多菌发酵对四川香肠成熟过程中蛋白质变化的影响.doc

多菌发酵对四川香肠成熟过程中蛋白质变化的影响专业：食品科学与工程 学号：xxx 姓名：xxx指导老师：xxx教授摘要：本研究将戊糖乳杆菌l76、腐生葡萄球菌s25以及产黄青霉p2接种到四川香肠中进行自然发酵，同时以不接菌的自然发酵香肠为对照，并测定两组香肠成熟过程中的蛋白质变化。结果表明，总氮含量呈现先上升，后下降的变化趋势；两组产品的蛋白质水解指数在前4d急速增加（p0.05），对照组与接种组相近，在晾挂第4d后接种组的水解指数显著高于对照组（p0.05），终值分别为12.24%和12.05%；两组香肠的挥发性盐基氮在自然晾挂成熟的025d一直呈上升趋势，第25d时达到最大值，分别为27.68mg/100g和26.05mg/100g; 在灌肠当天接种组氨基酸态氮含量显著高于(p 0.01）对照组,一直呈上升趋势，终值分别为0.2356%和0.2183%。在四川香肠成熟过程中，本研究接种的复合发酵剂能加速蛋白质的分解。关键词：发酵香肠，戊糖乳杆菌，腐生葡萄球菌，产黄青霉，蛋白质发酵香肠，是指将绞碎的肉和动物脂肪同盐、糖、香辛料和发酵剂等混合后灌进肠衣,经过微生物发酵制成具有稳定微生物特性和典型发酵香味的肉制品1。发酵香肠具有易消化、风味独特、营养价值高、食用方便、保质期长等特点，因此深受人们的喜爱。随着科技的不断进步，香肠制品的种类及形式越来越多，但是传统的发酵香肠以天然发酵为主，接种的菌种是天然菌种，使其品质不能得到有效的控制，并且生产周期较长，不适合大规模工业化生产。目前，国内外的研究以香肠发酵成熟过程中微生物学和生物化学变化,如何获得高品质菌株,缩短生产周期, 以及采用什么样的发酵剂来代替微生物进行发酵等方面为主2。目前，微生物发酵剂主要有酵母菌、乳酸菌、葡萄球菌、霉菌和微球菌3。在发酵香肠中，乳酸菌4,5的主要作用是将发酵肉中的碳水化合物分解成乳酸而使ph值降低，抑制一些腐败菌的生长，改善肉制品的组织结构，促进发色，降低亚硝酸盐残留量；酵母菌6的主要作用是在发酵成熟过程中逐渐耗尽肠馅空间中残存的氧，从而降低ph值，抑制酸败以及有利于发色的稳定性，也起到分解脂肪、蛋白质和碳水化合物的作用；微球菌和葡萄球菌在发酵成熟过程中具有降解蛋白质和脂肪的能力，形成发酵成品的良好色泽和风味；霉菌7,8在发酵肉制品中主要分布在表面，它在生长中消耗掉o2，抑制好氧腐败菌的生长，可以在肉制品的表面形成一层“保护膜”，霉菌发酵还可以赋予产品特有的外观，所产生的蛋白酶、脂酶能分解蛋白质和氨基酸及脂肪而利于产品形成特有的风味。传统发酵剂，比较单一，具有生产周期长，质量不稳定等缺点。目前国内外学者越来越关注多菌发酵剂的研究。多菌混合发酵可以弥补单菌发酵的单调性，使产品风味更丰富，质量更好。还可增加产品的多样性，扩大市场消费9。moiler10研究开发出一种商业性发酵剂木糖葡萄球菌dd34 和一种分离细菌moraxellaphenylpyruvica 0100，它们在不同的环境条件下，具有形成特定挥发性香味化合物的能力。schillinger 等11从发酵香肠中分离出一种对李斯特菌等病原菌具有极强作用的清酒乳酸杆菌(l. sake)，其抑菌机制是乳酸菌产生的乳杆菌素sakacin。1966年，nurmi在研究中发现，应用乳酸杆菌和微球菌混合发酵剂，既可以保证理想的产酸速度，又可以改善产品的感官品质。从此，混合菌种发酵剂的研究与应用得到了快速发展12。2004年，王永霞等13从20多种传统发酵肉制品中筛选出两株过氧化氢酶阳性球菌，经初步鉴定为肉糖葡萄球菌s15和s113，并初步确定把戊糖片球菌p20与肉糖葡萄球菌s15作为肉制品混合发酵剂。