地的减少，粮食问题日益严峻，长期以来，粮食 一直是发酵制乙醇的主要原料。在国内，随着粮食价格的逐渐放开，以粮食为原料的 乙醇发酵工业成本剧增，生产难以为继，急需寻找能取代粮食的廉价原料。纤维素的 生物转化对解决当前世界能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有重要意义【6 j 。富 含纤维素和半纤维素的秸秆是最有潜力的乙醇生产原料 7 1 。它的组成一般为：纤维素 3 1 4 0 ，半纤维素3 5 - 4 8 ，木质素1 5 2 5 。我国每年产秸秆约6 3 亿吨，其 中以稻草、玉米秸秆、高梁秸秆、甘蔗渣、棉秆为主网。除少量用于造纸、建筑、纺 织等行业，或用作粗饲料、薪柴( 热效率仅为1 0 左右) 阴，另外很大一部分未能得到 充分利用，利用农作物秸秆为生产燃料乙醇的原料是重要的研究方向。经过多年的研 究，处理后的秸秆分成粗纤维和细小纤维两部分【l o l 。细小纤维部分的粗纤维含量大大 降低，木质素含量更是微乎其微，易于被微生物利用【1 1 1 。而细小纤维部分通过稀硫酸 水解处理后再经发酵法生产燃料乙醇，残渣干燥后制成生物蛋白饲料，可以达到农业 秸秆资源的综合利用【1 2 1 。细小纤维部分水解液的主要成分为己糖和戊糖，己糖转化为 乙醇的工艺已经较为成熟，而能同化戊糖的酵母大多不能发酵戊糖生产乙醇，能发酵 北京化工大学硕士学位论文 戊糖的酵母发酵木糖的乙醇产率较低，因此戊糖发酵是决定植物纤维资源生产乙醇经 济可行的关键因素之一【1 3 l 。因为木糖是植物纤维原料半纤维素戊糖的主要成分，所以 本实验选取木糖做碳源，主要研究木糖乙醇发酵菌种的选育，以期达到以木糖为原料 生产燃料乙醇，进而起到缓解能源危机和减少环境污染的作用，具有一定的经济效益 和社会效益。 乙醇是酵母菌发酵糖的重要产物之一。但乙醇在培养基中累积到一定浓度时，对酵 母菌细胞产生有毒效应。不同的酵母菌菌株对一定浓度的乙醇有不同的抗性，在不同培 养条件下和生长在不同的培养基中同一株酵母菌对一定浓度的乙醇也有不同的抗性 1 4 1 。最近几年有学者从自然界中分离到或通过遗传工程手段构建了一些能在短时间内 产生高浓度乙醇( 发酵液中的乙醇浓度达到1 7 5 ( v v ) 以上，普通酵母菌只能产生 9 1 1 ( v v ) 醇) 的酵母菌。因此研究酵母菌耐乙醇的生化机理对于提高发酵工业 的乙醇产量和弄清微生物抵抗不良环境生命机制有重要的实际和理论意义。1 1 5 q 9 1 1 2利用木糖发酵产乙醇的菌种 至今。人们发现能发酵木糖产生乙醇的微生物包括细菌、丝状真菌和酵母菌。细菌 能发酵的糖类物质较多，除了单糖外还能发酵纤维素、生物高聚糖等，但细菌发酵的 缺点是副产物多，乙醇得率低，同时，高p a 条件下的细菌发酵容易引起杂菌污染。 乙醇发酵能力最强的细菌是z y m o m o n a sm o b i l s ，但它只能发酵葡萄糖、果糖和蔗糖， 而不能发酵木糖。在具有戊糖发酵能力的菌种中，c l o s t r i d i u mt h e r m o h y d r o s u l f u r i c u m 3 9 e 发酵木糖的能力最强1 2 0 ，乙醇得率达0 3 9 9 g ( 乙醇消耗的糖) 。与细菌一样，真 菌不仅能发酵单糖，而且还能发酵二糖、纤维素和木聚糖，真菌的这种性质特别适合 于植物纤维原料的同步糖化发酵。在戊糖发酵的微生物中，酵母的戊糖发酵能力最强， 酒香酵母、休哈塔假丝酵母、产朊假丝酵母、嗜鞣管囊酵母、季也蒙毕赤酵母和树干 毕赤酵母能产生相对较大量的乙醇。能发酵木糖的酵母菌大致分为2 大类一类能在厌 氧条件下发酵木糖产生乙醇，如嗜鞣管囊酵母。