异氟醚对血管性痴呆大鼠认知功能影响的实验研究.doc

异氟醚对血管性痴呆大鼠认知功能影响的实验研究上海交通大学附属瑞金医院麻醉科200025陶国荣 薛庆生 任瑜 于布为中文摘要目的 本实验旨在考察异氟醚对血管性痴呆（VD）大鼠认知功能的影响，同时从海马7 nAChR表达水平考察异氟醚作用的可能机制。方法 永久结扎SD大鼠双侧颈总动脉1个月构建VD模型,并设对照（Sham）组。将VD组（38只）及Sham组（19只）大鼠分成6组，分别吸入异氟醚或氧气。第1组：Sham氧气组，n=10，每日吸入纯氧1小时，连续吸5天；第2组: Sham异氟醚组, n=9，每日吸入2%异氟醚1小时，连续吸5天；第3组：VD氧气组，n=9，每日吸入纯氧1小时，连续吸5天；第4组单次吸入异氟醚组：VD异氟醚组，n=9，第5日吸入2%异氟醚1小时；第5组每日吸入异氟醚组: VD异氟醚组, n=10，每日吸入1.4%异氟醚1小时，连续吸5天；第6组每日吸入高浓度异氟醚组: VD异氟醚组, n=10，每日吸入2%异氟醚1小时，连续吸5天。处理结束后再利用MORRIS水迷宫观察吸入异氟醚对大鼠认知功能的影响；然后行常规病理检测观察吸入异氟醚对海马区病理形态的影响，并用免疫组化、Western blot和real-time PCR检测海马区7 nAChR的表达。结果 水迷宫实验发现异氟醚抑制Sham组和VD组大鼠空间认知功能；常规病理（HE染色、焦蓝紫染色和快兰染色）显示2、3、4、5、6组大鼠海马区受损，其中4、5、6组损伤较重，表现为海马区神经细胞明显肿胀、出现核固缩、胶质细胞增生；第4、5、6组大鼠海马区7nAChR的蛋白水平明显低于第1、2、3组；第4、5、6组大鼠海马区7 nAChR的mRNA水平显著高于第1、3组。在所有6组中，第5组大鼠的认知功能及病理形态损伤最重，其7nAChR的蛋白水平最低、mRNA水平最高。结论 异氟醚吸入可加重VD大鼠认知功能的降低，该作用可能与异氟醚抑制VD大鼠海马区7 nAChR的表达有关，这种作用可能与异氟醚的浓度及剂量有关，。关键词 术后认知功能障碍；血管性痴呆；异氟醚；MORRIS水迷宫；神经元烟碱受体；免疫组化；实时定量PCR；蛋白质印迹ABSTRACTObjective To investigate the effects of isoflurane on cognition of vascular dementia (VD) rats and the expression of 7nAChR in their hippocampus.Methods The VD model was established by the method of permanent occlusion of the bilateral common carotid arteries (2VO) and set the sham group as control. After one month, the VD and the sham rats were divided into 6 groups by different concentrations of isoflurane and oxygen inhalation. Group 1 (n=10): Sham+oxygen, inhaled pure oxygen 1 h per day for 5 days; Group 2 (n=9): Sham+isoflurane, inhaled 2% isoflurane 1 h per day for 5 days; Group 3 (n=9): VD+oxygen, inhaled pure oxygen 1 h per day for 5 days; Group 4 (n=9): VD+ isoflurane, inhaled 2% isoflurane for 1 h only for one day; Group 5 (n=10): VD+ isoflurane, inhaled 1.4% isoflurane 1 h per day for 5 days; Group 6 (n=10): VD+ isoflurane, inhaled 2% isoflurane 1 h per day for 5 days. The influenced of isoflurane on the cognitive function of VD and sham rats were also evaluated by the MORRIS water maze test and pathomorphological examination, the protein and mRNA levels of 7nAChR in the rats hippocampus were detected by the methods of immunocytochemistry, western blot, and real-time PCR, respectively. Results