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含乳饮料中山梨酸苯甲酸糖精钠的含量测定前处理方法初探杨 洁 ,夏 虹 , 彭茂民 ( 湖北省农业科学院农业测试与科技信息中心 , 湖北武汉 430064)摘要 探讨含乳饮料中山梨酸 、苯甲酸 、糖精钠的 hplc 含量测定方法 ,在比较 5 种沉淀样品中蛋白质的方法后 ,确定以亚铁氰化钾与硫酸锌溶液为沉淀剂 ,采用 c18反相柱 ,以甲醇 :乙酸铵溶液(0. 02 mol/ l) = 1585 为流动相 ,紫外 230 nm 检测 ,结合保留时间及二极管阵列检测器( pda) 光谱分析信息定性 。添加水平为 60 mg/ kg 时山梨酸 、苯甲酸 、糖精钠的平均回收率范围为 92. 85 %98. 16 % ,变异系数小于 2. 7 % 。结果表明 ,该法简单 、快速 、灵敏 ,适用于含乳饮料中山梨酸 、苯甲酸 、糖精钠的含量测定 。关键词 山梨酸 ;苯甲酸 ;糖精钠 ;含乳饮料 ;前处理方法 ;高效液相色谱法文章编号 0517 - 6611 (2007) 25 - 07729 - 02中图分类号 o 656文献标识码 ainvestigation of pretreatment methods in determination of sorbic acid , benzoic acid and sodium saccharin in dairy drink by hplcyang jie et al ( center of agricultural test and scientific information , hubei academy of agricultural sciences , wuhan , hubei 430064 )abstract a hplc method for determination of sorbic acid ( sa) ,benzoic acid ( sb) and sodium saccharin ( sac) in dairy drink was studied. the compari 2 son of five methods of precipitating protein showed that the solution of potassium ferrocyanide and zinc sulfate as protein s precipitant was appropriate . the sample was analyzed on a c18 reversed2phase column with a mobile phase of methanol and ammonium acetate (1585 , v/ v) . the recovery of 60 mg/ kg sa , sb and sac was 92. 85 %98. 16 %. the variation coefficient was less than 2. 7 %. this method was simple , rapid , sensitive . and it could be usedin the determination of sa ,sb and sac in dairy drink.key words sorbic acid ; benzoic acid ; sodium saccharin ; dairy drink ; pretreatment method ; hplc配制成标准混合溶液 ,浓度分别为 sa 、sb 15g/ ml 左右 , sac25g/ ml 左右 。1. 3 色谱条件 色谱柱 : phenomenex luna c18柱 5m ,4. 6 mm250 mm ;检测波长 :230 nm ;流动相 ;meoh :0. 02 mol/ lnh4ac= 1585 ( v/ v) ;流速 1. 0 ml/ min 。将 1. 2 所配标样混合液进 样 5l ,色谱见图 1 。