另一类在发酵木糖时需有部分氧存在， 如产朊假丝酵母。这些菌株由于发酵速率慢以及产生大量副产物而不能应用于乙醇工 业生产。目前人们研究最多且最有工业应用前景的木糖发酵微生物有3 种酵母菌种， 即嗜单宁管囊酵母( p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s ) 、树干毕赤酵母( p i c h i as t i p i t i s ) 和休哈 塔假丝酵母( c a n d i d as h e c h a t a e ) 。它们的木糖发酵乙醇转化率和生产能力分别达 o 2 8 0 4 8 9 g ( 乙醇消耗的糖) 和0 0 2 0 6 6 9 ( l h ) 1 2 l - 2 2 1 。 1 3发酵机理 2 第一章绪论 酵母细胞内有若干条分解糖的途径，主要有厌氧条件的糖酵解途径( g l y c o l y t i c p a t h w a y ) 、有氧条件的三羧酸循环( t r i c a r b o x y l i c a c i dc y c l e ) 及利用戊糖及戊糖醇的己 糖单磷酸途径。酵母在有氧或无氧条件下，糖代谢途径中都要经过丙酮酸，因此，丙 酮酸是糖代谢的中心物质。在有氧条件下，丙酮酸通过三羧酸循环后彻底氧化；在厌 氧条件下，丙酮酸则形成乙醇与二氧化碳。因此，氧对酵母的生长速度与代谢途径的 影响至关重要。 1 3 1 乙醇发酵的机理 乙醇工业常采用酿酒酵母或卡尔酵母进行乙醇发酵，而酵母的发酵通常是通过 e m p 途径生成丙酮酸，然后丙酮酸脱羧成乙醛，在脱氢酶的作用下还原成乙醇。另外 有发现利用假丝酵母发酵d 木糖异构化代谢物d 木酮糖生产乙醇【2 3 l 。 1 3 2 微生物发酵六碳糖生产乙醇的代谢机理 利用产纤维素酶的微生物或纤维素酶先将纤维素水解成可发酵性糖，再利用酵母 将其发酵成乙醇。产纤维素酶的微生物有真菌、酵母菌和细菌。典型的真菌产纤维素 酶是由葡聚糖内切酶( e c 3 2 1 4 ，也称c x 酶) 、葡聚糖外切酶( e c 3 2 1 9 1 ，也称 c l 酶) 葡萄糖苷酶( e c 3 2 1 2 l ，也称c b 酶或纤维二糖酶) 3 个主要成分组成的诱 导型复合酶系。e c 和c b h 主要溶解纤维素，b c 主要将纤维二糖转化为葡萄糖，当 3 个主要成分的活性比例适当时，就能完成纤维素的降解阱】。纤维素大分子首先在c 1 酶和c x 酶的作用下逐步降解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成 葡萄糖。结晶纤维素是在c 1 酶和c x 酶的共同作用下分解；c 1 酶是从纤维素长链非 还原性末端，以纤维二糖为单位，切割d l ，4 糖苷键的外切酶1 2 5 j 。 葡萄糖经过e d 途径，发酵生成乙醇和二氧化碳。6 磷酸葡萄糖先脱氢产生6 磷 酸葡萄糖酸，后在脱水酶和醛缩酶的作用下，生成1 分子3 磷酸甘油醛和1 分子丙酮 酸。3 磷酸甘油醛随后进入e m p 途径转变成丙酮酸。1 分子葡萄糖经e d 途径最 后产生2 分子丙酮酸，以及净得各1 分子的a t p 、n a d p h 2 和n a d h 2 。 c 6 h 1 2 0 6 - 2 c 2 h 5 0 h + 2 c 0 2 3 北京化工大学硕士学位论文 图l - l 微生物发酵葡萄糖生产乙醇的主要代谢过程 f i g 1 一lt h em e t a b o l i z ep r o c e s so f 甜h a n o lf e r m e n t a t i o nb yg l u c o s e 1 3 3 微生物发酵戊糖生产乙醇的代谢机理 戊糖发酵机理的研究主要集中在微生物代谢木糖的机理研究上。