（药剂学专业论文）复方灵芝降糖胶囊工艺及质量标准的研究.pdf

中文摘要复方灵芝降糖胶囊系由灵芝、麦冬、知母、百合四昧药加工制成的制剂，具有益气养阴、清热生津之功效，主要用于治疗气阴两虚所致的消渴病及各种2 型糖尿病。本课题以传统中医药理论为指导原则，运用现代制药技术，对该制剂进行了临床前工艺及质量标准的研究。根据临床用药需要，结合处方用药性质，确定该剂型为胶囊剂。根据处方的功能主治及处方中药味有效成分的理化性质，拟定了制备工艺路线。采用正交试验方法，以多糖成分为指标，分别建立了灵芝及麦冬、知母、百合的最佳提取工艺。取灵芝药材适当粉碎，加1 2 倍量的水煎煮两次，每次3 小时，滤液合并浓缩至相对密度为1 1 5 ( 8 0 ) ，加入9 5 乙醇使醇沉浓度达到8 5 ，静置，离心，取沉淀，干燥；其它三味药加8 倍量的水煎煮三次，每次1 5 小时，滤液合并浓缩至相对密度为1 1 5 ( 8 0 ) ，加入9 5 乙醇使醇沉浓度达到8 5 ，静置，离心，取沉淀，干燥。将多糖干燥品混合粉碎，过8 0 目筛，装l 号胶囊即得。在质量标准研究中，对方中灵芝、麦冬、知母三味药进行了薄层色谱的鉴别研究；含量测定采用蒽酮一硫酸比色法，以总多糖为指标，并进行了系统的方法学( 检测波长、供试品提取条件、线性、精密度、稳定性、重复性、加样回收率等) 考察，试验结果均符合要求，测得回收率为1 0 2 9 4 ，含量不低于4 9 9 9 7 m g g 。稳定性研究中分别考察了加速及长期稳定性。取三批样品，除生产当月( o 月) 取样考察一次外，以后的l 、2 、3 、6 月各取样考察一次，共考察六个月。结果，本品三批样品性状、鉴别、检查、含量测定均符合规定。以上试验证明：工艺合理可行，质量标准可控，质量基本稳定。关键词：复方灵芝降糖胶囊制备工艺质量标准稳定性研究a b s t r a c tc o m p o u n dg a n o d e r m aj i a n g t a n gc a p s u l e sa r em a d eu po fg a n o d e r m a ，d w a r fl i l y t u r ft u b e r ，c o m m o na n e m a r r h e n ar h i z o m e ，l i l yb u l b i tc a nb eu s e di na l lk i n d so fi it y p eo fd i a b e t e sc a u s e db yd e f i c i e n c yo fb o t hv i t a le n e r g ya n dy i nb e c a u s ei th a se f f e c t so fs u p p l e m e n t i n gq ia n dn o u r i s h i n gy i n ，r e m o v i n gh e a tt op r o m o t es a l i v a t i o n u n d e rt h eg u i d e n c eo ft h et r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n et h e o r ya n dp r a c t i c e ，a p p l y i n gm o d e r np r e p a r a t i o nt e c h n o l o g ya n dt h es t u d yc a r r i e st h r o u g ht h er e s e a r c h i n go fc r a f ta n dq u a l i t ys t a n d a r db e f o r ec l i n i c a c c o r d i n gt ot h er e q u i r e m e n to fc l i n i c ，t a k i n gt h ep r e s c r i p t i o na n dt h ec h a r a c t e ro ft h eh e r b si n t oa c c o u n t ，t h es t u d ym a k e st h ed o s a g ef o r ma sc a p s u l e o nt h eb a s i so ft h ef u c t i o na n di n d i c t i o no ft h ep r e s c r i p t i o n ，p h y s i c o 。