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国家自然科学基金申请书 2008版申请代码：c140303受理部门： 收件日期：受理编号：第 40 页 版本1.003.381国家自然科学基金申 请 书(2008版) 您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是word2000或以上版本用户，请把word宏的安全性设为:中 方法: word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 (如果您是word97用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了资助类别：面上项目亚类说明： 附注说明： 项目名称：血红素加氧酶-1介导th17细胞在哮喘气道炎症中的免疫调节作用申 请 者：夏振炜 电话：依托单位：上海交通大学 通讯地址：上海市卢湾区瑞金二路197号 邮政编码：200025 单位电话82 电子邮件： 申报日期： 2008年1月25日国家自然科学基金委员会基本信息ykkr4ohp申 请 者 信 息姓名性别男出生年月1963年7月民族汉族学位博士职称研究员主要研究领域气道炎症免疫调节 电电子邮件 传真 个人网页 工作单位上海交通大学 /医学院附属瑞金医院在研项目批准号30570798 依托单位信息名称代 码20003001 联系人张艳 电子邮件 电82 网站地址 合作单位信息单 位 名 称代 码00000000 项 目 基 本 信 息项目名称资助类别面上项目 亚类说明 附注说明 申请代码c140303:炎症c1705:儿科学基地类别 预计研究年限2009年1月 2011年12月研究属性应用基础研究 申请经费34.0000万元摘 要(限400字)：目前认为支气管哮喘是以th2分泌的细胞因子所致炎性细胞浸润为主的慢性气道炎症。近年研究发现，一类新的th细胞亚群-th17，具有调控th1和th2的作用。th17主要分泌il-17，迄今发现有6种亚型（il-17a-f）。在哮喘气道炎症中，il-17a/f可促发中性粒细胞性炎症，而il-17e能促进th2反应，诱导并激发嗜酸性粒细胞性慢性炎症，但具体机制尚未阐明。血红素加氧酶-1（ho-1）是血红素代谢的限速酶，作为保护蛋白，具有抗氧化应激和抗炎作用。课题组最近研究表明ho-1高表达后可明显减轻气道炎症和气道高反应性；预实验显示：经血红素诱导ho-1表达可影响il-17分泌。因此本课题设想通过th17培养和构建小鼠哮喘模型，分析血红素干预前后th17及其分泌的细胞因子il-17变化，探讨ho-1、th17和哮喘三者关系，阐明ho-1抗炎作用机制并提供临床防治新思路。关 键 词(用分号分开，最多5个)血红素加氧酶-1；th17；白介素-17；哮喘；炎症 项目组主要成员（注: 项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）11964-02-01 男副教授博士oregon health and science university （53）494-8188 课题设计实验指导 4 21974-12-08 男主治医师硕士上海交通大学 细胞培养细胞因子测定 4 31983-03-12 女博士生学士上海交通大学 动物造模细胞因子测定 8 41982-09-15 女硕士生学士上海交通大学 细胞鉴定与功能检测 8 51977-06-01 男博士生硕士上海交通大学 细胞培养因子测定 6 61978-09-09 女主治医师硕士上海交通大学 实验指导 4 71957-05-29 女技师其他上海交通大学 细胞培养 6 89总人数高级中级初级博士后博士生硕士生8221021说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。经费申请表 （金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费25.90001.科研业务费7.9000（1）测试/计算/分析费3.0000western blot、elisa、real-time pcr等测试（2）能源/动力费1.7000水、电、煤费用，按5%计（3）会议费/差旅费2.0000参加国际、国内会议（4）出版物/文献/信息传播费1.2000文献检索、论著发表费（5）其它2.实验材料费18.0000（1）原材料/试剂/药品购置费18.0000质粒构建，t细胞分离纯化柱、分离kit、试剂盒、balb/c和do11.10小鼠（2）其它3.