木糖的异构化是 微生物木糖代谢的最初的生化反应 2 6 1 。木糖在微生物细胞中首先在木糖异构酶 ( x y l o s e i s o m e r a s e ) 作用下被转化成木酮糖，然后在木酮糖激酶( k i n a s e ) 的作用下转变成 磷酸木酮糖，继而进入磷酸戊糖循环，经过一系列的生物化学反应，最后生成乙醇和二 氧化碳等代谢产物。 木糖在不同微生物细胞中主要有两种途径被异构成木酮糖。绝大多数细菌和放线 菌是通过木糖异构酶一步完成的，木糖异构酶( 即葡萄糖异构酶) 需要m 9 2 + 、c j 2 + 、m n 2 + 等作辅基。而在真菌和酵母菌中，木糖通过二步氧化还原反应生成木酮糖：木糖首先在 木糖还原酶( x r ) 的作用下，被还原成木糖醇，木糖醇再在木糖醇脱氢酶( x d h ) 的作用 下，再转化成木酮糖。这二步反应需要辅酶i ( n a d + ，n a d h ) 或辅酶i i ( n a d p + , n a d p h 值) 的参与。 木酮糖继续磷酸化为5 磷酸木酮糖，然后经过磷酸戊糖途径，生成中间产物3 磷酸甘油醛和6 磷酸果糖。6 磷酸果糖可以加入磷酸戊糖途径，而3 磷酸甘油则经过 脱羧、还原等步骤，最后转化成乙醇：3 c 5 h 1 0 0 5 5 c 2 h 5 0 h + 5 c 0 2 4 第一章绪论 n a d f l r l l舳方 ：明翻茂栩嘲皇镪 3 确酸甘油醛 ：_ 黼黼 丙酮酸 l 丙期融爱璇誓 二 乙醛 上一 乙醇 图1 - 2 微生物发酵木糖生产乙醇的主要代谢过程 f i g 1 - 2t h em e t a b o l i z ep r o c e s so f e t h a n o lf e r m e n t a t i o nb yx y l o s e 因为酵母代谢木糖的过程中，部分木糖没有转化成乙醇而进行还原型辅酶 n a d p h 值的合成或转化成其它副产物。所以酵母代谢木糖的理论得率为o 4 6g 乙醇 g 木糖，低于葡萄糖乙醇发酵理论得率o 5 lg 乙醇儋葡萄糖。 1 4 影响乙醇发酵的因素 乙醇发酵是酵母等微生物生化活动和环境条件相互作用来完成的，在发酵生产过 程只有环境条件能够被人为地控制。影响木糖发酵的因素主要包括培养基成分的优 化、接种量、培养时间、环境p h 值范围、通气量以及对全部设备的特殊要求等。 1 4 1 温度幂口p h 值 为了减少杂菌感染的机会，发酵液温度尽可能的高，p h 值尽可能的低。在众多 戊糖发酵微生物中，细菌常为嗜温性的，生长和发酵温度可适当的高，但其要求环境 p h 值接近中性；而酵母可在偏酸性的环境中生长和发酵，但其要求环境温度不能太高。 事实上，当用酵母来发酵植物纤维水解液时，p h 值还得适当提高，由于在酸性条件 下，水解液中的醋酸对酵母生长和发酵的抑制作用加强。d u p r e e z 等人报道休哈塔假 丝酵母生长的最适p h 值为3 5 - 4 5 。当p h 值在2 5 6 5 之间变化时，休哈塔假丝酵母 5 北京化工大学硕士学位论文 c b s 2 7 7 9 和树干毕赤酵母c b s 7 1 2 6 的木糖发酵的乙醇产率变化很大，两者发酵的最 佳p h 是在4 5 5 5 之间。嗜鞣管囊酵母发酵木糖在3 0 - 3 7 c 的范围内，随着温度的增 加，木糖醇的产率显著降低，而乙醇的产率则几乎没有影响。温度不仅影响木糖发酵 的乙醇产率，同时影响酵母菌株的乙醇耐受能力。