c h e m i c a lp r o p e r t yo ft h ee f f e c t i v ei n g r e d i e n ti nt h eh e r b s ，t h es t u d yl a y sp r e p a r a t i o nc r a f tl i n ea n da d o p t so r t h o g o n a le x p e r i m e n tm e t h o d t h r o u g hd e t e c t i n gp o l y s a c c h a r i d e ，t h es t u d yc o n s t i t u t e st h eb e s te x t r a c t i o nc r a f to fg a n o d e r m a ，d w a r fl i l y t u r ft u b e r ，c o m m o na n e m a r r h e n ar h i z o m e ，l i l yb u l b t h ep r o c e s s i o ni sa sf o l l o w ：w a t e rd o s a g e ，12t i m e sa se x t r a c t i o nd o s a g e ，d e c o c t i o n ，3h o u re x t r a c t i o nt i m e ，2a sf r e q u e n c y ，b l e n d i n gt h ef i l t r a t ea n dc o n d g n s i n g ，t h er e l a t i v ed e n s i t yt o1 15 ( 8 0 ) ，a d d i n ge t o h ( 8 5 a sc o n c e n t r a t i o n ) ，s t a n d i n g ，c e n t r i f u g i n g ，d r y i n gp r e c i p i t a t i o n ；t h eo t h e r3h e r b sa d d i n gw a t e r ，8t i m e sa se x t r a c t i o nd o s a g e ，d e c o c t i o n ，i 5h o u ra se x t r a c t i o nt i m e ，3a sf r e q u e n c y ，b l e n d i n gt h ef i l t r a t ea n dc o n d e n s i n g ，t h er e l a t i v ed e n s i t yt o1 15 ( 8 0 ) ，a d d i n ge t o h ( 8 5 a sc o n c e n t r a t i o n ) ，s t a n d i n g ，c e n t r i f u g i n g ，d r y i n gp r e c i p i t a t i o n ；a tl a s tm l x m gt h ea b o v ee x t r a c t i v e ，c r a s h i n g ，s i e v i n gw i t h 8 0m e s h ，f i l l i n gi n t oc a p s u l e s 2i nt h er e s e a r c ho fq u a l i t ys t a n d a r d ，t h ee x p e r i m e n tu s e st h et h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h yt oc a r r yo nt h eq u a l i t a t i v e d i s t i n c t i o no ft h r e eh e r b si nt h ep r e s c r i p t i o n a s s a y i n ga d o p t sa n t h r o n e s u l p h u r i ca c i dc o l o r i m e t r i cm e t h o dt a k i n gp o l y s a c c h a r i d ea si n d e xa n dc a r r i e so u tt h es t u d yo fs y s t e m a t i ct e c h n o l o g y ( d e t e c t i n gw a v el e n g t h ，e x t r a c t i n gc o n d i t i o n ，l i n e a r ，p r e c i s i o n ，s t a b i l i t y ，r e p r o d u c i b i l i t y ，r e c o v e r yr a t eo fs p o t t i n g t h er e s u l ts a t i s f i e dw i t ht h er e q u i r e m e n t t h er e c o v e r yr a t ei s1 0 2 9 4 t h ec o n t e n t si sn o tl o w4 9 9 9 7 m g g t h es t u d yi n s p e c t st h es t a b i l i t yo fa c c e l e r a t i o na n dl o n g t e r m t h ep r o c e s s i o ni sa sf o l l o w ：d e t e c t i n gt h es a m p l ew h i c hi sp r o d u c e d ，t h e nd e t e c t i n gt h es a m p l ew h i c hi sk e p tim o n t h ，2m o n t h ，3m o n t h ，6m o n t h a st h er