微生物生化和血清学试验标准操作规程.doc

触酶试验标准操作规程1. 目的规范触酶试验标准操作规程。 2原理 具有触酶(过氧化氢酶)的细菌，能催化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧，出现气泡。 3试剂 3过氧化氢溶液。 4质控 金黄色葡萄球菌ATCC 25923阳性，肺炎链球菌ATCC 4961 9阴性。 5操作步骤 取3过氧化氢溶液05 ml，滴加于不含血液的细菌琼脂培养物上，或取13 ml滴加入盐水菌悬液中。 6结果判断 培养物出现气泡者为阳性。 7注意事项 71细菌要求新鲜。 72不宜用血琼脂平板上的菌落作触酶试验，因红细胞内含有触酶，可能出现假阳性。 73需用已知阳性菌和阴性菌作对照。 8临床意义 在革兰阳性球菌中，链球菌触酶试验阴性，葡萄球菌及微球菌均阳性，因此可用于革兰阳性球菌的初步分群。氧化酶试验标准操作规程1目的 l 规范氧化酶试验标准操作规程。 2. 原理氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。3 . 试剂盐酸二甲基对苯二胺(或四甲基对苯二胺)0.1g，加蒸锱水10ml，置于棕色瓶内可用一周。冰箱保存，或分装于棕色瓶内密封。4. 质控铜绿假单胞菌ATCC27853阳性，大肠埃希菌ATcc 25922阴性。 5. 操作步骤去洁净的滤纸一小块， 蘸取菌苔少许，加1滴10gL盐酸二甲基对苯二胺溶液于菌落上，观察颜色变化。 6结果判断 立即呈粉红色并迅速转为紫红色者为阳性。 7. 注意事项 71 试剂在空气中易氧化，故应经常更换新试剂，或配置时试剂内加入01维生素c以减少自身氧化。7. 2 不宜采用含葡萄糖培养基上的菌落(葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性)。 73实验时应避开含铁的培养基等含铁物质，因本实验过程中，遇铁时会出现假阳性。8 . 临床意义 8. 1 用于奈瑟菌属非发酵等细菌的鉴定。如果肠杆菌科不进行本试验，则可能将氧化82所有的革兰阴性菌均应进行氧化酶试验，如果肠杆菌科不进行本试验，则可能将氧化酶阳性的嗜水气单胞菌错误地鉴定为大肠埃希杆菌或沙雷菌。凝固酶试验标准操作规程 1目的 规范凝固酶试验标准操作规程。 2原理 金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合凝固酶，结合在细胞壁上，使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附着于细菌表面，发生凝集，可用玻片法测出。另一种是菌体生成后释放于培养基中的游离凝固酶，能使凝血酶原变成凝血酶类物质，从而使血浆凝固。 3试剂 新鲜人或兔血浆，生理盐水。 4质控 金黄色葡萄球菌ATCC 25923阳性，表皮葡萄球菌ATCC 57625阴性。 5操作步骤 51 玻片法取兔或混合人血浆和盐水各1滴分别置清洁载玻片上，挑取待检菌菌落分别与血浆及盐水混合。如血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象为阳性。 52试管法取试管2支，分别加入05 ml的血浆(经生理盐水1：4稀释)，挑取菌落数个加入测定管充分研磨混匀，用已知阳性菌株加入对照管，37水浴34小时。血浆凝固为阳性。 6结果判断 玻片法：如血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象为阳性。试管法：血浆凝固为阳性。 7注意事项 若被检菌为陈旧的肉汤培养物(1824小时)或生长不良、凝固酶活性低的菌株往往出现假阴性。 8临床意义 金黄色葡萄球菌凝固酶试验为阳性，而表皮葡萄球菌及腐生葡萄球菌凝固酶试验为阴性，故此试验对鉴别葡萄球菌有重要价值。DNA酶试验标准操作规程 1目的 规范DNA酶试验标准操作规程。 2原理 某些细菌可产生细胞外DNA酶。DNA酶可水解DNA长链，形成数个单核苷酸组成的寡核苷酸链。长链DNA可被酸沉淀，而水解后形成的寡核苷酸则可溶于酸，当在菌落平板上加入酸后，若在菌落周围出现透明环，表示该菌具有DNA酶。 - 3试剂 31 DNA琼脂成分 DNA(脱氧核糖核酸) 20 g 胰蛋白胨 15 g 大豆胨 50 g 氯化钠 50 g 琼脂 20g 蒸馏水 1 000 ml pH 7274 32制备将上述成分混合于蒸馏水中，加热溶解，校正pH，分装三角烧瓶，经1 15C灭菌l5分钟，倾注于灭菌平皿，冷藏备用。 4质控 黏质沙雷菌ATCC 1404l为阳性，大肠埃希菌ATCC 25922为阴性。 | 5操作步骤 将待检菌点状接种于DNA琼脂平板上，35培养1824小时，在细菌生长物上加一层lmolL盐酸(使菌落浸没)。 6结果判断 菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。 7注意事项 | 培养基表面凝固水需烘干，以免细菌呈蔓延状生长。也可在营养琼脂的基础上增加02DNA 8临床意义 肠杆菌科中的沙雷菌和变形杆菌可产生DNA酶，革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，因此可用于鉴别。CAMP试验标准操作规程 1目的 规范CAMP试验标准操作规程。 2原理 B群链球菌具有“CAMP因子，能促进葡萄球菌p溶血素的活性，使两种细菌在划线处呈现箭头形透明溶血区。 3试剂 金黄色葡萄球菌ATCC25923，血琼脂平板。 4质控 无乳链球菌ATCC 13813阳性，化脓链球菌ATCC 19615阴性。 5操作步骤 先用产溶血素的金黄葡萄球菌在血琼脂平板上划一横线，再取待检的链球菌与前一划线作垂直划线接种，两者相距()51 cm。置35孵育1824小时，观察结果。 6结果判断 在两种细菌划线的交界处，出现箭头形透明溶血区为阳性。 7注意事项 被检菌与金黄色葡萄球菌划线之间留出0.51 cm距离，不得相接。 8临床意义 主要用于鉴定B群链球菌(阳性)，其他链球菌本试验阴性。Optochin敏感试验标准操作规程1目的 规范Optochin敏感试验标准操作规程。2原理 0ptochin(ethylhydrocupreine，乙基氢化去甲奎宁的商品名)可干扰肺炎链球菌叶酸的生物合成，抑制该菌的生长，故肺炎链球菌对其敏感，而其他链球菌对其耐药。 3试剂 血琼脂平板，Optochin纸片(含药5 ug)。 4质控 肺炎链球菌ATCC 49619阳性，粪链球菌ATCC 979)阴性。 5操作步骤 将待检的旺溶血的链球菌均匀地涂布在血琼脂平板上，贴放Optochin纸片(含药5 ug)，35孵育1824小时。观察抑菌圈的大小。 6结果判断 抑菌圈10mm为肺炎链球菌。 7注意事项 71 做Optochin敏感试验的平板不能在C02环境下培养，因其可使抑菌圈缩小。 72 同一血琼脂乎板可同时测定几株菌株，但不要超过4株被测菌。 73 Optochin纸片町保存于冰箱中，一般可保存9个月。但如用已知敏感的肺炎链球菌检测为耐药时，纸片应废弃。 8临床意义 用于肺炎链球菌与其他链球菌之鉴别。肺炎链球菌对Optochin敏感，而其他链球菌则耐药七叶苷试验标准操作规程1. 目的 规范七叶苷分解试验标准操作规程。 2原理 粪肠球菌能分解七叶苷，其代谢产物与铁离子结合产生黑色沉淀，使培养基变黑。 3试剂 31七叶苷琼脂成分 蛋白胨 5 g 磷酸氢二钾 1 g 牛肉膏 3 g 七叶苷 1g 枸橼酸铁 0.5 g 蒸馏水 1000m1 pH 72 32 制备上述各成分混合溶解后，调pH至72，分装试管，高压灭菌，冷藏备用。 4质控 粪肠球菌ATCC 29219阳性，肺炎链球菌ATCC 49619阴性。 5操作步骤 将试验菌接种于七叶苷琼脂斜面上，经35孵育1824小时后取出，观察结果。 6结果判断 培养基变黑色，为阳性。 7注意事项 71 若接种七叶苷液体培养基，阳性者经35孵育36小时，培养基即可变黑。 72其他链球菌亦能在此培养基上生长，但不变黑；肺炎链球菌不生长。 8临床意义 主要用于鉴别D群链球菌与其他非D群链球菌。卫星试验标准操作规程1目的 规范卫星试验标准操作规程。2原理 金黄色葡萄球菌会产生一种扩散性蛋白CAMP因子(合成脱氢酶)，并渗入培养基中，刺激流杆嗜血杆菌生长。 3试剂 血琼脂平板，金黄色葡萄球菌。 4质控 流感嗜血杆菌ATCC 10211阳性，卡他莫拉菌ATCC 49226阴性。 5操作步骤 挑取可疑菌落，接种于血琼脂平板上，作浓密连续划线后，再将金黄色葡萄球菌点种其上(24处)，于37培养24小时后观察结果。 