如休哈塔假丝酵母c b s 2 7 7 9 和树 干毕赤酵母c b s 7 1 2 6 在1 1 - 2 2 c 的范围内乙醇耐受能力达到最高。 1 4 2 产物和底物的抑制作用 菌株的乙醇耐受力是限制纤维素中木糖利用除温度之外的另一关键因素。菌株的 乙醇耐受力随菌种的不同而不同。同时受培养温度和碳源的性质的影响。如嗜鞣管囊酵 母在以葡萄糖为发酵底物时，两者的乙醇耐受力较发酵木糖时高得多 2 8 1 。因此，在培养 基中添加一定的葡萄糖有利于提高发酵木糖的菌株的乙醇耐受能力。 多数情况下，木糖浓度在1 0 0g l 或者更高时，所积累乙醇终浓度达到最高值。 然而当木糖浓度比较低时，乙醇比增长速率最大。木糖浓度达到4 0g l 或稍高时就抑 制树干毕赤酵母c b 5 5 7 7 3 的生长，但其乙醇得率却保持稳定，不随底物浓度的升高而 降低【2 7 】。 1 4 3 营养盐和氧气 微生物和其它生物一样，需要不断从外部环境中吸收所需要的各种物质，方能合 成本身的细胞物质和提供机体各种生理活动所需的能量。不同来源的发酵底物含有不 同的物质成分，不同微生物对营养成份的要求也不尽相同。 溶解氧浓度的控制，对于木糖酵母发酵尤为重要。对于管囊酵母pt a n n o p h i l u s ， 如果氧气供应过多，酵母大量繁殖，消耗掉底物糖，甚至同化部分乙醇；如果供氧不足， 将导致辅酶氧化还原不平衡，从而使木糖醇大量积累；只有合理地限制性供氧，才能使 底物尽可能地转化成乙醇。不同的酵母由于遗传基因的差别，对氧的需求量也不相同。 此外，酵母为了合成细胞原生质膜和线粒体中的聚不饱和脂肪以及类脂质，也需要少 量氧气。d e l l w e g 等人通过在线计算机控制o t r 值和检测光密度值来控制木糖发酵中 的需氧量。当氧的比速率为0 3 m m o l g 1 h - 1 时，乙醇产率达到最大值0 4 4 9 g - 1 。 l i g t h e l m 2 9 - 3 l 】等进一步证明木糖醇随氧气量的下降而增加。由于缺氧条件下不能使 n a d + 再生，加入电子受体则可以阻止木糖醇的产生，同时使乙醇生成量有所提高。 1 5 菌种选育 6 第一章绪论 微生物本身代谢戊糖的能力是决定植物纤维原料水解液戊糖发酵成败的关键。因 此，高糖利用率和高耐抑制物能力的戊糖发酵菌株的选育一直是这一领域的热门课 题。目前，戊糖发酵菌株的选育主要集中在四个方面： ( 1 ) 从自然界中继续筛选戊糖发酵菌种。张继泉等 3 2 1 直接利用酿酒酵母 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ek 将玉米秸秆水解液中的葡萄糖充分利用后的发酵液为戊糖 发酵液，筛选出一株性能优良的发酵戊糖酵母菌株，该菌株产乙醇能力相当于发酵戊 糖理论产量的6 0 o ，耐乙醇能力1 4 ( v v ) ，在温度高达4 2 的条件下仍能正常发 酵，初步鉴定该菌株为管囊酵母( p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s ) 。 ( 2 ) 采用定向培育技术，通过对已有菌株的长期驯化筛选从而得到所需菌株。 ( 3 ) 采用原生质体融合技术。树干毕赤酵母多需要在微好氧条件下发酵木糖产生 乙醇，其供氧条件难以精确控制【3 3 3 4 1 ，菌株的耐乙醇能力也较差，影响了其在实际生 产中的应用。工业上用的酿酒酵母能厌氧发酵葡萄糖，有较高的耐乙醇能力，可慢速 同化木糖，但不能发酵木糖产生乙醇。为了将毕赤酵母和酿酒酵母的优良性状融合起 来，获得既能有效地厌氧发酵木糖及葡萄糖和木糖的混合液，又有较高的耐乙醇能力 的酵母新菌株。