仪器设备费0.0000（1）购置（2）试制4.实验室改装费5.协作费二.国际合作与交流费3.00001.项目组成员出国合作交流2.境外专家来华合作交流3.0000邀请协作者来华交流路费和住宿费三.劳务费3.4000研究生劳务费四.管理费1.7000组织实施费，按5%计合 计34.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）5.0000其他经费来源合计5.0000报告正文（一）立项依据与研究内容：1. 项目的立项依据支气管哮喘是最常见的呼吸道慢性炎症性疾病之一，随着生活水平不断提高及生活方式西方化，该病呈不断上升趋势，成为危害人类身体健康的主要疾病之一，给社会带来巨大的经济负担。支气管哮喘因长期、反复慢性炎症可导致气道重塑，严重影响肺功能，因此阐明其发病机制并早期、有效的控制哮喘气道炎症是临床与科研丞待解决的问题。支气管哮喘发病机制十分复杂，涉及肺组织中抗原递呈细胞、树突状细胞、t辅助细胞（t help cells, th）和调节性t淋巴细胞（regulatory t cells, treg）及其相互作用。目前认为过敏原促进初始th0细胞向抗原特异性th2细胞定向分化，建立以th2细胞占优势的t细胞免疫应答反应，导致th1/th2比例失衡。th2分泌细胞因子如白介素（interleukin, il）-4、-5和-13等，一方面进一步促进th0细胞向th2细胞分化，另一方面作用于b淋巴细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞（eosinophil, eos），诱发以eos浸润为主的慢性气道炎症和气道高反应性（哮喘的两个重要特征）。在慢性气道炎症的基础上，又因过敏原暴露及感染等诱因导致中性粒细胞和单核细胞在肺部大量募集，产生大量氧自由基，引起哮喘急性加重1-3。而哮喘的反复急性发作和气道慢性炎症持续状态则导致气道结构破坏与修复交替反复，引起平滑肌增生，最终导致气道重塑。但研究发现，一类新的th细胞亚群th17细胞，在哮喘气道炎症的发生发展中起重要作用。th17细胞是新近提出的一类独立的th细胞亚群，不同于th1（分泌ifn-g和tnf-a）和th2（分泌il-4、il-5和il-13）细胞，因分泌il-17而命名，又称为产生il-17的效应性t淋巴细胞（il-17 producing effector t cells）。该类细胞分泌的细胞因子能够趋化中性粒细胞、单核细胞等，促进炎症的发生，在自身免疫性疾病中起着主导作用，故成为目前研究的热点4-6。关于th17细胞的起源、分化尚未明确，目前认为th17起源于初始th0细胞，在tgf-、il-6的协同作用下分化为th17细胞7-9， 其中il-23对维持并扩增该细胞亚群具有重要作用，而il-4和ifn-g协同作用可抑制th17分化4（图1），新近研究表明il-27亦可抑制th17分化10。图1 th17细胞分化示意图th17细胞以cd4+ t细胞为主，又称为细胞毒性t细胞抗原8（ctla-8）11，主要通过分泌il-17发挥作用4，其中人il-17为同源二聚体蛋白，其氨基酸序列与松鼠猴疱疹病毒的开放阅读框（hsvs13）有58 %的同源性。迄今il-17家族已发现6种亚型（il-17a-f），分泌的il-17由2个32 kda同源二聚体构成。th17细胞分泌的il-17主要为il-17a和il-17f（il-17a/f）。体内il-17通过与细胞膜上il-17受体（il-17r）结合而发挥作用。il-17r是一种型跨膜蛋白，含864个氨基酸，在气道上皮细胞、人表皮成纤维细胞、人胚肾细胞、b细胞、髓单核细胞、cd56+外周血nk细胞、外周血单个核细胞上均有表达，而il-17a/f主要与il-17ra受体结合4,12，可激活3条经典map激酶信号传导途径，包括erk1、erk2、jnk和p38，引起il-6和il-8的分泌，从而导致中性粒细胞在局部的募集，包括浸润气道引发哮喘。il-17还可触发nf-kb，导致t细胞增殖，并上调众多炎症介质基因如nos和il-1b等的表达，亦可促进粒细胞生成因子分泌，导致骨髓、脾脏中粒细胞数量增加4,12-14。因而在众多炎症如哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎及实验性自身免疫性脑炎等，il-17表达显著升高 15。进一步研究发现，先前认为由th1细胞造成的免疫性疾病实际由il-17所致，而且il-17在过敏性疾病中的作用亦逐渐被认识。因此，il-17在哮喘中的作用愈来愈受到重视。