After one month of 2VO, the spatial cognitions of VD rats were markedly decreased as compared to the Sham rats, while the pathomorphological examination as HE staining, cresyl violet staining, and the fast blue staining showed that in the VD groups the impairments as the neuronal swollen and karyopyknosis, and the glia proliferation in the hippocampus were more severe than those of sham rats. Water maze test results showed that isoflurane inhibited spatial cognition of VD and sham rats; Neural damages in the hippocampus of group 2, 3, 4, 5, 6 were greater than those of group 1. The 7 nAChR protein expression of group 4, 5 and 6 was less than group 1, 2 and 3, while, the levels of 7 nAChR mRNA of group2, 4, 5 and 6 were greater than group 1 and 3. Among these six groups, the cognition and pathomorphological changes were worst, and 7 nAChR protein expressions were lowest, but its mRNA levels were highest in the hippocampus of rats in group 5. Conclusion The VD rat model in vivo can be established by permanent bilateral common carotid artery occlusion for one month. Isoflurane aggravates the decrease of spatial cognition of VD rats, and the inhibition of hippocampal 7 nAChR expressions may involved in the mechanisms of its effects. KEY WORDS Postoperative cognitive dysfunction; Vascular dementia; Isoflurane; MORRIS water maze; Neural nicotinic acetylcholine receptor；Immunohistochemistry；Real-time PCR；Western blo481 前 言术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction， POCD）是当今麻醉学面临的一项临床难题。目前还没有发现导致POCD的直接原因，对POCD的发生机制也知之甚少。研究表明：全身麻醉下行大手术的中年患者术后7天POCD的发生率为19.2%1，老年患者更易形成长期认知功能障碍，其中75岁以上患者中，14%的认知功能损伤长达三个月以上2。随着麻醉、手术方法的不断发展，麻醉、手术的适应证也在不断的扩大。术中可能引起患者脑缺血、缺氧的危险逐渐增多，大血管手术需要术中阻断主动脉或颈动脉，有些手术需要采取一些特殊麻醉技术，如体外循环、控制性降压、过度血液稀释等，上述情况都可能导致患者术中发生脑缺血、缺氧损伤。此外，随着社会老龄化程度的加剧，脑血管性痴呆(Vascular dementia，VD)的发病率同样不断的攀升，导致接受麻醉和手术的这类病人也相应增多。麻醉和手术因素是否可能会加重VD患者脑缺血、缺氧，从而恶化其认知功能，这些还是未知。异氟醚是目前临床上广泛使用的吸入全身麻醉药物。研究它对认知功能的影响具有重要的临床意义。已有部分实验发现异氟醚可以损伤啮齿类动物的学习记忆功能。异氟醚和氧化亚氮复合麻醉可降低老年大鼠的空间记忆功能，并对已形成和新建立的空间记忆都产生影响6，7，异氟醚还可促使神经细胞凋亡，影响大鼠智力发育8，9，抑制小鼠海马脑片长时程增强（long-termpotentiation，LTP）的形成和维持10。中枢神经系统神经元烟碱受体（neural nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）参与了学习和记忆的形成过程，在老年痴呆的发病机制中扮演着重要角色11，12，13。