添加到食品和饮料中的防腐剂是防止或阻断引起食品腐败的微生物生长的一类物质 。山梨酸 ( sorbic acid ,sa) ,苯 甲酸 (benzoic acid ,sb) ,常作为防腐剂 ,糖精钠 ( sodium saccha2rin ,sac) 作为甜味剂广泛用于食品中 。但添加过量防腐剂 ,不仅能破坏维生素 b 还能使钙形成不溶性物质 ,影响人体对钙 的吸收 ,同时对人的胃肠有刺激作用 。过量食用还可引发癌症1。因此国家 对 其 使 用 都 有 明 确 的 限 量 标 准 和 检 测 方法2 - 3。国家标准中只规定了汽水 、果汁类 、酒类饮料品中sa ,sb ,sac 的测定方法 ,用氨水将样品调至中性 ,过滤后直接用于 hplc 测定 ,其处理方法不适用于蛋白质含量高的奶制 品和乳制品 。含乳饮料中除含大量蛋白质外 ,还有稳定剂 , 增稠剂等 ,用 hplc 法测定这类样品中的 sa ,sb ,sac ,样品前处理是一重要及难度较大的问题 ,因此寻求适宜 ,通用 ,简便 的前处理方法是许多技术人员多年来致力的目标 。常用的方法有 : 用乙醚 石油醚液液萃取4 ; 用乙醚提取 ,再用 碳酸氢钠溶液反提5 ; 乙酸锌一亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白注 :1 为 sb ,2 为 sac ,3 为 sa 。下同 。图 1 山梨酸 、苯甲酸 、糖精钠标样 lc 色谱图1. 4 样品的前处理 称取样品 5 g 左右 (精确至 0. 01) 于50 ml 比色管中 ,加入纯水 20 ml ,摇匀 ,加入亚铁氰化钾 (150 g/ l) 溶液 5 ml ,摇匀 ,放置 5 min ,加入硫酸锌 (300 g/ l) 溶液 5ml ,混匀 ,纯水定容至 50 ml ,振荡使其充分混匀 ,静置 15 min ,上清液过滤 ,弃去初滤液 ,滤液经 0. 45m 滤膜过滤 ,供 hplc检测 。2 结果与分析2. 1 蛋白质沉淀剂的 选 择以 含 山 梨 酸 、苯 甲 酸 浓 度 为0. 050 g/ kg ;糖精钠的浓度为 0. 100 g/ kg 的模拟乳饮料作为样 品 i 分别使用无水乙醇 ;5 %硫酸铜 ;20 %硫酸铜 - naoh 氢氧化钠 ;10 %钨酸钠 ;5 %高氯酸 ; 亚铁氰化钾 (150 g/ l) 与硫酸锌 (300 g/ l) 溶液为沉淀剂来沉淀蛋白质 。由表 1 可知 ,用亚 铁氰化钾 (150 g/ l) 与硫酸锌 (300 g/ l) 溶液来沉淀蛋白质时间短 ,蛋白质沉淀完全 ,沉淀后的溶液用定量滤纸过滤 ,滤液 清澈透明 ,可直接进样测定 ,模拟样品 i ,色谱见图 2 。2. 2 最佳色谱条件的确定 甲醇与乙酸铵溶液的不同比例质1质6; 将 样 品 用 1 1 氨 水 调 ph = 7 , 再 用 乙 醇 沉 淀 蛋 白; 先用 naoh 溶液处理样品 ,再用 20 %硫酸铜沉淀蛋白质7 。笔者用几种方法分别处理含乳饮料 ,对处理效果及hplc 测定条件进行研究 。1 材料与方法1. 1 仪器与试剂waters 高效液相色谱仪 :配置 510 泵 , 717自动进样器 , 996 二极管阵列检测器 ( pda) ,millenium 32 色谱工作站 。山梨酸 (sa) ; 苯甲酸 ( sb) ; 糖精钠 ( sac) 均为 sigma公司产品 ,甲醇 :色谱纯 ,其余试剂均为分析纯 。1. 2 标准溶液的配制1. 2. 1 标准溶液储备液 。分别准确称取 sa 、sb 、sac 标样各10 mg 左右 (准确至 0. 01) ,sa 、sb 用碳酸氢钠 (20 g/ l) 溶解 ; sac 用水溶解 ,用水定容至 25. 00 ml 。作为标准溶液储备液 。1. 2. 2 标准溶液使用液 。分别取各标准储备液适量 ,用水作者简介 杨洁 (1969 - ) ,女 ,湖北武汉人 ,助理研究员 ,从事 hplc 领域内的新方法开发及应用 。