一方面，il-17可协同趋化中性粒细胞和单核细胞募集的细胞因子il-8、gro、gcp-2和刺激骨髓粒细胞增生的细胞因子il-6、gsf、gm-csf和诱导单核细胞的il-1b和tnf-a等作用，促进中性粒细胞、单核细胞生成并在肺部募集，增强其功能和生存时间，引起肺部炎症（图2）。研究发现在图2 th17细胞在气道炎症中的作用哮喘急性发作和哮喘职业病，中性粒细胞起了重要作用。因而认为il-17a/f参与了以中性粒细胞浸润为主的哮喘发生1,3。在过敏性哮喘动物模型中，naruhito等16采用分子克隆技术，体外构建小鼠pcdnamil-17f质粒，并将其导入ova致敏小鼠肺组织中，结果发现在ova激发后支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，balf）内中性粒细胞和单核细胞显著增加，小鼠对乙酰胆碱的气道反应性明显增高，粘蛋白基因表达增强；peter等17对ova致敏小鼠经il-17抗体干预后发现balf内中性粒细胞显著减少，提示il-17a/f参与了由过敏原诱导的气道高反应性。但il-17a/f对引起气道慢性炎症的主要炎症细胞eos则具有相反的作用。研究发现，通过质粒转染诱导il-17基因在局部高表达或局部给予重组il-17蛋白后，随着中性粒细胞的增加，eos并未增加甚至减少，而给予il-17单克隆抗体后随着局部中性粒细胞的减少，balf及骨髓中eos却显著增加，血清及balf中il-5显著升高15-17。最新研究报道：il-17e能促进th2反应，诱导并激发eos性慢性炎症，因此il-17e与以eos浸润为主的气道炎症和气道高反应性密切相关，但th17是否分泌il-17e有待进一步明确。在过敏性哮喘患者和动物模型的血、痰液和balf中，il-17 mrna与蛋白含量均显著升高。silvia等18采用il-17r基因剔除小鼠建立哮喘模型，发现il-17r缺陷小鼠气道炎症明显减轻，balf中eos减少，血清抗原特异性ige水平降低，体外肠系膜淋巴细胞培养并经特异性抗原刺激后il-5产生减少，提示il-17又与哮喘严重程度呈正相关15-19。血红素加氧酶（heme oxygenase, ho）是哺乳动物和人体内血红素代谢途径中的限速酶，将血红素四吡咯环上的甲基桥裂解，最终形成等量的胆绿素及co并释放铁原子。随之，胆绿素经胆绿素还原酶作用形成胆红素。目前发现ho有三种同工酶，为不同基因产物：即诱导型ho-1，组成型ho-2及新近发现的异构体ho-3。三种同工酶的氨基酸序列和诱导性各异，但具有共同的催化底物反应机制和反应产物。ho-1分子量为33 kda，由288个氨基酸构成，为热休克蛋白32（hsp32）。血红素，金属元素，氧化应激，紫外照射，化合物，高温，某类药物，还原型谷胱甘肽等均能诱导ho-1，分布在肝脏、脾脏、肺脏等组织。ho-2由361个氨基酸构成，分子量为36 kda，ho-2不受外因诱导，在脑和睾丸中浓度最高。ho-3是一个约2.4 kb的单一转录产物，分子量约33 kda，分布在脾脏、肝脏、胸腺、前列腺、心脏、肾脏、大脑和睾丸组织中。ho-3类似于ho-2，但催化活性极低。与ho-1、ho-2相比， ho-3代谢血红素的能力较弱，推测可能对血红素依赖性的反应过程有调节作用。至今ho-3生理功能尚未明确，相关的研究报道亦甚少。大量基础和临床实验证明ho-1作为保护蛋白，表达后具有抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡和抗平滑肌增生等重要功能20-24，在许多疾病如支气管哮喘22-24等中发挥其保护作用，其在多种疾病中的潜在治疗意义也越来越受到重视25,26。新近研究发现ho-1抗哮喘气道炎症作用主要表现为：减少炎症细胞在局部的浸润。研究表明，上调ho-1表达可以抑制单核细胞浸润。抑制促炎因子如tnf-a、il-1、mip-1、gm-csf的产生27,28。此类因子相互作用，募集众多炎性细胞，进而又促使各种炎性介质、细胞因子释放，使气道炎症加剧，触发并放大炎症效应；而ho-1通过抑制前炎症因子释放从而阻断这一重要环节，起到抗炎作用。促进抗炎细胞因子il-10的释放，抑制th2细胞因子的分泌和ige的产生，促进eos凋亡和减轻抗体介导的eos炎症29。稳定肥大细胞，抑制肥大细胞脱颗粒及白细胞粘附于血管内皮上。抑制粘附分子在血管内皮细胞上的表达。almolki发现在卵清蛋白（ovalbumin, ova）诱导的豚鼠哮喘模型经血红素（hemin）上调ho-1基因表达则明显减轻气道炎症反应；反之，用ho-1抑制剂锡-原卟啉（sn-protoporphyrin, snpp）后则逆转该反应22。