6结果判断 如见葡萄球菌菌落邻近处的菌落较大，而远离金黄色葡萄球菌菌落处的菌落小，即为“卫星见象”阳性。可初步鉴定为流感嗜血杆菌。 7注意事项 若产生大的新月形或箭头形溶血，则为CAMP阳性，即B型链球菌，而小区溶血及不溶血为阴性反应。 8临床意义 用于流感嗜血杆菌与其他细菌的鉴别。糖(醇、苷)类发酵试验标准操作规程 1目的 规范糖(醇、苷)类发酵试验标准操作规程。 2原理 不同细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖的能力各不相同，产生的代谢产物也随细菌种类而异。观察细菌能否分解各类单糖(葡萄糖等)、双糖(乳糖等)、多糖(淀粉等)和醇类(甘露醇)、糖苷(水杨苷等)，是否产酸或产气。 3试剂 31成分 蛋白胨 10 g 牛肉膏 3 g 氯化钠 5 g 溴甲酚紫指示剂 10 ml 蒸馏水 1 000ml 32制备将上述成分混合后，加热使其溶解。校正pH至7172，用滤纸过滤；根据需要，分别加需要的糖和醇；分装于试管，每管内3 ml，置高压灭菌器内，经115。C 10分钟灭菌。置4左右冰箱备用。4质控大肠埃希菌ATCC 25922阳性(加葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖)，奥斯陆莫拉菌ATCC 25829阴性。5操作步骤将纯培养的细菌接种至各种糖培养管中，置一定条件下孵育后取出，观察结果。6结果判断若细菌能分解此种糖类产酸，则指示剂呈酸性变化；不分解此种糖类，则培养基无变化。产气可使液体培养基中倒置的小管内出现气泡，或在半固体培养基内出现气泡或裂隙。7注意事项 糖发酵的基础培养基内必须不含有任何糖类和硝酸盐，以免出现假阳性反应。因有些细菌可使硝酸盐还原产生气体，而影响发酵糖类产气结果的观察。 8临床意义 糖发酵试验是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖类。葡萄糖OF试验标准操作规程1目的 规范OF试验标准操作规程。 2原理 又称氧化发酵(oF)试验，观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧(氧化型)，还是无氧降解(发酵型)，或不分解葡萄糖(产碱型)。 3试剂 31 OF基础培养基成分 蛋白胨 2 g 氯化钠 5 g 磷酸氢二钾 0.2 g 琼脂 3 g 溴甲酚紫(1.6水溶液) 1.0ml 蒸馏水 1000ml 葡萄糖 1 g32制备 上述成分除指示剂外加热溶解后校正pH至71，加人指示剂并分装13100 mm的试管，每管23 ml，置高压灭菌器内，经11515分钟的灭菌，即为OF基础培养基。最终糖浓度为1。 4质控 铜绿假单胞菌ATCC 27853开放管为黄色，封闭管为紫色；大肠埃希菌ATCC 25922开放管、封闭管均为黄色。 5操作步骤 从平板上或斜面培养基上挑取少量细菌，同时穿刺接种于2支OF试验管，其中1支用滴加熔化的无菌凡士林(或液体石蜡)覆盖培养基液面030.5 cm高度。经37。C培养48小时后，观察结果。 6结果判断 仅开放管产酸为氧化反应，两管都产酸为发酵反应，两管均不变为产碱型。 7注意事项 有些细菌不能在OF培养基上生长，若出现此类情况，应在培养基中加入2血清或01酵母浸膏，重做OF试验。 l8临床意义 葡萄糖OF试验可用于葡萄球菌与微球菌的鉴别，前者为发酵型细菌，后者为氧化型细菌。更重要的是用于革兰阴性杆菌的鉴别，肠杆菌科的所有细菌均为发酵型细菌，而绝大多数的非发酵菌则为氧化型或产碱型细菌。 三糖铁试验标准操作规程1目的 规范三糖铁试验标准操作规程。 2原理 能发酵葡萄糖和乳糖的细菌产酸产气，使三糖铁的斜面和底层均呈黄色，并有气泡产生；只能发酵葡萄糖，不发酵乳糖的细菌，使斜面呈红色，而底层呈黄色；有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢(H2S)，H：S遇铅或铁离子形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物；分解尿素，呈红色。 