收稿日期 20072012187730安徽农业科学2007 年表 16 种蛋白质沉淀剂的沉淀结果( n = 3)标准溶液使用液依次进样 1 、2 、3 、5 、10 、15l ,以山梨酸 、苯甲酸 、糖精钠混合标样进样量 x (g) 与峰面积 y 作线性回归 。 标准曲线见图 4 。沉淀时间min蛋白质沉淀剂滤液状态无水乙醇5 %硫酸铜20 %硫酸铜 - naoh 氢氧化钠10 %钨酸钠5 %高氯酸亚铁氰化钾 (150 g/ l) 与硫酸锌 (300 g/ l)60201515155滤液浑浊滤液微浑 滤液微浑滤液微浑 滤液微浑 滤液澄清图 4 山梨酸 、苯甲酸 、糖精钠标准曲线回归方程 分 别 为 sb : y = 3. 36 106 x - 2. 11 104 , r =0. 999 98 ;sac : y = 1. 88 106 x - 2. 09 104 , r = 0. 999 4 ; sa : y =7. 09 106 x - 2. 25 104 , r = 0. 999 8 。在试验色谱条件下 ,山梨酸 、苯甲酸 、糖精钠浓度与其色 谱峰峰面积有着很好的线性关系 ,线性范围山梨酸 、苯甲酸为 15320 ng ,糖精钠为 25534 ng 。2. 4 精密度的测定 按试验选定的色谱条件 ,对 3 种市售 乳饮料样品进行含量测定 ,考察方法的精密度 ,结果见表 2 。图 2 模拟样品 i 色谱图对色谱分离的影响 。山梨酸 、苯甲酸 、糖精钠在液相色谱的 出峰次序很有特点 ,试验表明 ,在流动相中甲醇 :乙酸铵溶液(0. 02 mol/ l) 为 1585 时 ,出峰的次序是苯甲酸 、糖精钠 、山梨 酸 ;当甲醇乙酸铵溶液 (0. 02 mol/ l) 为 595 时 ,出峰的次序是苯甲酸 、山梨酸 、糖精钠 ;甲醇乙酸铵溶液 (0. 02 mol/ l) 为2575 时 ,出峰的次序是糖精钠 、苯甲酸 、山梨酸 。不同色谱 条件下分离效果见图 3 ,因此 ,当流动相中甲醇乙酸铵溶液(0. 02 mol/ l) 为 1585 时 ,分离最好 ,保留时间合适 。表 2样品中山梨酸 、苯甲酸 、糖精钠及精密度测定( n = 5)sa mg/ kgsb mg/ kgsac mg/ kgrsd %ad 钙奶优酸乳活性乳91. 81n. d n. dn. d n. d80. 2653. 6953. 14n. d1. 52. 31. 92. 5 加标回收率测定按试验选定的色谱条件 ,用 ad 钙奶进行加标回收率测定 ,考察方法的准确性 ,测定结果见表 3 。表 3加标回收率结果( n = 5)加入量 本底值 理论值 平均测定值 平均回收率变异系数%gggg%sa 350. 4sb 380. 8604. 8n. d955. 2380. 8910. 3373. 895. 3098. 161. 61. 9 sac 278. 8 353. 7 632. 5 587. 3 92. 85 2. 7 2. 6 方法检出限 在试验条件下 ,当试样称样量为 2. 00 g ,定容到 50 ml ,进样量为 20l ,山梨酸 、苯甲酸 、糖精钠检出限 为 0. 1 mg/ kg ,结果的相对标准偏差小于 2. 5 %。3 结论试验测定含乳饮料中山梨酸 、苯甲酸 、糖精钠的含量 ,在 比较了 6 种 蛋 白 质 沉 淀 剂 的 基 础 上 选 用 亚 铁 氰 化 钾 ( 150g/ l) 与硫酸锌 (300 g/ l) 沉淀溶液样品中的蛋白质 ,使蛋白质 沉淀完全 ,滤液清澈透明 ,排除了大部分干扰物质的影响 ,运用二极管阵列检测器 ,能进行光谱分析及峰纯度检测 ,弥补 了单靠保留时间定性的局限 ,保证了检测结果的正确 、可靠 。该方法快速 、灵敏 、精密度及准确度在允许范围内 ,可用于乳 饮料中以上 3 种成分的含量测定 。参考文献注 :a 为 1585 ,b 为 595 ,c 为 2575 。图 3 不同条件的色谱2. 3 标准曲线及回归方程 在试验色谱条件下 ,将所配的1祝伟霞 ,魏蔚 ,杨冀州 ,等. 高效液相色谱法测定乳饮料和奶制品中苯甲酸和山梨酸j . 中国国境卫生检疫杂志 ,2005 ,28 (5) :280 - 281.