同时，中枢神经系统神经元烟碱受体也参与了异氟醚的全麻作用机制，以往的研究表明：异氟醚能够明显抑制神经元烟碱受体的功能3，14。异氟醚对神经元烟碱受体功能的影响是否与它们影响学习记忆功能有关，目前还只是猜测，并没有系统的实验研究15。基于上述基础和认识，本研究将利用双侧颈总动脉永久结扎1个月建立VD大鼠模型，然后给VD模型及其对照组大鼠吸入异氟醚，先用MORRIS水迷宫来观察异氟醚对大鼠的空间学习记忆功能的影响，然后进行大鼠海马区病理形态检测，再用Western-blot、免疫组化技术检测异氟醚对大鼠海马区7 nAChR蛋白表达的影响，同时利用real-time PCR技术检测异氟醚对大鼠海马区7 nAChR mRNA表达的影响。2 材料与方法2.1动物雄性SD（ Sprague-Dawley）大鼠，8-9周，250-280g，购于上海BK实验动物有限公司（生产许可证号SCXK 20030003，合格证号:No203）。大鼠为普通级饲养，自由进食饮水，12h白昼和黑夜交替，饲养温度252，湿度为555。2.2手术步骤腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg后，仰卧于手术台，腹腔注射青霉素钠8万单位，清洁颈部，碘伏、酒精消毒后铺手术巾，作颈部正中切口约2.5cm，分离、暴露双侧颈总动脉，VD组用3-0丝线分别行双侧颈总动脉行双道结扎，然后用0号丝线缝皮。Sham组除了不结扎颈总动脉，其它手术过程与VD组完全相同。术中给大鼠腹腔注射乳酸林格氏液5ml，并通过台灯和热板控制大鼠肛温在360C左右。术后2天继续腹腔注射青霉素钠8万单位/日。大鼠饲养1个月后再行下一步实验。2.3异氟醚处理手术后30天，开始给予VD组及Sham组大鼠吸入异氟醚或O2，共分6组，见表 2-1表2-1 大鼠分组和用药情况组别例数手术分组吸入气体处理时间(h)持续时期（d）110Sham纯氧1529Sham2%异氟醚1539VD纯氧1549VD2%异氟醚11510VD1.4%异氟醚15610VD2%异氟醚152.4 MORRIS 水迷宫试验实验全程7天， 1-2天行游泳训练， 3-6天行定位航行试验，第7天行空间探索试验。每次实验前，先将大鼠从动物房运至实验室，先让大鼠稳定1小时，而后开始实验。保持室内温度250C左右，水温22-250C。迷宫周围墙上挂一幅画作为指示。最初2天迷宫内不设平板，每只大鼠每天游泳2次，每次90秒钟，2次之间间隔30秒。作为适应性训练。3-6天行定位航行试验，在第象限加入平板，使平板位于水面下1.0cm。每天每只大鼠分别从四个象限交叉（即按照-或-的顺序）入水，入水时面朝池壁。每只大鼠游泳4次，每次最大游泳时间90秒，每次游泳结束后休息30秒。若90秒内没有找到平台，则人工引导其到平台休息。由视频软件（上海吉量软件科技有限公司）自动导出以下数据：游泳总路程、找寻平板潜伏期、平均游泳速度、第、象限的游泳路程和时间、站台周边游泳路程和时间。第7天去掉平板，行空间探索试验。每只大鼠游泳两次，每次游泳90秒，两次间隔30秒。由视频软件自动导出以下数据：游泳总路程、平均游泳速度、第、象限的路程和时间、站台周边游泳路程和时间、穿越站台次数。2.5 病理检测3戊巴比妥钠过量麻醉大鼠后，从升主动脉灌注4磷酸多聚甲醛溶液（4）300ml，随后开颅小心取出完整的鼠脑，在4磷酸多聚甲醛溶液内4下后固定2h，20磷酸蔗糖溶液脱水沉底。然后行冰冻切片，切片部位为背侧海马（前囟后3.3-4.3mm），切片厚度为40M。而后用贴片法行尼氏染色，漂片法行免疫组化检测7 nAChR。尼氏染色：切片上行脱水透明，再下行至水（酒精脱水：758095100，二甲苯透明：1/2酒精+甲苯二甲苯二甲苯，以上每步35min，随后下行至水），随后入1焦油紫染液室温下染色5min，自来水终止，95酸酒精（乙酸酒精）脱色，镜下分色，分色效果最佳时，上行脱水透明，封片。免疫组化：切片清洗、透膜后用山羊血清封闭1h（37）。然后用小鼠源性7 nAChR单克隆抗体1：50（货号：M220，Sigma 公司）孵育1h（37），同时设立阴性对照（单纯加入封闭液），1h后置于4过夜。24h后切片置于0.02MPBS中充分清洗，5min3次。然后用HRP标记的山羊抗小鼠抗体（货号：D3001）孵育2h（37）。0.02MPBS清洗，5min2次。DAB显色，显微镜下观察，染色最佳时，用清水水冲洗DAB终止反应。切片贴附于载玻片上，凉干后常规酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。最后利用奥林帕斯显微照相系统拍照、SVGA软件分析灰度值。2.6 Western-blot检测海马7nAChR的变化3戊巴比妥钠过量麻醉大鼠后，迅速断头，在冰浴中取100mg组织，加入750ul匀浆液，冰浴匀浆；离心：800G，20min；小心吸取上清液，分装于提前准备好的预冷0.5ml EP管内；用BCA法蛋白定量；上样20ug，电泳 100v,直到溴芬兰跑到了胶底附近终止电泳；冰浴中电转，100v，60min；TBST配置的5脱脂奶粉4摇床封闭过夜；一抗（货号：M220，Sigma 公司）4孵育过夜。