3试剂 31三糖铁琼脂成分 上层：乳糖 10g 蔗糖 10g 葡萄糖 1 g 硫酸亚铁 0.2 g 蛋白胨 20g 琼脂 20 g 硫代硫酸钠 0.2 g 氯化钠 5 g 0.2酚红 12.5 ml 蒸馏水 1 000 ml 下层：牛肉膏 18 g 酸性磷酸钾 1.2 g 02酚红 18 ml 蛋白胨 6 g 琼脂 3 g 氯化钠 3 g 尿素 12 g 蒸馏水 600 ml 32制备 上层制备：成分混合后，加热溶解，校正pH至76，分装三角烧瓶内，115灭菌15分钟。 下层制备：下层成分(除尿素以外)混合后，加热溶解，校正pH至72，然后加入尿素分装每管约15 ml，115灭菌1520分钟。再取葡萄糖05 g、()1酚红溶液10 ml混入已溶解的琼脂中。充分摇匀，使其溶解，分装于试管中，每管约1.5ml，置高压灭菌器内，经115。C灭菌10分钟。取出后，待其直立凝固。下层凝固后，用无菌手续，将上层培养基趁热装于下层培养基上面。凝固后将其置于37。C培养箱中，培养1824小时，如无杂菌污染，可存于冰箱中备用。 l4质控 大肠埃希菌ATCC 25922，三糖铁琼脂上、下层均为黄色，福氏志贺菌CMCC 51573，三糖铁琼脂上层不变，下层为黄色。 l5操作步骤 挑取纯菌落接种于三糖铁琼脂上，35孵育1824小时。 6结果判断出现黑色沉淀物为H2S阳性。7注意事项三糖铁琼脂上下层配制时，高压灭菌时掌握好温度和时间，以免培养基中的糖被分解。8临床意义三糖铁琼脂用于观察细菌对糖的发酵能力，以及是否产生H2S，可初步鉴定细菌的种属.甲基红试验标准操作规程1. 目的规范甲基红试验标准操作规程。2. 原理某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸进一步代谢分解为乳酸、甲酸、乙酸，使培养基的pH下降到4.5以下，加入甲基红指示剂即显红色（甲基红变红的范围为pH4.46.0），某些细菌虽能分解葡萄糖，但产酸量少，培养基的pH在62以上，加甲基红指示剂呈黄色。3. 试剂3-1 葡萄糖蛋白胨水培养基成分 多价蛋白胨 7 g 葡萄糖 5 g 磷酸氢二钾 5 g 蒸馏水 1000ml pH 72 3. 2制备 将上述成分混合溶解后，分装小试管，高压121灭菌15分钟。 3. 3式刑 甲基红 0.1 g 95乙醇 300m1 蒸馏水 200ml 4. 质控 大肠埃希菌ACTT 25922为红色，阴沟肠杆菌ACTT 13047为黄色。 5. 操作步骤 将待检菌接种至葡萄糖蛋白胨水培养基中，35孵育12日，加人甲基红试剂2滴，立即观察结果。 6. 结果判断 红色者为阳性，黄色者为阴性。 7. 注意事项 7. 1 培养基中的蛋白胨可影响甲基红试验结果，在使用每批蛋白胨之前要用已知甲基红阳性菌和阴性菌做质量检测。 72 甲基红反应并不因增加葡萄糖的浓度而加快。 73 孵育时间不得少于48小时，若过早地判断结果，往往可造成假阴性。 8. 临床意义 主要应用于鉴别大肠杆菌和产气杆菌。 VP试验标准操作规程1目的规范VP试验标准操作规程。2原理某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步将丙酮酸脱羧成为乙酰甲基甲醇，后者在碱性环境中被空气中的氧氧化成为二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等所含的胍基结合，形成红色的化合物，即VP试验阳性。3试剂31 葡萄糖蛋白胨水培养基成分 多价蛋白胨 7 g 葡萄糖 5 g 磷酸氢二钾 5 g 蒸馏水 1000 ml pH 7.232制备将上述成分混合溶解后，分装小试管，高压115灭菌1 5分钟。33试剂 甲液：6萘酚酒精溶液； 乙液：40KOH溶液。4质控大肠埃希菌ATCC 25922为无红色出现，肺炎克雷伯菌ATCC 13883为红色。5操作步骤51 将待检菌接种至葡萄糖蛋白胨水培养基中，35孵育12日。52观察方法 贝氏(Barritt)法观察时按每2 ml培养物加甲液1 ml、乙液0.4ml混合，置35，1530分钟出现红色为阳性。若无红色，应置37，4小时后再判定，本法较奥氏法敏感。6结果判断呈红色者为阳性。 ，7注意事项71许多实验室工作人员有一个错误的印象，即VP试验阳性菌甲基红试验自然是阴性，或反之亦然。实际上，肠杆菌科的大多数细菌产生相反的反应(由于乙酰甲基甲醇形成碱性，导致甲基红试验阴性和VP试验阳性)。