毛华等【3 5 l 通过单倍体分离和紫外诱变，获得了1 4 株树干毕赤酵母 ( p i c h i as t i p i t i s ) 7 1 2 4 和酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 1 3 0 0 的营养缺陷型突变株。 用聚乙二醇( p e g ) 和电诱导融合及致死融合等方法，实现了树干毕赤酵母和酿酒酵母 的属间原生质体融合。融合子能发酵木糖产生乙醇，其厌氧发酵木糖和木糖一葡萄糖混 合液的能力明显优于亲株，耐乙醇的性能也比亲株树干毕赤酵母7 1 2 4 有所提高。 ( 4 ) 采用基因工程技术对发酵木糖菌株进行改良。针对木质纤维素发酵生产乙醇 中木糖不能被有效地转化成乙醇的问题，山东大学生命科学院微生物系的鲍晓明与瑞 典隆德大学应用微生物系m a t sw a l f r i d s s o n 等【3 6 l 合作以ec o l i & c e r e v i s i a e 穿梭质粒 y e p 2 4 为骨架，将树干毕赤酵母( p i c h i as u p i t i sc b s 6 0 5 4 ) 的木糖还原酶( x y l o s er e d u c t a s e x r ) 基因x y l l 及木糖醇脱氢酶( x y l o l i t o ld e h y d r o g e n a s ex d h ) 基因x y l 2 分别以不同 的相对表达方向置于酿酒酵母的乙醇脱氢酶i ( a d h l ) 启动子和磷酸甘油激酶( p g k ) 启 动子下，构建不同x y l l 及x y l 2 的重组质粒。这些重组质粒分别转化酿酒酵母( & c e r e v i s i a eh 1 5 8 ) 受体菌。得到的重组菌株表现出不同的基因表达水平，用这样的酵母 菌重组株进行木糖摇瓶发酵实验表明，x r f x d h 比值为0 0 6 的菌株，共消耗木糖3 2 5 g ，与x r x d h 比值高的菌株相比，不产生木糖醇，同时产生较少的甘油及乙酸盐等 副产物，但乙醇的产量却较高。鲍晓明等采用p c r 技术克隆c l o s t r i d i u m t h e r m o h y d r o s u l f u r i c u m 木糖异构酶基因x y la ，成功转移至酿酒酵母h 1 5 8 受体菌中， 7 北京化工大学硕士学位论文 得到重组酵母转化子h 6 1 2 ，实现了在酿酒酵母得到木糖异构酶的活性表达，为进一 步在酿酒酵母中建立新的木糖代谢途径打下了基础。山东大学的汪天虹等【3 7 】采用双载 体系统，将携带有瑞氏木霉木糖脱氢酶基因的表达质粒p a j 4 0 1 - x d h1 转化成已带有 树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因的重组酿酒酵母h 4 7 5 ，构建了同时带有毕赤氏酵母 木糖还原酶基因和瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母h x l 。 基因工程技术在戊糖发酵菌种的选育上得到了广泛的应用，构建了一批工程细菌 和工程酵母【3 8 枷j ，但是至今尚未出现重大突破，不过基因工程技术会在未来构建高得 率、高产率和耐高抑制物的戊糖发酵菌种的研究中起重要作用。 1 6 利用纤维素发酵生产乙醇 图l - 3 纤维素原料乙醇发酵流程 f i g 1 - 3t h ep r o c e s so fe t h a n o lf e r m e n t a t i o nf r o ml i g n o c e u u l o s i cb i o m a s s 近年来为达到降低乙醇生产成本，提高市场竞争力的目的，以植物纤维素类原料 代替淀粉质进行乙醇发酵已成为目前研究的热点。