另有报道显示ho-1和co能抑制平滑肌增生，阻止气道重塑。但ho-1通过何种细胞发挥免疫调节作用至今未见确切的报道。课题组近期的研究结果显示：在ova致敏、激发的哮喘小鼠，经hemin上调ho-1表达后，肺脏和脾脏中foxp3 表达及蛋白量增加，血清il-10增高，而ova特异性ige水平降低，肺脏病理组织学检测、balf中细胞总数和eos计数均显示炎性细胞尤其是eos浸润减少；cd4+cd25+ treg功能抑制试验发现，ova致敏、激发balb/c小鼠经hemin干预后，抑制作用显著增加；snpp能逆转ho-1作用。il-10剔除的b6.129p2-il10tm1cgn/j小鼠treg抑制作用经hemin干预后仍未改善。研究表明：ho-1可能经诱导cd4+cd25+ treg 特异性转录因子foxp3表达，激活cd4+cd25+ treg，促进il-10分泌，以拮抗哮喘气道炎症23,24；预初实验同时显示：体内经hemin诱导ho-1高表达后能明显降低由抗cd3/cd28抗体刺激后脾细胞分泌il-17，而单独或加用snpp后il-17分泌增加，提示ho-1在体内具有先前未知的抑制il-17的免疫调节作用（图3），但具体机制尚需进一步探讨。此外我们已建立了小鼠哮喘动物模型，免疫斑联（elispot）方法测定il-17表达，掌握了应用ova多抗原肽（multiple antigenic peptide, map）免疫小鼠来获得大量ova特异性th17细胞，并通过尾静脉注射进行细胞移植，结果详见工作基础。为本项目的开展奠定了基础。图3 hemin抑制体内抗原非特异性il-17分泌鉴于ho-1和th17细胞在支气管哮喘中的作用，结合我们前期工作基础，我们认为ho-1可能介导了th17细胞分泌不同il-17亚型，并在哮喘发生、发展中发挥作用。本项目拟在ho-1表达干预前后，通过体外分离、培养ova抗原特异性th17细胞，观察ho-1对th17细胞和il-17等细胞因子的影响；并建立ova致敏、激发的babl/c小鼠哮喘模型，采用细胞荧光标记技术标记th17细胞，th17细胞回输ova致敏后的babl/c小鼠，通过免疫荧光、流式细胞分析技术研究th17细胞在哮喘动物模型中的作用，探讨ho-1、th17细胞和哮喘气道炎症三者关系，阐明ho-1抗炎作用机制并提供临床防治新思路 （图4）。图4 ho-1与th17细胞作用示意图参考文献1 richard m, effrosa, hari nagarajb. asthma: new developments concerning immune mechanisms, diagnosis and treatment. current opinion in pulmonary medicine 2007,13:37-432 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对ho-1表达干预，探讨ho-1、th17细胞和哮喘气道炎症三者关系，阐明ho-1抗炎作用机制并提供临床防治新思路。研究目标通过本项目研究阐明th17细胞及其分泌的il-17不同亚型在哮喘发生发展中的作用；干预ho-1表达以进一步阐明ho-1是否介导th17细胞分泌il-17拮抗哮喘发生；在此基础上进一步探讨其作用机制，为早期、有效控制哮喘气道炎症提供新的理论依据。拟解决的关键科学问题尝试通过体外培养th17细胞和体内小鼠哮喘模型建立，阐明ho-1 调抑th17细胞及其分泌的il-17，控制支气管哮喘的发生发展，为阐明该病产生机制和临床防治提供新思路是本项目要解决的关键科学问题。3. 拟采取的研究方案及可行性分析研究方法一、体外实验1ova特异性th17细胞制备和培养采用100 g ova 323-329肽段的mpa-ova（由合作者 提供）免疫do11.10小鼠（基因背景为balb/c小鼠，上海斯莱克实验动物有限责任公司），持续2天，分离正常和免疫小鼠胸腺细胞，加5 ng/ml tgf-、10 ng/ml il-6和10 ng/ml il-23培养4872 h。加入fitc标记的抗小鼠cd4抗体和apc标记的il-17a抗体（ebioscience公司），荧光显微镜下观察cd4+il-17+细胞。2干预ho-1表达对th17细胞和il-17等细胞因子的影响设对照组、ova组、ova+hemin组、ova+snpp组和ova+hemin+snpp组。