e s u l t ，t h ec h a r a c t e r ，i d e n t i f i c a t i o n 、i n s p e c t i o n ，a s s a y i n go ft h et h r e eb a t c ho ft h es a m p l ec o n s i s tw i t ht h er e g u l a t i o n a b o v ea l lt h ee x p e r i m e n tp r o v e st h a tt h ec r a f ti sr e a s o n a b l ea n dp r a c t i v e ，t h eq u a l i t ys t a n d a r disc o n t r o l l e d ，t h eq u a l i t yi sf u n d a m e n t a l l ys t a b l e k e yw o r d s ：c o m p o u n dg a n o d e r m aj i a n g t a n gc a p s u l e sp r e p m a t i o nc r a f tq u a l i t ys t a n d a r ds t a b i l i t yr e s e a r c h3引言一立题目的一糖尿病是一种由于血糖失控高出正常水平所造成的全身性、进行性疾病，并发症多，且严重。随着社会经济的发展，人民生活水平的提高，生活方式的改变，城市化和老龄化进程的加快，糖尿病患病率迅速上升。世界卫生组织资料表明，全球糖尿病患者已逾一亿。据初步统计我国糖尿病患者总数约3 6 0 0 万，每年新增糖尿病患者7 5 万，虽属世界上糖尿病低患病率国家，但该数字已居世界第二位。糖尿病发病率迅速增长已成为世界各国越来越严重的一个公共卫生问题。因此，糖尿病防治工作十分严峻，治疗糖尿病药物的研究和开发任重而道远。从动植物、微生物中提取的活性多糖，具有提高免疫力、抗肿瘤、降血糖、降血脂及抗感染等功能。鉴于多糖具有多种生理功能x益气养阴、清热生津。主要用于治疗气阴两虚所致的消渴病及各种2 型糖尿病。三处方中药味的现代研究文献( 一) 灵芝：灵芝是一种真菌，属于担子菌纲( 占a 占f d f d 力即p t p s )多孔菌科( 尸d 即d ，a c p a e ) 灵芝属( 如力o d 占r 血a ) 。其性味淡、温、无毒。本经列为上品，谓：“灵芝明目，补肝肾，安惊魂；治胸中结，益心气，补中增智慧，不忘”。“保神，益精气，坚筋骨”。我国历代医药学者均认为灵芝能够治疗多种疾病，是滋补强壮扶正固本的珍贵药物，尤其在预防衰老和防治老年性疾病中占有重要地位。一般供药用的主要有赤芝 铂邶- d p ，廊a 三盯c j 如凹( p ，s sp zn ) 如，s 胡和紫芝 幽由d 幽，凹a 乃p d ，7 f c 盯皿( f 1 ，) j o ，刎的子实体。现代药理研究证明其具有免疫调节q ”，抗癌叫“，延缓衰老，降低血糖叫”3 ，护肝n 引5 1 以及镇静镇痛7 1 等作用。灵芝成分复杂，主要含有n 刚多糖类、核苷类、呋喃类、甾醇、生物碱类及氨基酸类，而起主要活性成分的是多糖类。目前，从灵芝中已分离到2 0 0 多种多糖，其中大部分为b 一型葡聚糖，少数为a 一型葡聚糖，而b 一型葡聚糖是其发挥活性的主要成分。灵芝多糖大多为异多糖，多数有分支，部分多糖含有肽链，具有螺旋体结构。李荣芷n9 1 等从赤芝子实体中分离出数十种灵芝多糖，并且认为灵芝多糖结构中含有较多的糖苷键可能是其具有强烈药理活性的原因。h i k i n oh 等”叫从灵芝子实体中分离得到两种具有降血糖活性的多糖g a n o d e r a na 和g a n o d e r a nb 对正常小鼠及四氧嘧啶诱发的高血糖小鼠都有明显降糖活性，多糖a 以每日1 0 、3 0 、1 0 0 m g k g 的剂量给药7 h 后，对正常小鼠的降糖率分别为5 5 、5 9 和4 8 ：2 4 h 后，降糖率分别为7 8 、6 0 和5 6 。对四氧嘧啶诱发的高血糖小鼠给药7 h 后，降糖率分别为5 7 、5 2 和5 3 ；2 4 h 后，降糖率分别为8 1 、8 1 和6 7 。陈惠芳等凹的研究发现，g a n o d e r a nb降血糖作用机制是升高血浆胰岛素的浓度，加速葡萄糖代谢，提高周围组织对糖的利用，并通过强化参与肝脏糖代谢的各种关键酶的活性来提高肝脏对葡萄糖的利用。近年来，中医药治疗糖尿病逐渐被国内外研究学者认可，对改善糖尿病患者的自觉症和他绝症起到了相当重要的作用。李时珍在本草纲目第三卷论消渴( 糖尿病) 应用单味中药治疗，共记载1 8 7 种n “。根据消渴的辩症论治的疗法分为生津润燥类，如栝楼、生葛根、白芍等；降火清心类，如麦冬、黄连、桑白皮、茯苓等；补虚滋阴类，如知母、人参、黄芪等。目前对降糖中药化学结构的研究发现，除小分子化合物，如萜类、黄酮类、甾体类和生物碱等外，大分子化合物如多糖类均具有降血糖作用。吕仁和教授指出早在黄帝内经中对其病机，即消渴病发生、发展、转归和预后的基本规律就已经有了明确阐述，也就是对本病在不同时期的不同表现作了简要的描述。如素问阴阳别论：“二阳结谓之消”，其主要表现必然是多饮、多尿、多食、大便干燥，强调阴虚热结的病机。又如“二阳之病发心脾，有不得隐曲，女子不月。其传为风消，其传为息贲者，死不治”。