植物基因组DNA的提取及纯度与含量的测定.doc

专业： 姓名： 学号： 日期： 地点： 装 订 线实验报告课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：_同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 实验八 植物基因组DNA的提取及纯度与含量的测定 第一部分 植物基因组DNA的提取1、 实验目的和要求：1、学习并掌握植物基因组DNA的提取原理和方法；2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA结果的初步分析。2、 实验内容和原理：植物基因组DNA的提取方法就其提取原理主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB)法、十二烷基硫酸钠 (SDS)法。十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物基因组 DNA溶液。 由于植物中的次生代谢产物多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的CTAB-DNA提取法步骤多，较烦琐，DNA产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率。SDS法操作简单，温和,也可提取到较高分子量DNA，但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响DNA的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定: DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有： DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分 子量越大，迁移率越小。 DNA构型的影响：超螺旋DNA线状DNA开环DNA 胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度 为12； 电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm） （电场强度） 。而对于大片段电泳，甚至用0.51.0V/cm电泳过夜。进行 高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。 EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增 加。 电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们 各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。 TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用 TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护 DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。 碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大DNA提取过程中的注意事项：（1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。（2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。（3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。（4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。（5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。3、 实验材料与试剂：1、实验材料：八角金盘幼嫩叶子2、实验试剂（1）基因组DNA提取缓冲液（2）氯仿:异戊醇:乙醇抽提液（3）TE缓冲液（4）平衡酚：（5）RNA酶A（6）酚/氯仿（7）氯仿/异戊醇（8）异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。（9） 3mol/L NaAc（10） 5TBE缓冲液（11） 6电泳上样缓冲液（12） 1.0%琼脂糖凝胶（13） EB4、 实验器材与仪器：1、研体2、离心机、离心管（7ml）及离心管架；3、微量移液器10ul、1000ul及枪头；4、恒温水浴箱65 5、制冰机；6、冰箱； 7、恒温水浴箱 37；8、微波炉； 9、电泳仪及电泳槽；10、紫外检测仪。5、 操作方法和实验步骤：（1） 植物基因组DNA的提取称取八角金盘幼嫩叶子0.570克置于预热至65的研钵中，加适量石英砂；加入预热至65的核酸提取液3ml 迅速研磨成匀浆 加入3ml氯仿-异戊醇-乙醇溶液65水浴保温1小时，其间常轻柔摇动转移至7ml离心管中离心5,000g5min轻柔颠倒混匀后，室温静置分层5min弃沉淀，上清液转移到干净7ml离心管中，3ml加入3mlTE，65水浴中助溶15min，使之完全溶解4离心5,000g3 min收集絮状沉淀加入3ml异丙醇试剂，混和后静置20min沉淀DNA加入等体积的平衡酚，轻柔颠倒混匀，室静置10min转移上清于新7ml离心管中，2ml4离心12,000g10min吸取上清转移到一新7ml离心管中，2ml4离心（12,000g，5min）加入2ml酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，室温放置15min加入2ml的氯仿，颠倒混匀，室温放置5min吸取上清转移到一新7ml离心管中，2ml4离心（12,000g，10min）加入5l RNase（5g/l），37 保温20min加入200uL 3mol/L NaAC和4ml 20预冷的无水乙醇20放置20min4离心（5,000g，3min）收集沉淀用1mlTE溶解沉淀，即为植物基因组DNA溶液用70%乙醇洗涤沉淀，倾倒掉乙醇溶液，干燥，让酒精完全挥发凝胶电泳检测基因组DNA（分子量大小、纯度）紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量说明：如果蛋白质和RNA未去除干净，重复酚，酚/氯仿，氯仿抽提步骤，继续用RNase处理，乙醇沉淀和洗涤，重溶于TE中，直至基因组DNA纯度和质量符合要求。（二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA1、制胶（1琼脂糖凝胶） 在胶模上架好梳子。称取0.1g琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，加100ml 0.5TBE电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至5060后，加入EB，使其终浓度为0.5mg/L，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量0.5TBE（刚好淹过胶面），拔去梳子备用。2、加样 取9ul纯化的DNA原溶液样品，与1ul 6电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。3、电泳 加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需3060min）。4、观察和拍照 取出胶块置于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。6、 实验结果与分析： 7、 讨论、心得： 注意事项：1、EB为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作2、加样时注意不要划破或戳穿加样孔，别带入气泡3、平衡酚试剂和酚/氯仿试剂有分层，取用的时候要取下层 第二部分 基因组DNA纯度与含量的测定1、 实验目的和要求：1、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法；2、学习并掌握紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量的方法。2、 实验内容和原理： 核酸DNA和RNA所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的性质，它们在260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长进行核酸含量的测定。 波长为260nm时，DNA或RNA的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型而有差异。 1、 核酸样品DNA、RNA含量的测定： 本次试验使用溴化乙锭法进行估算。 由于 DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。2、 核酸样品纯度判断的一般标准： DNA纯度：OD260/OD2801.8，表示为纯的DNA； OD260/OD280 1.9，表示有RNA污染； OD260/OD280 1.6，表示有蛋白质、酚等污染。 RNA纯度：1.7 OD260/OD2802.0，表示为纯的RNA； OD260/OD280 1.7时，表示有蛋白质或酚污染； OD260/OD280 2.0时，表示可能有异硫氰酸残存。 OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。 3、 实验材料与试剂：1、实验材料 八角金盘基因组DNA样品2、实验试剂 ddH2O； TE缓冲液（pH 8.0）。4、 实验器材与仪器：1、离心机、离心管（5ml）及离心管架；2、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头；3、紫外分光光度计。5、 操作方法和实验步骤：直接取八角