微生物生理学方面的论文.doc

酵母菌在以纤维素为原料产酒精方面的生理学原理及应用1 应用研究意义环境污染、全球变暖和能源短缺已经使可持续发展成为当今世界各国所面临的最大挑战。为了逐渐摆脱对石油的过度依赖，减少温室气体排放，许多国家纷纷寻找石油的替代能源。我国是仅次于美国的能源消费大国，需要从国外进口大量的石油，2004年我国石油消耗已达到3亿t，其中进口石油1.2亿多t，石油对外依存度超过30。预计2020年我国石油消费量最少需要45亿t，届时石油对外依存度可能达到60，因此确保国家能源安全具有重大的战略意义。随着人类的发展和社会的进步，人们更加关注环境问题。石油和天然气在使用过程中会产生大量NOx、SO2、CO2等气体，这些气体导致全球气候的变化，以生物质为基础的液体燃料利用，可以明显减少温室气体排放，以在汽油中添加10的燃料乙醇为例，将可减少2530的CO排放，分别减少6-10和20的CO2和氮氧化物排放。 燃料乙醇不仅是一种优质的液体燃料，可以直接代替汽油、柴油等石油燃料，是最易工业化的一种民用燃料或内燃机燃料，也是最具发展潜力的石油替代燃料。生物质可以通过热化学转化和生物转化的方法生产燃料乙醇，目前工业上利用生物质通过生物转化方法生产燃料乙醇的原料主要是农产品，如高粱、玉米淀粉以及蔗糖等。 随着新一轮世界粮食危机的到来，导致全球粮食供应紧张；另一方面燃料酒精的需求量越来越大，以粮食或糖类物质生产燃料酒精导致与人争粮、与粮争地的矛盾将更加突出。纤维素是最丰富、廉价的可再生资源，植物每年通过光合作用能产生高达1 550亿t纤维素类物质，其中纤维素、半纤维素的总量为600亿t。因此采用来源更广泛、成本更低廉的木质纤维素生产燃料酒精，可从根本上实现能源工业的可持续发展。2. 酵母菌在在酒精发酵方面，所遇到的毒性问题酒精的生产方法大体上有两种, 一种是微生物发酵法另一种是化学合成法。目前, 微生物发酵法所用的原料主要是淀粉和糖类。因此就存在一个生产原料与人类食品的相互竞争问题。另外, 随着人口的不断增长, 能源危机, 食品短缺, 环境污染等问题也将显得更加突出。因此, 开发利用纤维素原料显得尤为重要。目前, 纤维素的酒精发酵主要有两种方法一种是酸水解发酵法, 另一种是酶水解发酵法。虽然经过二十多年研究, 在纤维素的酶法水解发酵方面有了一定的进展，但是与酸法水解发酵相比较, 它仍存在很多不足之处, 如纤维素的酶解效率不高, 原料没有被充分利用, 生产周期长, 成本高等。因此, 纤维素酒精发酵在目前仍以酸法水解发酵工艺为主。这一工艺已经比较成熟, 目前生产中存在的主要问题就是关于水解产物对酵母菌发酵的“ 毒性问题”。2. 1 纤维素酸解产物对发酵微生物的抑制作用2.1.1纤维素类原料水解过程中各物质的变化天然存在的纤维素原料主要包含有三大类物质纤维素、半纤维素和木质素。据分析, 天然的纤维素物料其纤维素的含量一般在40%60%（棉花可达90%以上）, 半纤维素含量为20%一40%, 木质素为10%一25%。因此, 纤维素的酸水解过程中必然包含以上三大类物质的水解在热酸的作用下, 纤维素降解主要转化生成葡萄糖半纤维素则生成多种单糖, 主要有木糖, 阿拉伯糖, 甘露糖等木质素则降解成多种单环芳香族化合物。另外, 由于在热酸的作用下以上各生成物不稳定。因此, 在水解过程中还存在多种形式的分解、氧化等复杂反应。