吕仁和教授为了能够更清晰、明确地探讨其病因病机，进而更好地指导临床，结合自己的临床实践将糖尿病分为消渴病前期、消渴病期、消渴病并发症期三期“，并以个性和共性原则区分之。共性原则：一期( 消渴病前期) 即脾瘅：消渴病前期尚不等于消渴病，但有可能成为消渴病，该期的主要病机特点是“阴虚”。形成这种阴虚的原因主要是禀赋有亏、贪食甘美、辛劳少逸。可表现为阴虚肝旺、阴虚阳亢、气阴两虚。一期病人多形体肥胖，有时有口甜症状，但因尚未化热，所以无典型消渴病的表现。其主要病机如下：禀赋有亏。此类患者亲生父母、祖父母、外祖父母、姐妹兄弟、堂姐妹兄弟等人中有消渴病患者。其人食欲旺盛，皮薄色红，形体虚胖，五脏脆弱，性情急躁，多劳少逸，久之导致阴精耗损，若加情志不遂，则成阴虚肝旺之证。贪食甘美。此类患者原先多辛苦劳累，营养欠佳，形体消瘦，后因生活条件改善，甘美厚味，食无节制，日久使形体转胖，若不自爱惜，任意耗伤，则阴精亏虚，若加以急躁多怒，久则出现头晕目眩等症状，成为阴虚阳亢之证。辛劳少逸。此类患者禀赋有亏，复加以辛苦劳累，久之正气耗损，复受外邪，耗伤阴津，则可出现疲乏无力，怕热汗出，心烦急躁，舌红干裂，脉细无力等气阴两虚的症状。二期( 消渴病期) 即消渴：此期为消渴病，但尚未出现并发症。此期的特征是“阴虚化热”。乃病人在一期基础上，甘美饮食不忌，肥胖体重不减，逐渐发展而成。复因情志不舒，肝气郁结，或因外邪侵袭，或因过食辛辣燥热，或因劳累过伤，均可化热化燥伤阴，持续正气耗伤，从而可转化为阴虚燥热，二阳结热，肝郁化热，湿热困脾，热伤气阴等证。其主要病机如下：阴虚肝旺的基础上，若有情志不舒，或忧思不解，过食辛辣甘美，即会导致心脾受伤，阴津耗损，化生燥热，日久则可出现心烦急躁，口干舌燥，舌红苔粗，脉象细数等阴虚燥热的症状。阴虚阳亢的基础上，若加以暴怒伤肝，心脾受伤，胃肠转输失常，胃肠结滞化热，则可出现消谷善饥，渴饮尿黄，大便干结，舌红苔黄，脉弦滑数等二阳结热的症状。阴虚肝旺或阳亢的基础上，若加以过食生冷，甘肥滋腻，可使脾胃受伤，水湿停滞，滞而化热。则会出现脘腹胀满，纳饮不香，肢体沉重，纳后饱满，舌体胖嫩苔黄厚腻，脉弦滑数等湿热困脾的症状。阴虚肝旺的基础上，若加以情志不舒，郁闷不解，气郁化热，即可出现口苦咽干，急躁易怒，胸闷太息，舌黯苔黄，脉沉弦等肝郁化热的症状。气阴两虚的基础上，若继续辛苦劳累，不慎调养，则进一步耗阴伤气，化热灼津伤及经脉，即可出现消瘦乏力，腰腿酸痛，口干舌燥，大便不畅，舌胖有裂、苔薄粗黄，脉细而数等气阴两伤，经脉不畅的症状。三期( 消渴病并发症期) 即消瘅：消渴病并发症期的特征是气血逆流，血脉不活，经脉瘀阻，可逐渐出现皮肤、肌肉、脉、筋、骨、五脏、六腑、奇恒之腑的急慢性病变。临床上对急性病变可分为轻、中、重三度，对慢性病变可分为早、中、晚三期。其主要病机如下：急性并发症的病因病机。急性并发症常在短期内因过度悲伤愤怒、贪食、饮酒、辛劳、停药、中毒、失水、感染等因素，诱使发生酮症酸中毒昏迷、乳酸性酸中毒、高渗综合征、严重的感染等。慢性并发症的病因病机。慢性病变所涉及的组织器官，常因何脏功能相对脆弱而何脏首先发病。因发生发展比较缓慢，所以我们为便于寻找发生发展规律和防治办法，主张将其分为三期研究，有的病种还可以在分期的基础上进一步分度。个体原则：由于个体的差异，各种并发症的发生情况不完全相同，可单一出现，也可两种以上并见；严重程度也不尽相同，可能是并发心病在早期，而眼病已经发展到中期或晚期。所以在研究各种并发症时，尚需拟定各种并发症进入早、中、晚的特异性指标，但一般说来，总体上应以全身病变及主要脏器的损害程度为主，各期的区别如下。早期：主要病机为气阴两伤，经脉不仅失养而且久遭燔灼，使经脉不和，血脉不活，络脉瘀阻。临床特征为气阴两伤的基础上更兼有背腰或肢体酸痛，视物模糊，胸闷心悸，头晕健忘，手足麻木，性欲减退等。但此期各脏功能尚可代偿，所以可勉强维持原有的工作和生活。中期：主要病机为气血逆流，肌肤充血，血脉不活，痰瘀互结，阴损及阳。临床特征为神疲乏力，胸闷心痛，心悸气短，咳有粘痰，头晕目眩，手足麻痛冷凉，下肢、颜面浮肿，阳痿、闭经，视物不清，肾功能衰竭，血色素下降，或见肢体疼痛，坏疽肌肉萎缩。此期患者已不能坚持原有的生活和工作。晚期：主要病机为“气血逆乱，血脉不行”。气血阴阳俱伤，痰湿瘀郁互结。临床特征为出现严重的心律紊乱，心力衰竭；或发生尿毒症：或发生脑血栓、脑出血等。五中、西医治疗糖尿病的优势与不足目前，临床上降血糖仍然以西药为主，这主要是由于西药疗效确切，可有效控制血糖，所以中医药治疗糖尿病的地位仍是作为现代医学的辅助疗法。尽管如此，西药都有一定的局限性：大墨拉江虫医蕴去主亟土硷奎一多数西药作用途径单一，有的具有严重的不良反应，如导致低血糖、乳酸酸中毒，长期服用需要加量并有继发失效的可能，此外，西药不能有效地控制慢性并发症。相反，中医药治疗糖尿病在这些方面具有西药不可替代的优势“，主要表现在以下几方面：治疗糖尿病的中药和方剂十分丰富，对新药开发和糖尿病的治疗提供了较多的选择余地：中药多为有机物，成份接近人类的食物，较化学合成的西药毒副作用小，使用比较安全，一般不会严重损伤内脏，对肝肾等严重并发症治疗无禁忌，也不会造成低血糖的严重后果；中药可以增强体质i 提高人体抗病能力。益气健脾、调肝补肾药可改善内分泌代谢和免疫功能，扶正祛邪，巩固长期疗效。