其中7nAChR的一抗是小鼠源性单克隆抗体，稀释度为1：1500；洗脱 TBST洗脱3次，每次10min；二抗孵育，使用二抗（山羊抗小鼠抗体，1：2000）室温下孵育1h；洗脱 TBST洗脱3次，每次10min；ECL染色，显影、定影、曝光；利用GIS软件分析条带的灰度值。2.7 real-time PCR检测海马7nAChR mRNA的变化3戊巴比妥钠过量麻醉大鼠后，迅速断头，利用去RNA酶的器械在冰浴中取100mg组织，加1ml Trizol试剂，冰浴匀浆。匀浆液移入1.5ml EP管中，室温静置5min 加0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置3min；离心（4，12000g）15min；取0.5ml上清液移入另一1.5ml EP管中，加0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；离心（4，12000g）10min；弃上清液，加1ml 75乙醇洗涤；离心（4，7500g）5min；弃去上清液，保留沉淀通风干燥30min；干燥后加入40l DEPC水溶解RNA；总RNA浓度及纯度的鉴定：取1ul总RNA加99ul DEPC水，混匀，测量光吸收值，以260nm/280nm的比值表示其纯度，其数值在1.82.0之间；总RNA逆转录成cDNA，取1g，随机引物1l，DEPC水补足到4l，70水浴5min后，立即冰浴，再依次加入：5Buffer 5l、dNTP (10mmol/L) 1.25l、200U/l M-MLU 1l、DEPC水 13.75l；37水浴1h；95水浴5min后，立即冰浴；在-20保存；海马组织7nAChR mRNA的定量,以-Actin做内参，反应体系(5l)：SYBR GREEN 2.5l、ROXK 0.1l、高压水1.8l、引物上游（7 nAChR TAATACGACTCACTATAGGGAGGAAGAGGCCCGGAGAGGACAA、actin CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT，上海生工公司）0.05l、引物下游（7 nAChR CGCCACATACGACCCCAGAG、actin TCATCGTACTCCTGCTTGCT,上海生工公司）0.05l、cDNA 0.5l；反应程序如图2-1所示图2-1 real-time PCR 反应程序2.8 统计方法应用SPSS13.0软件分析处理。计量资料数据以均数标准差（s）表示，计数资料以百分率表示。计量资料采用t检验或连续观察资料的方差分析检验，计数资料采用卡方检验。P0.05为差异有统计学意义。3结果3.1 大鼠造模后体重变化VD组大鼠的死亡率（36.7%）显著高于Sham组大鼠（13.6%）（P0.05）。建模1个月后，VD组大鼠的体重显著低于Sham组大鼠（P0.05），如表3-1所示。表3-1：模型前后体重的变化组别造模前（克）造模后1个月（克）Sham（19只）2293639040VD （38只）2313235628和Sham组比较，P0.05, P0.05）；第3、4、5、6组之间比较，游泳总路程和潜伏期的大小顺序为：第3组第6组第4组第5组，但差异无统计学意义（P 0.05）。游泳速度在各组之间比较差异均无统计学意义（P 0.05）。第5天的空间探索试验，如图3-2所示：第1、2组在第象限（原平台所在象限）游泳路程和时间均大于第3、4、5、6组，第1组与第3、5、6组比较差异有统计学意义（P0.05），其余各组之间差异无统计学意义（P 0.05），其中第5组在第象限游泳路程和时间最短；第1、2组在、象限的游泳路程和时间均小于第3、4、5、6组， 其中第1组与第3、5、6组比较差异有统计学意义（P0.05或P0.01），第5组在、象限的游泳路程和时间最长。5天水迷宫结果小结。异氟醚有抑制Sham组和VD组大鼠空间认知功能的趋势，连续5天吸入1.4%异氟醚对VD组大鼠认知功能的抑制作用最大。图3-1各组水迷宫前四天定位航行试验结果，各组大鼠寻找平台潜伏期，总路程和游泳速度之间的比较。图3-2 水迷宫实验第五天空间探索试验结果。各组在四个象限内（Q1、Q2、Q3、Q4）的游泳时间和路程的比较，其中Q2为原平台所在象限3.3常规病理尼氏染色：各组大鼠海马CA1区尼氏染色结果如图3-3所示。和ShamO2组比较，各组大鼠焦油紫染色表现出明显的细胞损伤，其中VD异氟醚吸入1.4%5天的大鼠损伤的形态学改变最为严重。ABCDEF图3-3：各组大鼠海马CA1区域神经细胞尼氏染色（焦油紫法）图片。A：ShamO2，B：Sham异氟醚2.0吸入，C：VDO2，D：VD异氟醚2.0吸入1天，E：VD异氟醚1.4%吸入5天，F：VD异氟醚2.0%吸入5天。放大倍数： 物镜403.4免疫组化各组大鼠海马CA1区抗7 nAChR抗体的免疫组化结果，如图3-4所示。 