在这一过程中的主要生成物有甲酸、乙酸、糠醛、经甲基糠醛、糖醛酸、己糖酸等。在发酵工业上, 将以上各种物质分为两大类。其中一类为可发酵性糖, 主要有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖以及甘露糖等另一类则是酒精发酵工业上所谓的“ 有毒物质” , 主要包括各种有机酸、醛类物质以及一些无机离子等。2.1.2水解产物中存在的毒性物质纤维素水解产物对于酒精发酵的抑制作用主要表现在：抑制菌体生长；降低微生物对于营养物质的利用速率；抑制酒精的生成, 降低酒精的产率。早在二十年前就有人注意到这种抑制作用, 并且对它进行了研究。为了确定水解产物中存在的“ 毒性物质” ,人们从水解产物中各组分的分子大小,所带电荷, 相对挥发性等方面对它们进行了大量的研究。结果表明水解产物中存在的多种有机酸和醛类物质是这种抑制作用的主要来源。其中有机酸主要包括甲酸、乙酸、乙酞丙酸、己酸、糖醛酸以及其它一些芳香酸等。醛类物质主要有糖醛以及来源于木质素降解生成的一些芳香醛(如,4一经基苯甲醛、3一甲氧基水杨醛、4一羟一3,5 一二甲基苯甲醛等)。 研究结果还表明各种物质的抑制作用大小与其浓度有很大关系。在它们作为抑制剂单独存在时, 仅有在较高的浓度下才会表现出较明显的抑制作用。如, 对大肠杆菌的生长达到80%的抑制强度, 乙酸浓度需达到17.0g/l, 糖醛酸也需达到2.5g/l的浓度。但是, 在实际生产中, 即使这些“ 有毒物质” 的浓度远低于以上浓度,它们也会反映出很强的抑制作用。这一点在某种程度上说明了纤维素酸解产物对发酵的抑制作用并非来源于某一种水解产物, 而是几种或几类产物共同作用的结果, 而且这种共同的抑制结果并非是各物质抑制结果的简单叠加, 在这些物质之间必然还存在某种协同作用。 对于这种协同抑制作用近年来已有报道。有人利用酵母菌发酵纤维素水解液产酒精, 研究了水解产物中存在的乙酸、糖醛以及经基苯甲酸对酵母的生长以及酒精产率的影响。结果表明低浓度的乙酸(9g/l)和糖醛(2g/l)在单独存在时, 对酒精发酵并无明显抑制作用。相反, 它们对酒精单位体积产率、比产率, 以及菌体比生长量有促进作用。但是在它们共同存在时, 即使两者均处于低浓度, 对酒精发酵也表现出较强的抑制作用。另外也有人研究纤维素水解产物中各种有机酸与醛对菌酒精发酵的抑制作用时, 同样也发现酸的这种抑制作用会因醛的协同作用而加强。3各种有毒物质抑制发酵的作用机理3.1 有机酸的致毒机理, ,有机酸抑制微生物酒精发酵的作用机理, 近几年研究的较多。对于这一机理, 现在较为一致的解释是基于Russell和Palmqvist的一个假说。各种有机酸对微生物生长及酒精发酵的抑制主要是通过破坏存在于细胞膜上氢离子梯度完成的。根据化学渗透理论, 存在于细胞膜上的质子电位是电子传递与氧化磷酸偶联作用的中间媒介。在正常情况下, 胞内多余的质子由电子传递所驱动的质子泵排出胞外, 另外通过ATP的合成消耗这种膜电位, 胞外的质子在ATP合成酶质子泵推动下进人胞内。因此, 在胞内外可维持一定的质子梯度, 在电子传递, ATP合成之间形成了一个质子回路。细胞膜上的这种质子回路作为细胞能量来源之一, 除了ATP形成外, 还有驱动简单主动输送的功能。因此, 质子回路的破坏将直接影响细胞内能量的产生以及营养物质的吸收和利用。 