活血化瘀药可溶血栓、改善微循环，有效地预防和治疗并发症：某些中药可能同时兼有多方面的控制血糖作用，但又不会发生低血糖反应；中药可以直接补充人体容易缺乏的维生素、微量元素、。电解质、矿物质、纤维素等，纠正营养素缺乏引起的并发症；双向调节，平衡内环境，维护渗透压，保护膜功能，防止由于血糖波动渗透压剧变造成的细胞膜功能的损伤。有扶正和护正的作用。较之西药有防治糖尿病并发症的优势：现代研究发现，许多中草药含有丰富的微量元素锌、铬等。这些微量元素参与了胰岛素的合成与降糖作用。许多中药含有丰富的植物纤维，有延缓葡萄糖吸收的作用。但是，中医药治疗糖尿病也存在着不足之处，如诊断上灵活性有余、规范化不足、难以进行大样本的科学研究；直接降糖的作用不显著、不迅速、不明确等。因此，现代学者都在努力寻找疗效确切副作用小的方法来治疗糖尿病，其中，中西医结合可起到取长补短的效果。二者结合既可稳定降糖作用，巩固疗效，又可减少西药的副作用，还可以明显改善症状，如口渴、乏力倦怠、多汗、便秘、手足疼痛麻木等等。又如标本兼治、合理用药：一般血糖较高时，单用中药是不能控制的，必需加用降糖西药，同鏊纛囊羹冀l。5 耄| i i 8二；i 日i ；雾j 簿j 备霉麓蠹彗舅二套毒j j 掌辇量室i j ，j 主i ? | 暑i ；荨j 卷毫薹l l l ；墼蔓i 州；氅；二；i ；l l 譬，；鬻暮凌登* 善量；j 毫薹 i ；= ：；茎诌薹一争：辫誉= 电；霉季蚕塌璀j ：i ； i i 笔j ；詈州i j ；笼罩芝j ；! - 薹搴宝 j i 要i 荔争；j 薹i i 翟皇耋蔓；? j 茎：# 每：! i j 善三言；i r ? i ；j 譬i 兰? j 藿实验研究第一部分复方灵芝降糖胶囊制备工艺的研究一提取工艺路线的确定复方灵芝降糖胶囊由灵芝、麦冬、知母、百合四味药组成。具有益气养阴，清热生津之功效，主要用于治疗气阴两虚所致的消渴病以及各种i i 型糖尿病。由引言中可知，多糖类成分在降血糖方面具有独特的疗效，因此，针对诸药多糖类成分进行提取，并根据多糖类成分的性质，主要采取以水为溶剂提取，并用适当浓度的乙醇将多糖类成分沉淀，得到粗多糖。又灵芝为贵细药，在方中为君药起主要作用，因此，将灵芝单独提取多糖，最后与方中其它药物提取的多糖混合作为制剂的提取物。二实验材料1 仪器：紫外可见分光光度计7 5 6 p c上海光谱仪器有限公司离心沉淀机江苏江阴矿山机械厂真空干燥箱上海一恒科学仪器有限公司旋转蒸发仪上海申胜生物科技有限公司分析天平( 1 1 0 4 )上海天平仪器厂电子分析天平( 1 1 0 6 )梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司电热恒温水浴锅d k 一9 8 1天津市泰斯特仪器有限公司2 试药葸酮中国五联化工厂( 上海)硫酸哈尔滨市新达化工厂无水葡萄糖中国药品生物制品检定所三工艺研究( 一) 灵芝多糖提取工艺的优选根据资料和经验，影响水提纯沉的因素主要有提取时间、加水倍数、醇沉浓度及提取次数，因此，拟定四因素，三水平( 表1 ) ，选用l 9 ( 3 4 ) 正交试验表( 表2 ) 并按其要求，取灵芝药材5 0 9 ，回流提取，滤过，滤液浓缩至一定状态加入9 5 乙醇，边加边迅速搅拌使醇浓度达到要求，静置，离心，取离心物于烘箱中7 0 干燥，得多糖固形物。以灵芝中多糖的含量为指标优选最佳工艺。表l因素水平表 ，- 。_ 。_ 1 一水平a ( h )b ( b v )c ( )d ( 次)提取时间用量醇沉浓度提取次数试验列号号a、bcd灵芝多糖得率( ) $i 1 i ，l ，rjs 为提取的灵芝中多糖占灵芝药材的百分含量【灵芝中多糖的含量测定】采用葸酮一硫酸比色法进行含量测定对照品溶液的制备：取葡萄糖对照品适量于烘箱中1 0 5 烘至恒重，精密称取0 0 2 3 9 于l o o m l 容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，于冰箱中贮藏，备用。供试品溶液的制备：精密称定正交试验所得的九组固形物粉末各约0 1 9 ，置烧瓶中，精密加2 盐酸3 0 m l ，称定重量，于1 0 0 沸水浴中回流水解1 h ，放置至室温，称重，用2 盐酸补足重量，用2 5 m o l l氢氧化钠溶液调至中性，记录用量，取续滤液4 m l 至5 0 m l 容量瓶中，并用水定容至刻度，摇匀，即得。显色剂的配制：量取浓硫酸7 6 m l 并稀释至1 0 0 m 1 ，精密称取蒽酮0 1 9 于1 0 0 m l 容量瓶中，用上述硫酸溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得。标准曲线及供试品的测定：a 标准曲线的测定：从葡萄糖对照品溶液中精密吸取0 1 m l 、0 2 m 1 、0 3 m 1 、0 4 m 1 、0 5 m l 于带塞试管中，并加水至1 i n l ，加入显色剂5 o m l ，摇匀，于沸水浴中反应l o m i n 后冰水浴迅速冷却至室温，在波长为6 2 6 n m 测定吸光度a 。记录吸光度a ( 见表3 ) ，对浓度c 一吸光度a 进行线性回归，得回归方程作为检测标准。表3标准曲线数据表得标准曲线：a = 6 5 4 3 4 8 c + 0 0 3 1 9 0b 供试品溶液的测定：精密吸取供试品溶液l m l 置带塞试管中，精密加入显色剂5 0 m l ，同时以相应溶液做空白，于沸水浴中反应1 0 m i n 后冰水浴迅速冷却至室温，在波长为6 2 6 n m 测定吸光度。