由纤维素类原料制乙醇的一般流程 如图1 3 。 1 6 1 纤维素类原料的组成和结构 木质纤维素纤维素原料主要是由纤维素、半纤维素和木质素构成的。表1 1 列出 常见的几种农业废弃物中生物纤维的化学组成【4 2 】。 纤维素：化学组成十分简单，是由肛一d l 砒喃型葡萄糖单体以卜l ，仁糖苷键 连接而成的线型结晶高聚物，聚合度很大( 通常由4 0 0 0 8 0 0 0 个葡萄糖分子串联起来，分 8 第一章绪论 子量达2 0 0 2 0 0 0 k d a ) 的直链多糖，其基本组成单位是纤维二糖，完全水解后得到葡 萄糖【4 3 】。这种连接方式使纤维素的近乎所有羟基及其它含氧基团，都同其分子内或相 邻的分子上含氧基团之间，形成分子内和分子链之间的氢键。这些氢键使很多纤维素 分子共同组成结晶结构，并进而组成复杂的基元纤维、微纤维、结晶区和无定型区等 纤维素聚合物的超分子结构。纤维素的特殊结构使纤维素酶分子很难靠近纤维素分子 内部的糖苷键进行有效的反应。纤维素的结晶部分比非结晶部分难分解得多1 4 5 】。 表1 - 1 农业废弃物中生物纤维的化学组成 t a b l e1 - 1c h e m i c a lc o m p o s i t i o no f b i o f i b e r sf r o ma g r i c u l t u r a lw a s t e s 半纤维素：在结构和组成上变化很大，般由较短( 聚合度小于2 0 0 ) 、高度分枝 的杂多糖链组成。常见的有木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露 聚糖等，多通过p l 4 糖苷键连接，含有五碳糖( 通常是d 木糖和l 阿拉伯糖) 、六碳 糖( d 半乳糖、d 葡萄糖和d 甘露糖) 和糖醛酸( d 葡萄糖醛酸) l 。各种植物纤维原料 的半纤维素链上连接着数量不等的甲酰基和乙酰基，其分支结构使半纤维素无定形 化，比较容易被水解成其组成的糖类。半纤维素的组成依原料的不同而有所差别。 木质素：是自然界最丰富的芳香族多聚物，由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接 的复杂的无定型高聚物。木质素虽然对纤维素的酶解反应没有损害作用，但它和半纤 维素形成牢固的结合层，紧紧地包围着纤维素，阻碍酶与纤维素的接触，从而降低反 应速率【4 7 4 8 】。 通过化学和生物化学的方法可将纤维素和半纤维素水解成单糖，继而发酵成乙 醇。天然纤维素水解产物为葡萄糖，半纤维素如木聚糖水解产物的8 5 - - 9 0 是木糖 【4 9 】。在木质纤维素的水解产物中，单糖的组成是葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿 拉伯糖，其中约三分之二为六碳糖，三分之一为五碳糖。 1 6 2 纤维素类原料的糖化 9 北京化工大学硕士学位论文 1 6 2 1 原料预处理 由于木质纤维素的组成成分复杂、稳定，使得其生物降解难于迅速进行。依据波 尔屯克模型，在秸秆类纤维素的微小构成单位周围被半纤维素，其次是木质素层的鞘 所包围。木质素虽然对纤维素分解物质( 如酶等) 反应没有阻碍作用，但它阻止纤维 素分解物对纤维素的作用，因此人们不得不借助化学的、物理的方法进行预处理【2 l l 。 目前，木质纤维原料的预处理方法包括物理法、物理化学法、化学法和生物法。 ( 1 ) 物理法 粉碎和碾磨可以降低结晶度；原料在3 0 0 以上的高温下，纤维素快速地分解成 气态物质和残余烧焦物。物理法处理的能耗较大。 ( 2 ) 物理化学法【5 0 - 5 1 】 蒸汽爆破 蒸汽爆破法是常用的木质纤维原料预处理方法。在此方法中，木片通过高压饱和 蒸汽处理，然后压力骤减，使原料经受爆破性减压而碎裂。蒸汽爆破法的典型反应条 件为：1 6 0 - - - , 2 6 0 ( 相应的压力为0 6 9 - 0 4 3 m p a ) ，作用时间为几秒或几分钟。在 蒸汽爆破过程中添加u 2 s 0 4 ( 或s 0 2 ) 或c 0 2 可以有效地促进酶法水解，降低阻碍 水解的化合物生成，使半纤维素脱除更加完全。 氨法爆破 a f e x 是另一种物理化学法，概念和蒸汽爆破法相似。在这种方法中木质纤维原 料在高温高压下暴露在液氨中一段时间，然后压力骤减。蒸汽爆破法使半纤维素溶解， 而a f e x 法则没有，a f e x 法预处理后原料的成分和初始原料几乎相同。 ( 3 ) 化学预处理 化学方法主要采用酸、碱、次氯酸钠、臭氧等进行预处理，并以氢氧化钠和稀酸 预处理研究得较多。稀酸( o 5 2 ) 水解是纤维素酶解前的一种有效的预处理方 法，可以在较温和的条件下进行，而且可以将半纤维素转化成单元糖。稀酸水解产生 一种络合物，大多数微生物的抑制剂。改进生物催化剂调整工艺过程以减少毒性物质 的存在，有望进一步提高乙醇的转化率。另外，酸解得能耗要比蒸汽爆破和氨爆破高。 ( 4 ) 生物法 木质纤维原料直接进行纤维素酶水解，糖得率很低，在2 0 以下。处理成本影响 很大，许多实验证明并非必须去除所有木质素，去除2 0 , - 6 5 的木质素就可以显著 地提高酶的可及性【5 2 1 。从原麦草、汽爆麦悬择分解木质素的微生物或酶进行天然纤维 素预处理的研究比较多，木材腐败菌能使木质素分子的侧链氧化和芳香环氧化裂解。 由白腐菌产生的木质素分解酶类主要有木素质过氧化酶、锰过氧化物酶和漆酶，可以 降解纤维原料中的木质素，提高纤维素的酶解效率。利用分离的酶进行预处理比直接 1 0 第一章绪论 利用微生物更加困难，因为无细胞的木质素降解酶可能是酶和辅酶的复杂混合物。 1 6 2 2 糖化过程 经过预处理的纤维素通过酸水解或酶解来糖化【5 3 1 。 ( 1 ) 纤维素的酸水解 主要有浓酸水解和稀酸水解两种处理方法。需要耐酸、耐压的设备，操作安全性 较低，投资也高。 纤维素在浓酸中的水解是均相水解。是纤维素晶体结构在酸中润胀或溶解后，通 过形成酸的复合物，再水解成低聚糖和葡萄糖。其流程为： 纤维素一酸复合物一低聚糖一葡萄糖 纤维素在稀酸中水解属多相水解，水解发生于固相纤维素和稀酸溶液之间。在高 温高压下，稀酸可将纤维素完全水解成葡萄糖。其流程为： 纤维素一水解纤维素一可溶性多糖一葡萄糖 ( 2 ) 纤维素的酶水解 用于生产纤维素酶的微生物菌种较多的是丝真菌，其中酶活力较强的菌种为木霉 属( t d c h o d e r m as p ) 、曲霉属( a s p e r g i l l u ss p ) 和青霉属( p e n i c i l l i u ms p ) 。应用最 广的纤维素酶生产菌是里氏木霉( t f i c h o d e r m ar e s s e i ) 的优良突变株【5 4 1 ，因为只有木霉 菌才含有完全水解天然纤维素所必须的纤维素酶的3 种组分。但里氏木霉常常存在b 葡萄糖苷酶活力较低的不足，导致纤维二糖积累，降低酶解效p 引。 纤维素酶是一种多组分的复合酶，主要有3 种组分：即内切型p 葡聚糖酶( e c 3 1 2 4 ，也称c x 酶，c m c 酶或e g ) ，外切型p 。葡聚糖酶( e c3