李先葆14等采用嗜酸乳杆菌(la) 、植物乳杆菌(lp)和戊糖片球菌(pp)以1.0%0.6%0.3%的比例组合作为发酵剂，生产出的发酵香肠质地柔软，颜色瑰红，酸味柔和。本实验主要研究，在四川香肠中加入戊糖乳杆菌l76、腐生葡萄球菌s25以及产黄青霉p2三种微生物发酵剂后，川式香肠成熟过程中蛋白质的变化。通过实验，得到相关数据，与未添加复合发酵剂的实验数据进行对比。为筛选出更优势的发酵剂提供依据；为发酵香肠风味物质的深入研究提供基础数据；为川式香肠的多元化及发展方向提供参考数据；为发酵香肠的现代化生产及产品质量提高提供理论依据。1.材料与方法1.1 原理与辅料新鲜猪肉、猪小肠、各种调味料等均购自雅安农贸市场。发酵香肠配方见表1：表1 发酵香肠配方名称百分比（%）名称百分比（%）瘦肉75肥肉25食盐2.8胡椒粉0.05白砂糖1辣椒粉0.9白酒1.5花椒粉0.5五香粉0.08硝酸钠0.015亚硝酸钠0.00751. 2 菌种腐生葡萄球菌s25由四川农业大学肉品研究室从四川香肠中筛选并保存；戊糖乳杆菌l76由四川农业大学微生物实验室从四川香肠中筛选并保存；产黄青霉p2由四川农业大学肉品研究室从四川香肠中筛选并保存。1.3 主要仪器设备 sxc-12灌肠机（上海神鹰实业有限公司）、绞肉机、jwe-3kg电子称（上海芝浦电子有限公司）、bt-124s精密电子天平（上海志荣电子科技有限公）、pb-10ph（德国赛多利斯集团）计、半微量凯氏定氮装置、sw-cj-1f洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、dhg-9345a电热恒温鼓风干燥箱（上海恒一公司）、bcd-186kb海尔冰箱（青岛海尔股份有限公司）等。1.4 四川香肠工艺流程原料肉处理绞肉混料（添加辅料和发酵剂）灌肠结扎排气晾挂成熟。1.5 操作要点1.5.1 原料肉处理原料肉去皮剔骨后将瘦肉与肥肉分开，剔除瘦肉中筋腱、血污，肥肉不带软质肉。1.5.2 绞肉修整好的原料肉，放入绞肉机中斩拌。1.5.3 混料将辅料依次加入，最后加入已用水溶解的硝酸钠和亚硝酸钠，接种组接种腐生葡萄球菌s25、戊糖乳杆菌l76，接种量为106cfu/g，再将肉料拌匀，防止杂菌污染。1.5.4 灌肠采用机械设备自动灌肠，灌馅要松紧适宜，防止灌得过饱而挤破肠衣，匀称。1.5.5 结扎排气灌肠后，用棉线扎成每节1215cm。用细针打孔，每节810孔，以便水分和空气外泄。香肠表面，接种产黄青霉p2，将产黄青霉在25 ，160r/min的转速下生长18h，制作成发酵菌液，然后将灌装好的香肠浸入菌液中即可。1.5.6 晾挂成熟灌肠后晾挂在自然通风条件的室内，在晾挂成熟的30d里室内温度大约为312。1.6 四川香肠指标测定第一组为对照组香肠，第二组为接种组香肠，即加入戊糖乳杆菌l76、腐生葡萄球菌s25以及产黄青霉p2作为发酵剂的香肠。两组香肠除接种组加入复合发酵剂，作为实验变量外，原料及制作条件都相同，形成对照组实验。在四川香肠成熟的0、4、8、13、18、24、30天分别采样并进行相关指标测定。每组香肠，每个指标，称取一个肉样。每个肉样进行两次平行测定，形成平行对照。1.6.1 肉制品取样方法参照 gb/t 9695.19 -2008 肉与肉制品取样方法1.6.2 总氮含量测定参照 gb 5009.5-2010 1.6.3 非蛋白氮含量测定参照 gb 5009.5-2010 1.6.4 挥发性盐基氮含量测定参照 gb 5009.44-2003 1.6.5 氨基酸态氮含量测定参照 gb 5009.40 1.7 数据分析方法使用excel进行数据分析，p值由excel f检验得到2.