结果见表2 。实验结果：经直观分析，四个因素的影响顺序为d c a b ，其中d 。 d 。 d 。，c 。 c 。 c 。，a 。 a ， a 。，b ， b 。 b 。，因此最佳工艺为：d ：c 。a 。b 。，即加1 2 倍量的水，提取两次，每次3 小时，醇沉浓度为8 5 。( 二) 麦冬、知母、百合混合多糖提取工艺的优选在对混合多糖的提取上基本同灵芝多糖的提取方法，因此选定的影响因素也相同，但由于药物自身的性质，在影响因素的选择上提取时间和加水倍数有所不同，其它提取条件和方法均未改变。因此，仍拟定四因素，三水平( 表5 ) ，选用l 9 ( 3 4 ) 正交试验表( 表6 ) ，称取麦冬2 5 9 ，知母2 5 9 ，百合5 0 9 ，按正交试验设计表，回流提取，过滤，滤液浓缩至一定状态加入9 5 乙醇，边加边迅速搅拌使醇浓度达到要求，静置，离心，取离心物于烘箱中7 0 干燥，得混合多糖固形物。以混合多糖含量为指标优选最佳工艺。【混合多糖的含量测定】采用蒽酮一硫酸比色法进行含量测定供试品溶液的制备：精密称定正交试验所得的九组固形物粉末各约0 1 9 ，置烧瓶中，精密加2 盐酸3 0 m l ，称定重量，于l o o 沸水浴中回流水解l h ，放置至室温，称重，用2 盐酸补足重量，用。2 5 m o l l 氢氧化钠溶液调至中性，记录用量，取续滤液2 m l 至5 0 m l 容量瓶中，并用水定容至刻度，摇匀，即得。显色剂的配制：量取浓硫酸7 6 m l 并稀释至1 0 0 m l ，精密称取葸酮0 1 9 于1 0 0 m l 量瓶中，用上述硫酸溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得。标准曲线及供试品的测定：a 标准曲线的测定：从葡萄糖对照品溶液中精密吸取0 1 m 1 、0 2 m 1 、0 3 m 1 、0 4 m l 、0 5 m 1 于带塞试管中，并加水至1 m 1 ，加入显色剂5 0 m l ，摇匀，于沸水浴中反应l o r e i n 后冰水浴迅速冷却至室温，在波长为6 2 6 n m 测定吸光度a 。记录吸光度a ( 见表4 ) ，对浓度c 一吸光度a 进行线性回归，得回归方程作为检测标准。表4标准曲线数据表得标准曲线：a = 5 6 8 6 c + 0 0 2 6 9 3表s因素水平表表6正交试验表及结果i ，i i i 。rjt 为提取的混合多糖占药材投料的百分含量b 供试品溶液的测定：精密吸取供试品溶液l m l 置带塞试管中，精密加入显色剂5 o m l ，于沸水浴中反应1 0 m i l 3 后冰水浴迅速冷却至室温，在波长为6 2 6 n m 测定吸光度。结果见表5 。实验结果：经直观分析，四个因素的影响顺c a b d ，其中c 。 c 。 c ，a 。 a 。 a 。，b ， b 。 b 。，d 。 d 。 d 。，因此最佳工艺为：c 。a 。b 。d 。，即加8倍量的水，提取三次，每次1 5 小时，醇沉浓度为8 5 。四流浸膏浓缩状态的确定加醇处理前的流浸膏状态应保证既达到一定的稠度以节约乙醇，还要有一定的流动性以使醇沉达到最好状态，因为我们要的是沉淀部分。经过试验考察将灵芝提取液浓缩至每毫升流浸膏相当于2 克生药材，麦冬、知母、百合提取液浓缩至每毫升流浸膏相当于1 5 克生药材较好，此时其相对密度为1 15 ，8 0 热测。所以生产工艺中则可以相对密度加以测定作为浓缩指标。五最佳制备工艺( 一) 处方组成灵芝l5 0 0 9麦冬3 7 5 9知母3 7 5 9百合7 5 0 9( 二) 灵芝多糖的提取取灵芝1 5 0 0 9 ，加入1 2 倍量的水煎煮2 次，每次3 小时，分次滤过，滤液置静锅内，浓缩至相对密度为1 1 5 ( 8 0 热测) ，放置至室温加入9 5 乙醇，边加边迅速搅拌，使醇浓度达到8 5 ，静置2 4 h ，离心，取离心物，干燥，得灵芝多糖3 6 9 。( 三) 混合多糖的提取取麦冬3 7 5 9 、知母37 5 9 、百合7 5 0 9 混合均匀，加入8 倍量的水煎煮3 次，每次1 5 h ，分次滤过，滤液置静锅内，浓缩至相对密度为1 1 5 ( 8 0 热测) ，放置至室温加入9 5 乙醇，边加边迅速搅拌，使醇浓度达到8 5 ，静置2 4 h ，离心，取离心物，干燥，得混合多糖3 8 5 9 。( 四) 粉碎将上述多糖提取物混合粉碎，粉碎成细粉，过8 0 目筛，得细粉4 0 6 9 ，备用。( 五) 装囊采用手工装胶囊，装l 号胶囊，共装1 0 0 l 粒，每粒0 4 9 装量。六中试生产试验按处方量扩大十倍量，进行三批中试试验，实验数据见表7 。表7中试试验数据表灵芝1 50 3 6 0混合154 0 0 6灵芝1 50 3 9 62 6 44 3 0 7混合15 、4 0 8 22 7 2 1通过上述数据表明，中试试验均能重复所选生产工艺，产量基本无出入，故工艺是可行的。其性状、鉴别、含量测定及微生物检查均符合中国药典( 2 0 0 5 年版一部) 的要求，具体数据见质量标准研究部分。