利用图像分析软件包KS400 Ver.3.0计算各组阳性细胞灰度值的结果（每个大鼠选取海马形态相对应的6张切片，每片在高倍镜下选择10个阳性细胞，计算其灰度数值，再取其均值）（图3-5）：与第1组比较，各组灰度强度均明显降低，其中第5组灰度值最小。图34 ：各组大鼠海马CA1区神经元烟碱受体7亚型免疫细胞组化 A：Sham氧气，B：Sham异氟醚2.0%吸入，C：VD氧气，D：VD异氟醚2.0%吸入1天，E：VD异氟醚1.4%吸入5天，F：VD异氟醚2.0%吸入5天，G：阴性对照。图中箭头所指为阳性细胞，多数为神经细胞，同时分布在CA1细胞条带上以及海马辐射层区域。7亚型主要分布在神经细胞的胞体和细胞膜上。放大倍数： 物镜40图3-5 各组免疫组化7nAChR阳性细胞灰度值比较。与第1组比较，第2、3、4、5、6组的灰度值均明显降低（P0.05或P0.01），第5组最低。与第1组比较，P0.05, P0.013.5 real-time PCR结果各组海马7 nAChR的mRNA水平比较（如图3-6所示）：第4、5、6组显著高于第3组（P0.05或P0.01），第5组显著高于第1组（P0.05）。其余各组之间差异无统计学意义。# 图3-6 real-time PCR检测各组7 nAChR的mRNA水平。与第1组比较，P0.05, P0.01；与第3组比较，#P0.05,#P0.01，每组4个样本。5、Western blot结果各组海马7 nAChR蛋白水平比较（如图3-7所示）：第4、5、6组显著低于第1、2、3组。7 n AChR GADPH图3-7，western-blot 检测各组7 nAChR蛋白水平，每组各两个样品。4讨论本实验通过MORRIS水迷宫发现，连续吸入2.0%异氟醚会轻度降低Sham组大鼠的空间认知功能。异氟醚对VD组成年大鼠空间认知功能的影响与浓度和吸入时间有关，连续吸入1.4%异氟醚较连续吸入2.0%异氟醚对其认知功能的损害作用大，单次吸入2.0%异氟醚较连续吸入2.0%异氟醚对其认知功能的损害作用大。由此推测，异氟醚对VD大鼠神经系统的影响可能存在两重性，即损伤作用和保护作用。根据本次实验的结果，1.4%异氟醚对VD大鼠神经系统的影响以损伤作用为主，而2.0%异氟醚对VD大鼠神经系统的保护作用要强于其1.4%异氟醚，且随着2.0%异氟醚吸入时间的延长，其保护作用更加明显。Ehab等42在临床研究中也发现了类似的结果：他们发现在异氟醚麻醉过程中维持较低水平的BIS值（38.9）比较高水平BIS值（50.7）更有利于患者术后4-6周认知功能的恢复。吸入麻醉药对认知功能有损害作用已经被许多实验所证实。Culley43等给老龄（18月）大鼠吸入1.2%异氟醚+70% 氧化亚氮+30% 氧气的混合气体麻醉两小时，使其对麻醉前已经建立的空间操作能力的提高较对照组明显受损，而且这种损伤一直持续8周之久。Deborah44等进一步研究发现1.2%异氟醚+70% 氧化亚氮可以使大鼠对新事物学习能力产生长期的损伤。全身麻醉药物究竟是如何对认知功能产生作用，其确切机制仍然不清楚，目前多集中在全麻药对中枢胆碱能系统的影响、直接的神经损伤作用、影响记忆相关蛋白表达以及类似于AD的神经退行性改变。大量的文献报道nAChR对学习、记忆的形成起了重要作用46。异氟醚能抑制乙酰胆碱诱导的nnAChR某些亚型（7 、42）的兴奋，可能会导致认知功能障碍 47。本次实验我们也发现异氟醚对7 nAChR的表达产生显著的抑制作用，这将在后文中详细讨论。Wei等48研究发现2.4%的异氟醚能够对大鼠PC12细胞和原代培养的皮层神经元产生直接毒性作用，诱导其调亡，而且发现这种毒性作用可以被斯里兰卡肉桂碱受体拮抗剂-丹曲林（Dantrolene）所抑制，故认为异氟醚的毒性可能是通过破坏内质网钙内稳态而导致的。还有一些研究认为全麻药物干扰了学习记忆形成过程中重要蛋白的表达，Rampil等49用基因芯片技术研究异氟醚对大鼠杏仁核基因表达的影响，结果发现异氟醚通过影响真核翻译启动因子（Eukaryotic Initiation Factor，eIF）的表达间接干扰与学习记忆过程密切相关蛋白Vdac1和Dlgap1的合成，从而对认知功能产生影响。最近，Xie等50发现临床浓度的异氟醚能够增加培养胶质瘤细胞-淀粉样蛋白的表达，并诱导细胞的调亡。2.0%的异氟醚对VD大鼠认知功能的损伤作用较轻，这可能与适当高浓度的异氟醚对缺血、缺氧产生一定的保护作用有关。ATP敏感钾通道（KATP）、蛋白激酶C（protein kinase C PKC）以及一氧化氮（NO）系统可能参与了这种保护作用。KATP按存在部位分为细胞膜KATP(ceI1 KATP)和线粒体内膜KATP(mito KATP)两类。新近的研究表明,mito KATP可能是组织缺血缺氧的终末效应器，它可能通过减少线粒体内钙超载、维持线粒体内钙的动态平衡，从而减轻缺血再灌注损伤51。且这种保护作用具有剂量-效应关系，即在一定范围内，异氟醚对脑的缺血保护作用随着浓度的升高而增强52。