结果与讨论2.1 总氮含量变化四川香肠成熟过程中总氮含量变化见图1：图1四川香肠成熟过程中总氮含量变化从图1可以看出，总氮含量呈现先上升，后下降的变化。香肠成熟第0d和第1d，接种组和对照组总氮含量都变化微弱，因四川香肠中花椒、食盐等物质具有抑菌作用，产香葡萄球菌，乳杆菌，产黄青霉等生命活动受到抑制。而后微生物适应，生长代谢旺盛，总氮含量急剧上升，分别达到4.182%和3.354%。总氮含量上升可能是香肠成熟过程中水分含量的减少引起的。后几天，总氮含量都下降，接种组的波动幅度比对照组大，可能是高浓度盐抑制了蛋白质酶活性，是蛋白质降解作用减少。根据王令建15的研究，接种复合发酵剂后，总氮含量呈先上升，后下降的变化，最终含量为2.541%和2.154%。由于微生物的作用,产生了一些诸如水溶性氮,非蛋白氮,磷钨酸溶性氮,硫代水杨酸溶性氮和总挥发性氮的增加。该实验与其研究结果相似，。第30d，最终总氮含量为2.938%和2.864% 总氮含量最终呈上升趋势，接种组与对照组变化趋势相同，接种组更明显。2. 2 蛋白质水解指数变化四川香肠成熟过程中蛋白质水解指数变化见图2：图2 四川香肠自然晾挂成熟过程中蛋白水解指数的变化蛋白质水解程度通常用蛋白水解指数(p.i.)表示，p.i.是指发酵香肠中非蛋白氮占总氮的百分含量。由图可看出两组香肠在成熟晾挂的30d中蛋白质的水解一直在不断进行，在第30d时可能由于较高的食盐浓度抑制了组织蛋白酶活性，从而使蛋白质的降解作用减少。两组产品的水解指数在前4d，急速增加（p0.05），对照组与接种组相近；在晾挂第4d后接种组的水解指数显著高于对照组（p0.05），说明添加复和发酵剂，更利于蛋白质的分解。非蛋白氮能在一定程度上反映蛋白质的降解情况。非蛋白氮含量增加，表明多肽及氨基酸类营养素增多，具有一定的营养学意义16。蛋白质的降解作用贯穿于加工成熟的全过程，降解产生的游离氨基酸和短肽积聚，使非蛋白氮含量持续上升。在成熟后期，高浓度食盐抑制了蛋白分解酶和微生物活性，使非蛋白氮含量有所下降17。2. 3 挥发性盐基氮含量变化四川香肠成熟过程中挥发性盐基氮含量变化见图3：图3 两组四川香肠自然晾挂成熟过程中挥发性盐基氮含量的变化挥发性盐基态氮是一些细菌分泌的蛋白分解酶对蛋白质的分解，产生的氨及胺类等碱性含氮物质，导致肉类腐败，它是衡量肉类腐败变质的重要指标18。肉制品中含有较多的蛋白质，根据指标，合格新鲜香肠中的挥发性盐基氮应小于0.3mg/g。由图3可看出，两组产品的挥发性盐基氮在自然晾挂成熟的025d一直呈上升趋势，第25d时达到最大值，分别为27.68mg/100g和26.05mg/100g，到第30d有所下降,终值分别为19.94mg/100g和20.12mg/100g。其下降原因可能和部分低分子含氮物（碱性）与风干后期发酵所产生的酸结合有关，也可能是因为水分散失导致了肉馅内的高盐环境，而较高浓度的食盐抑制了原料肉中组织蛋白酶和微生物酶的活性，使得蛋白质的分解减少。由图可知，对照组的挥发性盐基氮含量高于接种组，是因为复合发酵剂未能抑制杂菌生长繁殖和阻止杂菌对于蛋白质、氨基酸的降解作用，但可能在降解过程中为风味物质提供了更多前体物质，有助于改善香肠风味。2. 4 氨基酸态氮的变化四川香肠成熟过程中总氮含量变化见图4：图4 两组四川香肠自然晾挂成熟过程中氨基酸态氮的变化 由图4可看出两组香肠的氨基酸态氮含量都呈现上升趋势。