(下转第 7753 页) 1994-2014 china academic journal electronic publishing house. all rights reserved. 35 卷 25 期黄宏伟等 rp - hplc 法测定茶叶中绿原酸和没食子酸含量的研究7753表 1不同来源的茶叶样品中绿原酸和没食子酸含量mg/ g编号来源没食子酸含量绿原酸含量1234湖北三峡绿茶广西灵山碧螺春 福建安溪铁观音浙江西湖龙井0. 5940. 5220. 4621. 2430. 3410. 6830. 1320. 201 5 河南信阳毛尖0. 327 0. 110 2. 6 加样回收率试验准确称取已知绿原酸和没食子酸含量并且干燥至恒重的浙江西湖龙井茶叶 5 份 ,分别加入适量的绿原酸和没食子酸对照品 ,制备样品溶液 ,测定样品中绿 原酸和没食子酸含量 ,计算回收率 。结果表明 ,绿原酸的平均加样回收率为 99. 7 % , rsd 为 1. 8 % ;没食子酸的平均加样回收率为 98. 6 % , rsd 为 2. 1 %。2. 7 样品含量测定 准确吸取待测样品溶液 10l ,注入高效 液相色谱仪中 ,测定绿原酸和没食子酸色谱峰面积 ,采用外标标准曲线法计算样品中绿原酸和没食子酸的含量 。表 1 表明 ,5 种绿茶中绿原酸含量范围大致为 0. 3271. 243 mg/ g ,没食子酸含量范围为 0. 1100. 683 mg/ g 。其中 ,浙江产西湖龙井茶中绿原酸含量最高 ,而广西产灵山碧螺春 中没食子酸含量最高 。3 讨论hplc 法定量分析以保留时间定性 ,以峰面积定量 。但 是由于色谱方法的定量能力强而定性能力弱 ,对于成分复杂的中药样品来说 ,往往有不同的组分在同一时间或极相近的 时间出峰 ,甚至两个组分完全叠加 ,因而只用保留时间定性可能会造成分析结果产生意外误差 。二极管阵列检测器可 以同时在设定波长区域内的各波长下进行立体数据采集 ,既可以观察各波长下的色谱图 ,又可以观察各时间下的光谱 图 。在比对保留时间的基础之上 ,加以光谱确认 ,就可以克服仅以保留时间一项指标定性的缺点 ,增强了定性的确定 性 。采用高效液相色谱 ,以外标法同时测定茶叶中绿原酸和没食子酸的含量 ,方法准确 、快速 、灵敏 、重现性好 、定性能力 强 ,可用于茶叶的质量评价和控制 。参考文献注 :1 、2 分别表示没食子酸和绿原酸 。下图同 。图 2 对照品的色谱分离图 3 茶叶样品的色谱分离2. 3 线性关系考察 准确量取绿原酸和没食子酸对照品储 备液 0. 1 、0. 2 、0. 4 、0. 6 、0. 8 、1. 0 ml 于 5 ml 量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀 。分别进样 10 l ,以峰面积 ( a ,v/ s )度 (, g) 进行线性回归 ,得绿原酸回归方程为 :a = 1. 65 105 + 2. 35 103 ( r = 0. 999 8)没食子酸回归方程为 :a = 2. 11 105+ 2. 47 103 ( r = 0. 999 6)对质量浓(1)(2)这表明当绿原酸进样量为 0. 0920. 920 g ,没食子酸进样量为 0. 075 60. 756 0 g 时 ,回归方程具有良好的线性 关系 。2. 4 精密度试验 准确吸取绿原酸和没食子酸对照品混合溶液 10l 进样 ,重复 5 次 ,测得绿原酸峰面积 rsd (相对标准 偏差) 为 0. 6 %( n = 5) ,没食子酸的峰面积 rsd 为 0. 7 %( n =5) 。这表明仪器的精密度良好 。2. 5 重现性试验 准确称取浙江西湖龙井茶叶样品 5 份 ,每份约 3 g ,制备样品溶液 。准确吸取 10l 混合溶液进样分 析 ,测得绿原酸峰面积的 rsd 为 1. 1 % ( n = 5) ,没食子酸峰面积的 rsd 为 1. 7 %( n = 5) 。这说明方法重现性好 。1周燕波 ,陈启荣 ,徐光耀. 茶叶成分及其医疗价值j . 中国中医药信息杂志 ,1991 ,4 (11) :16 - 18.程启坤. 茶化浅析m. 杭州 :中国农业科学院茶叶研究所情报资料研究室