本次实验中，连续吸入2.0%异氟醚的VD组大鼠的水迷宫成绩优于连续吸入1.4%异氟醚的VD组大鼠，可能是由KATP通道对高浓度异氟醚敏感性较高，对神经细胞的保护作用更强。整体和离体大鼠心脏模型上发现，异氟醚预处理的心肌保护效应是通过激活PKC，使得KATP通道持久敏化而实现的；使用PKC拮抗剂可阻断异氟醚预处理的心肌保护效应54，55，56。以往研究中发现，脑和心肌的缺血耐受机制有着相似之处，因此推测PKC在异氟醚诱导的脑缺血耐受形成中也发挥着重要作用。徐宁等57的实验证实了以上推测，并进一步说明脑和心肌的缺血耐受形成存在着某些共同机制。目前已肯定脑内NO系统参与缺血性损伤和保护作用，有双重作用。目前认为NO的作用有赖于NO生成量的大小：nmol水平的NO主要引起细胞毒作用，而pmol或fmol水平的NO主要发挥细胞信息传递作用。卢静等59研究发现2%异氟醚能够显著抑制SD大鼠边缘系统神经元表达NOS，使NOS阳性神经元减少。胡云等60的研究还发现异氟醚能够抑制SD大鼠脊髓内的NOS活性和NO产量，且发现其抑制程度与异氟醚的浓度相关。由此可见，高浓度异氟醚对中枢神经系统NOS的抑制作用较强，使NO的浓度处于pmol或fmol水平，发挥细胞信息传递作用。7nAChR是神经元烟碱受体使中枢神经系统的一个主要亚型，大量的研究证明7nAChR在学习、记忆过程中起着重要作用。在动物和人的研究均发现7 nAChR的选择性激动剂能够显著增强学习、记忆功能61,62。相反地，7 nAChR的选择性阻断剂甲基牛扁亭碱能够明显抑制学习、记忆功能63。本实验利用Western-blot和免疫组化方法检测Sham组和VD组大鼠海马区7 nAChR蛋白的表达发现：对Sham组大鼠，异氟醚有轻度抑制作用；对VD组大鼠，异氟醚的抑制作用较强。其中，连续5天吸入1.4%异氟醚的VD大鼠海马区7 nAChR蛋白水平最低，由此可见，海马区7 nAChR表达水平的高低与MORRIS水迷宫的结果有相关性。因此，我们推测异氟醚对大鼠认知功能的损害作用可能与异氟醚抑制7 nAChR蛋白的表达有关。本实验还利用real-time PCR技术检测了实验大鼠海马区7 nAChR的mRNA水平。结果发现异氟醚能够轻度增加Sham组大鼠海马7 nAChR的mRNA水平，显著增加VD组大鼠海马7 nAChR的mRNA水平。由此可以推测异氟醚导致7 nAChR蛋白水平下降是通过作用在转录后环节而实现的，mRNA的增加可能是机体的一种代偿作用。有研究发现异氟醚能够干扰真核起始因子（eukaryotic initiation factor eIF）的表达并影响其磷酸化过程，从而改变细胞内蛋白的翻译过程49，67。相似的结果也出现在AD患者，Lee64和Guan65利用Western Blot检测都发现AD患者海马区的7 nAChR显著降低。Hellstron-lindahl等66发现AD患者海马区的7 nAChR mRNA的表达明显升高。因此，异氟醚对VD大鼠认知功能的影响可能与AD病理过程存在一些相同的机制。本次实验采用的1.4%和2异氟醚分别是成年SD大鼠1.0MAC和1.4MAC68。1.0MAC相当于临床麻醉中的一般维持浓度，而1.4MAC则相当于临床上遇到较大刺激时所需要的吸入浓度，这在实际工作中十分常见，故实验中选择这两个浓度。而选择单次吸入和连续5天吸入的方式给药也是模拟临床中患者单次手术和多次手术的情况。除了上面讨论的结果以外，本次实验也还存在许多局限性，需要作进一步的研究。1)尽管双侧颈总动脉永久结扎能较好模拟VD，但与实际VD患者的病理过程仍存在一定的差异；2)根据本次实验结果，我们推测2异氟醚通过对慢性脑缺血的保护作用而表现出与1.4%异氟醚的损伤差异，而其中的机制还需要更深入的研究；3)本次实验只研究了异氟醚对海马区7 nAChR表达的影响，而其它区域(如皮层)及其它亚型（如42 nAChR）的影响还没有清楚；4)本实验只观察了两个浓度的异氟醚对VD大鼠的影响，还不足以很好了解其浓度-效应关系。总之，通过本次实验可以初步发现异氟醚对VD大鼠的空间认知功能有抑制作用，其分子机制可能异氟醚抑制海马7 nAChR表达有关。同时，异氟醚对VD大鼠有一定的缺血保护作用，且这种作用的大小可能与异氟醚的吸入浓度和时间有关。EFFECTS OF ISOFLURANE ON COGNITION OF VASCULAR DEMENTIA RATSTao Guorong, Xue Qingsheng, Ren Yu, Yu Buwei ABSTRACTObjective To investigate the effects of isoflurane on cognition of vascular dementia (VD) rats and the expression of 7nAChR in their hippocampus.Methods The VD model was established by the method of permanent occlusion of the bilateral common carotid arteries (2VO) and