10、30和50 mm hemin（fluka，usa）或snpp （alexis，usa）培养cd4+il-17+细胞4872 h，荧光显微镜下观察cd4+il-17+细胞和elispot 检测该细胞分泌il-17功能。收集细胞，trizol提取总rna，1 g rna逆转录，realtime-pcr 扩增并测定各组il-17 mrna表达水平。elisa方法测定各组细胞因子il-17a/f、il-17e、il-4、il-10和ifn-水平。western-blot测定各组ho-1的表达量和酶活性（本方法实验室已建立）。小鼠il-17引物和taqman 探针序列（本实验室已合成）分别为：il-17a正向引物：5-gct cca gaa ggc cct cag a-3il-17a反向引物：5-agc ttt ccc tcc gca ttg a-3il-17a taqman 探针：5fam-ctc tcc acc gca atg aag acc ctg a-tamra 3il-17e正向引物：5-cac act gcg tca gcc tac aga-3il-17e反向引物：5-tgt ggt aaa gtg gga cgg agt t-3il-17etaqman：5fam-ctc cca cat gga ccc gct ggg-tamara3二、体内实验1制备小鼠哮喘气道炎症模型选用本课题组已建立的哮喘模型（zhen-wei xia, et al. the journal of immunology, 2006, 177: 5936-5945）。balb/c 小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司）腹腔注射ova（sigma公司） 2次致敏，间隔2周，以及腹腔麻醉后经ova气道局部激发，诱导哮喘气道炎症。2 ho-1表达干预前后肺组织th17细胞及其il-17等细胞因子的变化与哮喘气道炎症设对照组、ova组、ova+hemin组、ova+snpp组和ova+hemin+snpp组。balb/c小鼠于ova致敏前2天，前1天，致敏后第12、13、23、24和27天分别经腹腔注射hemin、snpp和hemin+snpp 各75 mmol/kg干预ho-1表达，western-blot检测各组ho-1的表达量和酶活性，同时各组进行以下实验：2.1 分析th17细胞和il-17不同亚型及相关细胞因子在肺组织中分布与表达免疫荧光检测th17细胞在肺组织中的分布：分别于ova致敏和激发后3、6、12、24、48和96 h处死动物，肺组织冰冻切片，依次加入fitc标记的抗小鼠cd4抗体和apc标记的il-17a抗体（ebioscience公司），荧光显微镜下观察cd4+il-17+细胞比例。realtime-pcr检测il-17a、il-17e在小鼠肺组织中的表达：分离小鼠左肺即刻置液氮中，80保存；或匀浆肺组织，trizol提取总rna，1 g rna逆转录，realtime-pcr 扩增并测定各组小鼠肺组织il-17 mrna表达水平。小鼠il-17引物和taqman 探针序列同上。肺组织il-17等细胞因子检测：分别于ova致敏和激发后3、6、12、24、48和96 h，采血并切开气管，注入0.3 ml冰冻生理盐水灌洗3次，收集balf於1500 g离心5 min，离心留取上清，elisa方法测定balf中il-17a/f、il-17e、il-4、il-6、il-10、tgf-和ifn-水平，比较不同时间点上述指标的变化（ebioscience公司）。2.2 构建小鼠pacgfp1-pil-17a、e启动子质粒，经脂质体包埋后导入肺部，观察由il-17启动子激活的acgfp1荧光蛋白表达，分析ho-1干预在ova激发后不同时间点il-17a、il-17e表达构建小鼠pacgfp1-pil-17a、e启动子质粒：分离balb/c小鼠外周血单个核细胞，提取dna，pcr扩增小鼠il-17 a、il-17e启动子序列（5端和3增加ecor i序列和3个保护碱基-ccg）。il-17a启动子上游引物：5-ccg gaa ttc agg gta tcc caa gaa gtg tca ga-3il-17a启动子下游引物：5-ccg gaa ttc tcc ctg gac tca tgt ttg cgc gt-3ecori限制性内切酶酶切pcr扩增产物和pacgfp1质粒，t4连接酶连接启动子序列和pacgfp1质粒，构建含il-17a启动子的pacgfp1-pil-17a质粒，转染dh5a，用含庆大霉素的lb培养皿筛选并扩增质粒，qia miniprep（qiagen）试剂盒抽提并纯化质粒，获得纯化的pacgfp1-pil-17a质粒（本实验室构建完成）。