在酸性条件下, 有机酸分子可以通过简单扩散方式跨过细胞膜进人细胞。由于胞内较高接近中性, 因此大多数有机酸分子在胞内离解, 使得胞内氢离子浓度增加, 从而破坏了胞内外存在的离子梯度, 膜电位降低。为了维持膜电位, 以推动一些营养物质的跨膜运送, 必须将胞内过量的氢离子排出胞外。此时仅依靠电子传递质子泵已经难以达到目的, 在这种情况下细胞将利用水解ATP来驱动合成酶质子泵反转, 将胞内十排出胞外。由于的大量消耗, 又不能从呼吸偶联作用得到补充, 使得在胞内用于代谢的供应不足, 从而导致一些必需的酶、辅酶以及一些营养物质的缺乏,使得细胞代谢缓慢, 原料利用速率下降, 甚至引起细胞死亡。 根据这一假说, 有机酸对于微生物生长的抑制作用大小应与其疏水性相关。疏水性不同, 则它们主动扩散的强度不同。因此对氢离子梯度的破坏程度不同, 从而表现出不同的抑制强度。另外, 由于有机酸的这种抑制作用仅有在它以分子形式进人细胞膜后才得以表现出来。因此, 如果调节发酵液的pH, 使有机酸分子浓度发生变化必将影响其抑制强度。对于以上两种情况在很多实验中已得到验证。如Jesus.Zaldivar等人在研究纤维素水解产物中各种有机酸对于大肠杆菌的抑制作用时发现：各种有机酸对菌体生长的抑制随的升高而减弱, 并且不同有机酸抑制作用与其疏水性直接相关, 疏水性强则其抑制作用也强。另外, 这一假说也可以很好地解释低浓度有机酸对酵母的生长及酒精发酵的促进作用。这主要是由于低浓度有机酸引起的氢离子破坏, 增加了ATP的消耗, 从而刺激了ATP的合成反应（即底物水平磷酸化）,使得底物的利用速度加快。因此酒精的生成速率增加。但是, 随着酸浓度的增加,ATP的需求也随之增大, 一旦这种需求超过某一极限（ATP底物水平磷酸化的极大值）, 则酸对发酵过程将产生明显的抑制, 表现出细胞生长缓慢, 营养物质的利用速率以及酒精生成速率下降。 4 解决纤维素酸解产物的毒性的方法纤维素水解产物的毒性问题一直以来是阻碍纤维素酒精发酵的主要因素。因此寻求一个既经济又方便适用的解毒方式是人们长期以来研究的热点。现在较常用的解毒方式主要有以下几种: 4.1 使用高接种量达到脱毒目的, 高接种量对于纤维素水解产物毒性的影响早在年就有报道。有人在研究不同酵母接种量对酸解产物毒性影响时就发现水解液的这种抑制发酵作用主要存在于发酵初期, 并且, 随着发酵的进行, 抑制作用逐渐减弱。通过增大接种量, 依靠细胞的繁殖弥补死亡或受抑制的细胞, 从而使细胞浓度维持在一定范围。一旦这些有毒物被消耗,毒性被解除。则活性细胞大量增殖, 使发酵恢复正常。这就是高接种量脱毒的基本原理。 4.2 用过量的固体ca(OH)2预处理酸解液这种方法在工业上已经有应用, 通过用过量的固体处理过的水解液, 其发酵能力明显增强。最近研究表明这种脱毒的机理可能是利用处理除去了水解液中存在的一些无机离子, 而这些离子可能对发酵有抑制作用。另外也调节了水解液的使一些有毒物抑制作用减弱。4.3 调节发酵液的值大量研究表明用于发酵的纤维素水解液不同, 则它对微生物酒精发酵的抑制作用强弱不同。升高, 有机酸的抑制作用明显减弱各种醛除糠醛的抑制作用也会减弱糠醛在时抑制作用最弱。因此适当地控制发酵液的以减轻各种水解产物的毒性也是可行的。4.4 除去水解液中的部分有毒物质由于各种有毒物仅在他们达到一