set the sham group as control. After one month, the VD and the sham rats were divided into 6 groups by different concentrations of isoflurane and oxygen inhalation. Group 1 (n=10): Sham+oxygen, inhaled pure oxygen 1 h per day for 5 days; Group 2 (n=9): Sham+isoflurane, inhaled 2% isoflurane 1 h per day for 5 days; Group 3 (n=9): VD+oxygen, inhaled pure oxygen 1 h per day for 5 days; Group 4 (n=9): VD+ isoflurane, inhaled 2% isoflurane for 1 h only for one day; Group 5 (n=10): VD+ isoflurane, inhaled 1.4% isoflurane 1 h per day for 5 days; Group 6 (n=10): VD+ isoflurane, inhaled 2% isoflurane 1 h per day for 5 days. The influenced of isoflurane on the cognitive function of VD and sham rats were also evaluated by the MORRIS water maze test and pathomorphological examination, the protein and mRNA levels of 7nAChR in the rats hippocampus were detected by the methods of immunocytochemistry, western blot, and real-time PCR, respectively. Results After one month of 2VO, the spatial cognitions of VD rats were markedly decreased as compared to the Sham rats, while the pathomorphological examination as HE staining, cresyl violet staining, and the fast blue staining showed that in the VD groups the impairments as the neuronal swollen and karyopyknosis, and the glia proliferation in the hippocampus were more severe than those of sham rats. Water maze test results showed that isoflurane inhibited spatial cognition of VD and sham rats; Neural damages in the hippocampus of group 2, 3, 4, 5, 6 were greater than those of group 1. The 7 nAChR protein expression of group 4, 5 and 6 was less than group 1, 2 and 3, while, the levels of 7 nAChR mRNA of group2, 4, 5 and 6 were greater than group 1 and 3. Among these six groups, the cognition and pathomorphological changes were worst, and 7 nAChR protein expressions were lowest, but its mRNA levels were highest in the hippocampus of rats in group 5. Conclusion The VD rat model in vivo can be established by permanent bilateral common carotid artery occlusion for one month. Isoflurane aggravates the decrease of spatial cognition of VD rats, and the inhibition of hippocampal 7 nAChR expressions may involved