某些细菌如蜂房哈夫尼菌和奇异变形杆菌，35培养可产生甲基红试验和VP试验同时阳性反应，后者常延迟出现。 72 萘酚酒精溶液易失效，试剂放室温暗处可保存1个月。KOH溶液可长期保存。国内多采用贝氏法。8临筒床葸义 本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性，反之亦如此。如大肠埃希菌、沙门菌等甲基红呈阳性反应，而VP试验则为阴性；相反，如沙雷菌、阴沟杆菌等，VP试验阳性，而甲基红反应为阴性吲哚试验标准操作规程1目的 规范吲哚试验标准操作规程。 2原理 有些细菌具有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸，生成吲哚，吲哚与试剂对二甲氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。3试剂 l31 蛋白胨水培养基成分 蛋白胨(或胰蛋白胨) 10g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1000 ml pH 7.2 32 制备将上述成分溶于水中校正pH至72，分装试管，每管23 ml，置121灭菌15 分钟备用。 4质控 大肠埃希菌ACTT 25922为红色，肺炎克雷伯菌ATCC 13883为无色。 5操作步骤 将待检菌接种至蛋白胨水培养基中，35孵育12日，沿管壁慢慢加入柯凡克(Kovacs)试剂0.5ml即刻观察结果。 6结果判断 两液面交界处呈红色者为阳性，无红色者为阴性。 7注意事项 蛋白胨中应含有丰富的色氨酸，否则不能应用。 8临床意义主要应用于肠杆菌的鉴别。硝酸盐还原试验标准操作规程1目的 规范硝酸盐还原试验标准操作规程。 2原理 硝酸盐培养基中的硝酸盐可被某些细菌还原为亚硝酸盐，后者与乙酸作用生成亚硝酸。亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸，再与Q萘胺结合成红色的Na茶胺偶氮苯磺酸。 3试剂 31硝酸盐培养基成分 蛋白胨 10g 硝酸钾(AR) 2 g 蒸馏水 1000ml pH 7.432制备上述成分混合后，加热溶解，调pH至74。分装试管，每管约4 ml，121 15分钟高压灭菌后备用。 33试剂配制 ；甲液：对氨基苯磺酸 0.8g 5 molL乙酸 100 ml 乙液：萘胺 0.5 g 5 molL乙酸 100 ml 4质控 大肠埃希菌ATCC 25923为阳性，鲍曼不动杆菌ATCC 19606为阴性。 5操作步骤 将待检菌株接种于硝酸盐培养基，35孵育I2日，加入试剂甲液和乙液各2滴，立即观察结果。若加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否被还原。可于原试管内再加入少许锌粉，如出现红色，证明产生芳基肼，表示硝酸盐仍然存在；若仍不产生红色，表示硝酸盐已被还原为氨和氮。也可在培养基内加1支小倒管，若有气泡产生，表示有氮气生成，以排除假阴性。 6结果判断 l呈红色者为阳性。若不呈红色，再加入少许锌粉，如仍不变为红色者为阳性，表示培养基中的硝酸盐已被细菌还原为亚硝酸盐，进而分解成氨和氮。加锌粉后变为红色者为阴性，表示硝酸|盐未被细菌还原，红色反应是由于锌粉的还原所致。 7注意事项 本试验在判定结果时，必须在加试剂之后立即判定结果，否则因颜色迅速褪色而造成判定困难，如铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等。8. 临床意义本试验在细菌鉴定中广泛应用，肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐，部分假单胞菌产生氮气。脲酶试验标准操作规程1目的规范脲酶试验标准操作规程。2原理某些细菌能产生脲酶，分解尿素形成氨，使培养基变碱，酚红指示剂随之变红色。3试剂31 尿素培养基成分 蛋白胨 1.0g 氯化钠 2.0g 葡萄糖 1.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 0.4酚红溶液 3.0 ml 琼脂 1820 g 20尿素溶液 100 ml 蒸馏水 1000ml pH 7032制备将上述成分(除酚红、尿素外)混合于蒸馏水中，加热溶解，校正pH，