第二部分复方灵芝降糖胶囊质量标准的研究一实验材料1 仪器紫外可见分光光度计7 5 6 p c电子分析天平( 1 1 0 6 )分析天平( 1 10 4 )电热恒温水浴锅d k - 9 8 12 药品灵芝对照药材麦冬对照药材百合对照药材菝葜皂苷元对照品无水葡萄糖3 试剂甲醇( 分析纯)乙醇( 分析纯)石油醚( 分析纯)盐酸( 分析纯)氯仿( 分析纯)苯( 分析纯)氢氧化钠无水硫酸钠葸酮硫酸上海光谱仪器有限公司梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司上海天平仪器厂天津市泰斯特仪器有限公司中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所天津市化学试剂一厂天津市化学试剂一厂天津市化学试剂一厂长春化学试剂厂天津市化学试剂一厂天津市化学试剂一厂天津市化学试剂三厂宜兴市第二化学试剂厂中国五联化工厂( 上海)哈尔滨市新达化工厂二性状本品为胶囊剂，内容物为淡棕色松散粉末，气香，味微苦，略甜。墨垄鎏虫医药太堂盈土逾吝三鉴别( 一) 灵芝的薄层鉴别1 供试品溶液的制备：取本品3 0 粒，倾出内容物，混匀，称取8 9 ，加乙醇7 0 m 1 ，加热回流3 0 m i n ，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 0 m 1 使溶解，用石油醚( 6 0 9 0 ) 萃取两次( 2 0 m l 、l o m l ) ，取石油醚层，蒸干，用甲醇l 1 使溶解，作为供试品溶液。2 对照药材溶液的制备：取灵芝对照药材2 9 ，同法制成对照药材溶液。3 阴性对照溶液的制备：取处方中除灵芝外其余三味药，按制备工艺进行制备得阴性粉末，取该粉末5 9 ，按供试品溶液制备方法进行制备，即得阴性对照溶液。4 点样、展开：吸取上述三种溶液各1 0 - 2 0ul ，分别点于同一硅胶g 薄层板上，以石油醚( 6 0 9 0 ) 一甲酸乙酯一甲酸( 1 6 ：5 ：1 ) 的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。5 检视：将晾干的硅胶g 薄层板置紫外光灯( 3 6 5 1 m ) 下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。如图1 所示。图11 、5 阴性对照液2 、4 灵芝对照药材3 供试品溶液( 二) 麦冬的薄层鉴别1 供试品溶液的制备：取本品3 0 粒，倾出内容物，混匀，称取7 9 ，用盐酸：水( 1 ：5 ) 3 0 m l 溶解，加热回流l h 后，放置至室温，用氯仿萃取三次( 4 0 r a l 、3 0 m 1 、3 0 m 1 ) ，合并氯仿层浓缩至2 m 1 ，。作为供试品溶液。2 对照药材溶液的制备：取麦冬对照药材2 9 ，同法制成对照药材溶液。3 阴性对照溶液的制各：取处方中除麦冬外其余三味药，按制各工艺进行制备得阴性粉末，取该粉末5 9 ，按供试品溶液制备方法进行制备，即得阴性对照溶液。4 点样、展开：吸取上述三种溶液各1 01 1l ，分别点于同一硅胶g 薄层板上，以氯仿一丙酮( 4 ：1 ) 为展开剂，展开，取出，晾干。5 检视：将晾干的薄层板喷以1 0 硫酸乙醇液，于1 0 5 烘至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同的墨绿色斑点。如图2 所示。图2l 麦冬对照药材2 供试品溶液3 阴性对照液墨茁堑圭医蕴去堂亟土盐毫( 三) 知母的薄层鉴别1 供试品溶液的制备：取本品3 0 粒，倾出内容物，混匀，称取8 9 ，加乙醇l o o m l 加热回流4 0 m i n ，滤过，滤液加盐酸1 0 m 1 再加热回流l h ，放置至室温，用苯萃取三次( 3 0 m 1 、3 0 m l 、2 0 m 1 ) ，合并苯层，浓缩至2 m l ，作为供试品溶液。2 对照品溶液的配制：取菝葜皂苷元对照品，加苯溶解制成每l m l含5 m g 的溶液，作为对照品溶液。3 阴性对照溶液的制备：取处方中除知母外其余三味药，按制备工艺进行制备得阴性粉末，取该粉末5 9 ，按供试品溶液制备方法进行制备，即得阴性对照溶液。4 点样、展开：吸取上述三种溶液各5 1 0u1 ，分别点于同一硅胶g 薄层板上，以苯一丙酮( 9 ：1 ) 为展开剂，展开，取出，晾干。5 检视：将晾干的薄层板喷以8 香草醛无水乙醇液与硫酸溶液( 7一1 0 ) 的混合液( 0 5 ：5 ) ，于1 0 5 烘至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同的黄色斑点。如图3 所示。图31 阴性对照液2 、3 供试品溶液4 菝葜皂苷元对照品溶液，。：。，：。墼鱼薹堡查垄塑墼望壑毫。：，：。：一一四检查按中国药典( 2 0 0 5 年版) 一部附录i l 胶囊剂项下规定，对三批样品检查装量差异、崩解时限及水分含量。试验结果见表8 、9 、1 0 。表8装量差异数据表表9崩解时限数据表表1 0水分检查数据表五含量测定( 一) 吸收波长及实验条件的选择1 吸收波长的选择从葡萄糖对照品溶液中精密吸取o 3 m l 于带塞试管中，并用水稀释至l 皿l ，加入显色剂5 m 1 ，摇匀，沸水浴中反应lo m i n ，于冰水浴中迅速冷却至室温。设定波长范围在6 0 0 7 0 0 n m 测定。结果，波长在6 2 6 n m 处有最大吸收。