in the mechanisms of its effects. Key words Postoperative cognitive dysfunction; Vascular dementia; Isoflurane; MORRIS water maze; Neural nicotinic acetylcholine receptor；Immunohistochemistry；Real-time PCR；Western blot1 IntroductionPostoperative cognitive dysfunction(POCD）is a quiz of anesthesiology, and its mechanisms are still not clear. Prior studies demonstrated that the incidence of POCD in middle-aged patients during postanesthesia 7 days was 19.2%1 and aged patients were easily suffered from long-term POCD2.With the development of anesthesiology and surgery, indications of surgery are enlarged constantly. The risk of cerebral ischemia and anoxia is becoming higher than before. In addition, with the progression of social aging, the morbility of vascular dementia (VD) is rising, which cause the increased amounts of patients received anesthesia and surgery. But it is still not clear whether anesthesia and surgery can aggravate cerebral ischemia and anoxia for patients with VD. Since isoflurane is a kind of general anesthetic using commonly in clinic, there is important clinical signifcance to its effects on recognitions. Some investigators have found that isoflurane can impair learning and memory functions of rodents3,4.Neural nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) participates the progression of learning and memory, which plays key role in senile dementia5,6,7; nAChR also involved in mechanisms of isoflurane3,8. But it is just a conjecture whether the effects of isoflurane on nAChR is related to its action on cognitions9. In the present study, the VD model was established by the method of permanent occlusion of the bilateral common carotid arteries (2VO) and set the sham group as control. After one month, the VD and the sham rats inhaled isoflurane or oxygen. The influence of isoflurane on the cognitive function of VD and sham rats were also evaluated by the Morris water maze test and pathomorphological examination, the protein and mRNA levels of 7nAChR in the rats hippocampus were detected by the methods of immunocytochemistry, western blot, and real-time PCR, respectively.2 Methods2.1 Animals Male SD rats，approxim