采用克隆il-17a相同的方法扩增小鼠第14号染色体上il-17e转录起始位点上游2 kb dna序列作为il-17e启动子序列，将其克隆入pacgfp1质粒，构建pacgfp1-pil-17e启动子质粒。观察ova激发后不同时间点il-17a、il-17e表达情况：脂质体包埋pacgfp1-pil-17a、e启动子质粒，在ova激发同时分别将10、20 和30 g/ml质粒经气道导入肺部，激发后3、6、12、24、48和96 h处死动物，肺组织冰冻切片，荧光显微镜下观察pacgfp1表达情况，从而动态分析ova激发后il-17a、il-17e在肺组织中表达。2.3 il-17a、il-17e抗体或重组蛋白干预对小鼠哮喘气道炎症和气道高反应性的影响，以进一步明确其在哮喘中的作用各组小鼠在ova激发同时气道内分别给予5 g il-17a、il-17e单克隆抗体和/或0.1 g il-17a、il-17e重组蛋白干预（rnd system），24 h后病理组织学检测；elisa方法测定balf中细胞因子il-17a/f、il-17e、il-4、il-6、il-10、tgf-和ifn-水平；流式细胞仪（bio-rad公司）分析肺组织中th17细胞数，并测试气道反应性以评价il-17a、il-17e在哮喘中的作用。2.4 th17细胞回输对小鼠哮喘气道炎症和气道高反应性的影响选用100 g ova 323-329肽段的mpa-ova免疫do11.10小鼠持续2天，分离胸腺细胞，加入tgf-、il-6和il-23体外培养（方法同上），并用cmtmr荧光标记（红色），该方法在ova刺激下能产生大量ova特异性th17细胞。于ova激发前24 h将1107致敏胸腺细胞（ova特异性th17细胞）经尾静脉回输5组balb/c小鼠，24 h后ova气道激发，并于激发后3、6、12、24、48和96 h处死动物，病理组织学检测；elisa方法测定balf中细胞因子il-17a/f、il-17e、il-4、il-6、il-10、tgf-和ifn-水平；流式细胞仪（bio-rad公司）分析肺组织th17细胞数，并测试气道反应性以评价il-17在哮喘中的作用。3ho-1表达干预前后血清th17、cd4+cd25+ treg细胞和il-17等细胞因子的变化5组balb/c小鼠于ova气道激发后3、6、12、24、48和96 h采血50 l，分别加入fitc标记的抗小鼠cd4抗体和pe标记的il-17a抗体（ebioscience公司）；apc标记的抗小鼠cd4抗体、pe标记的抗小鼠cd25抗体 (bd pharmingen公司)和 fitc标记的抗小鼠foxp3抗体 (ebioscience公司)，流式细胞仪(bio-rad公司)测定th17和cd4+cd25+ treg细胞比例，数据采用cellquest软件分析。elisa方法测定血清中细胞因子il-17a/f、il-17e、il-4、il-6、il-10、tgf-和ifn-水平。研究方案及技术路线（见图）可行性分析1） 鉴于ho-1和th17细胞在过敏性哮喘发生发展中的重要性，目前急需建立一个th17细胞的研究平台，以此来进一步明确th17细胞在哮喘中的作用，以及ho-1和th17间作用关系。因此本项目设想通过体外细胞培养和哮喘动物模型来阐明ho-1和th17细胞间的相互作用，为哮喘的发生机制和防治提供理论基础和临床手段是一种新思路。2） 具体方案中涉及哮喘模型的建立：课题组已成功建立了以ova腹腔注射致敏结合气道内局部激发的小鼠哮喘模型，结果显示气道内大量炎性细胞浸润，并在吸入乙酰胆碱后表现出明显气道高反应性；更重要的是预初实验已表明il-17在此模型中有显著变化，由此相信选用该模型来研究ho-1干预前后th17细胞及其分泌的il-17的变化是可行的。3） 课题组已与oregon health and science university dr. zhang 实验室建立了长期合作协议，相关的研究人员已在其实验室开展工作。dr. zhang 实验室已建立map 技术，合成了大量ova323-339肽段。该技术特点能利用多个赖氨酸组成一个核心分子，在此基础上通过胺键结合大量特异性抗原肽段，从而提高抗原表达性。do11.10小鼠是一类转基因小鼠，基因背景为balb/c小鼠，其t细胞对ova具有特异性识别和反应性。我们前期研究发现，给do11.10小鼠注射带有ova的map后能在胸腺和脾脏诱导大量抗原特异性th17细胞，把获得的th17细胞荧光标记经尾静脉回输到balb/c小鼠，通过眼内注射ova激发24 h后可