( 见附图1 )2 显色剂用量的选则从葡萄糖对照品溶液中精密吸取0 3 m 1 分别置七个带塞试管中，用水稀释至1 m l ，分别加入显色剂4 o m l 、4 5 m 1 、5 0 m 1 、5 5 m 1 、6 o m l 、6 5 m l 、7 o m l ，摇匀，沸水浴中反应l o r n i n 后于冰水浴中迅速冷却至室温，在波长为6 2 6 n m 测定吸光度。( 结果见表ll ，附图2 )表1 1显色剂用量数据表结果，波长在6 2 6 n m ，显色剂用量为5 o m l 时有最大吸收。3 反应时间的选择从葡萄糖对照品溶液中精密吸取0 3 m 1 分别置五个带塞试管中，用水稀释至l m l ，分别加入显色剂5 o m l ，摇匀，令其在沸水浴中反应时间分别为5 m i n 、l o m i l 3 、2 0 m i n 、3 5 m i l l 、5 0 m i n ，后于冰水浴中迅速冷却至室温，在波长为6 2 6 n m 测定吸光度。( 结果见表1 2 ，附图3 )表1 2反应时间数据表结果，波长在6 2 6 n m 处，显色剂用量为5 o m l ，反应时间为l o m i n时有最大吸收。4 反应温度的选择从葡萄糖对照品溶液中精密吸取0 3 m 1 分别置五个带塞试管中，用水稀释至1 m 1 ，分别加入显色剂5 0 m 1 ，摇匀，分别置温度为4 0 、5 5 、7 0 、8 5 、1 0 0 的水浴内，反应l o m i n ，后于冰水浴中迅速冷却至室温，在波长为6 2 6 n m 处测定吸光度。( 结果见表1 3 ，附图4 )表1 3反应温度数据表结果，波长在6 2 6 n m 处，显色剂用量为5 o m l ，反应时间为1 0 m i n ，反应温度为1 0 0 时有最大吸收。5 最佳实验条件波长为6 2 6 n m ，显色剂用量为5 o m l ，反应时间为1 0 m i n ，温度为1 0 0 ，其吸光度a 最大。( 二) 供试品处理条件的选择1 盐酸用量的考察：供试品溶液的制备精密称定6 份样品，每份0 2 9 置烧瓶中，分别加入2 盐酸3 0 m l 、4 0 m l 、5 0 m 1 、6 0 m l 、7 0 m l 、8 0 m 1 ，称定重量，于1 0 0 水浴中水解l h ，放置至室温，称重，用2 盐酸补足重量，加2 5 m 0 1 l氢氧化钠溶液调至中性，记录用量，取续滤液2 m l 至5 0 m l 容量瓶中。并用水定容至刻度，摇匀。标准曲线的测定从葡萄糖对照品溶液中精密吸取0 1 m 1 、o 2 m l 、0 3 m l 、o 4 m l 、0 5 m l 于带塞试管中，并加水至1 m l ，加入显色剂5 o m l ，摇匀，于沸水浴中反应l o m i n 后冰水浴迅速冷却至室温，在波长为6 2 6 n m 处测定吸光度a 。记录吸光度a ( 见表1 4 ) ，对浓度c 一吸光度a 进行线性回归。表1 4标准曲线数据表得标准曲线：a = 6 1 9 1 3 xc + 0 0 1 2 2供试品溶液的测定取上述供试品溶液各l m l ，分别置试管中，各加入显色剂5 o m l ，摇匀，于沸水浴中反应l o m i n ，在冰水浴中迅速冷却至室温，在波长为6 2 6 r i m 测定吸光度。( 结果见表1 5 )表1 5盐酸用量一含量数据表结果：随着盐酸用量的增加，所测多糖含量值也相应增大，但当盐酸用量在6 0 m l 以上时，多糖含量值不再增大，说明盐酸用量在6 0 m l 时已足够，因此，选择盐酸用量为6 0 m 1 。2 水解时间的考察供试品溶液的制备精密称定4 份样品，每份0 2 9 置烧瓶中，分别加入2 盐酸6 0 m l i 称定重量，于1 0 0 水浴中分别水解o 5 h 、1 0 h 、1 5 h 、2 o h ，放置至室温，称重，用2 盐酸补足重量，加2 5 m o l 几氢氧化钠溶液调至中性，记录用量，取续滤液2 m l 至5 0 l 容量瓶中，并用水定容至刻度，摇匀。标准曲线的测定从葡萄糖对照品溶液中精密吸取0 1 m l 、0 2 m l 、0 3 m l 、0 4 m l 、0 5 m 1 于带塞试管中，并加水至l m l ，加入显色剂5 o m l ，摇匀，于沸水浴中反应1 0 m i n 后冰水浴迅速冷却至室温，在波长为6 2 6 n m 测定吸光度a 。记录吸光度a ( 见表16 ) ，对浓度c 一吸光度a 进行线性回归。叭吕叫加舯如加000o0o表1 6标准益线数据表得标准曲线：a = 6 5 7 8 3xc - 0 0 0 1 7r = o 9 9 9 7供试品溶液的测定取上述供试品溶液各l m l ，分别置试管中，各加入显色剂5 o m l ，摇匀，于沸水浴中反应l o m i n ，在冰水浴中迅速冷却至室温，在波长为6 2 6 n m 测定吸光度。( 结果见表1 7 )表1 7水解时间一含量数据表o 3 1 3o 3 7 6o 3 7 2o 3 7 l结果：水解时间在l h 以后，所测多糖含量值不再增大，说明多糖在l h 内水解完全，因此，选择水解时间为1h 。3 水解温度的考察供试品溶液的制备精密称定6 份样品，每份0 2 9 置烧瓶中，分别加入2 盐酸6 0 m l ，称定重量，分别于5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0水浴中水解l h ，放置至室温，称重，用2 盐酸补足重量，加2 5 m 0 1 l 氢氧化钠溶液调至中性，记录用量，取续滤液2 m l 至5 0 m l 容量瓶中，并用水定容至刻度，摇匀。标