在灌肠当天接种组氨基酸态氮含量显著高于(p 0.01）对照组，原料肉组织和微生物中的蛋白酶能够分解肌原纤维促进蛋白质的降解，因此可能是由于接种组中接种的乳酸菌和葡萄球菌加大了对蛋白质的降解。在第13d前，接种组高于对照组，可能是接种组的水分含量低于对照组，从而使接种组的氨基酸态氮的相对含量偏高。香肠中的氨基酸态氮与寡肽等成分协同作用，能有效地促进发酵香肠风味的形成19。第14d18d，对照组高于接种组，有可能是接种组各菌群相互竞争，相互制约，使蛋白质分解能力受限。成熟的前一阶段氨基酸态氮的上升主要原因可能是水分的降低以及蛋白质和多肽的降解引起的，之后氨基酸态氮含量趋于稳定乃至减少，这可能是因为较高的食盐浓度抑制了组织蛋白酶的活性，从而使蛋白质的降解作用减少，另外部分氨基酸态氮参与了香肠风味的形成，自身被消耗。3 .结论（1）在四川香肠发酵成熟过程中，总氮含量、蛋白质水解指数、挥发性盐基氮、氨基酸态氮基本呈上升趋势。接种组和对照组的变化趋势相同，接种组变化更明显。（2）挥发性盐基氮和氨基酸态氮含量均呈上升趋势，且接种组变化程度大，表明加入复合发酵剂后，蛋白质分解程度更大，有利于更多风味前体物质的形成。（3）挥发性盐基氮是衡量肉类腐败变质的重要指标，合格新鲜香肠中的挥发性盐基氮应小于0.3mg/g。接种组的挥发性盐基氮含量低于对照组，说明接种复合发酵剂，有利于香肠保鲜。参考文献1 张元生,许益民.微生物在肉类加工中的应用m.北京:中国农业出版社,20012 刘士健,王建晖,李洪军.国内外香肠发酵的研究现状j.肉类工业,2004, (6):25-273 hugas m monfort j.m. bacterial starter cultures for meat fermentationj.food chemistry, 1997,59: 547-5544 王卫.发酵香肠的加工工艺及微生物特性j. 肉类研究, 2002, (3): 10-175 宋照军, 马汉军, 等. 发酵肉制品发酵剂的研究和应用j. 食品工业科技, 1998, (5): 68-706 马长伟,王雪青.发酵香肠及微生物发酵剂(二)j.食品与发酵工业, 1998, 24(5): 77-807 卢士玲, 吴桂春, 李开雄. 发酵肉制品优势菌研究现状j. 中国食物与营养, 2006(3):22-248 吴祖兴, 张华. 发酵肉制品乳酸菌菌种筛选研究j.食品科学, 2002, (23):47-499 李华丽,何煜波.肉品发酵剂常用菌种及其混合发酵特性j.中国食品添加剂,2005,1:70-7310 moiler j k,hinrichsen l l,andersen h j.formation of aminoacid (l leucine,l -phenylalanine)derived volatile flavor compounds by moraxella phenylpyruvica and staphylococcus xylosus in cured meat model systems j.int j food microbiol, 1998,42(1-2):101-10711 cofey,ryan.use of a broad -host -range bacteriocin producing lactcoccus lactis transeonjugant as an alternative starter for salarnimanufacturej.international journal of fo