（食品科学专业论文）大豆分离蛋白酶法水解制备多肽及应用的研究.pdf

。一，。，；，。，。墼塞。，。，。，。，。，。；。，一 摘要 一( 为了改善大豆蛋白的功能性质，使其在食品工业中有更广泛的应用以水解度为 指标谛选出合适的酶，研究用酶水解多肽，测定多肽的成分和有关特性，研究证实多 肽富含营养成分，可促进微生物生长发育。用仪器分析大豆多肤的分子量的分布，发 现肽分子呈现连续分布对水解产物进行脱苦、脱盐，研制出大豆多肽营养饮料的配 方。 以火豆分离蛋白原料作为底物，经加热处理后，分别与碱性蛋自酶，术瓜蛋白酶 中性蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶在各自适宜条什f 进行水解，经比较结果表明，人 豆分离蛋白在碱性蛋白酶作用下，有较高水解度，经三因素d 最优饱和设计及其结果 确定了水解大豆分离蛋白的晟佳条件即：温度6 0 ，p h 值为9 ，水解液浓度为2 。 对大豆分离蛋白和进行不同时间水解，测定水解产物的水解度和蛋白回收率，确 定水解时间的优化值是5 小时。 将3 小时，4 小时，5 小时，6 小时的水解产物部分替代微生物培养基m r s m 1 7 含鲑达8 0 以上，纽分中含有少量的游离氨基酸、水分、无机盐等成分，溶解度达9 0 以上，粘度随浓度增高时变化不人，并不阏d h 变化而急剧变化，此性质适h 于蜇向 饮料和高蛋白果冻加_ 1 ：中采用感官评定法测定苦昧阈值= o 4 0 ，稳定性好。 采刚超滤、s e p h a d e x g 2 5 层析等分析方法对水解产物的分子量分布进行了分析。 可知人豆多肽的分子量主要集中在1 0 0 0 0 以下。特别是分子量1 0 0 0 以下的最多具有 生理活性的肽多集中在这部分肽分子是连续分布的，水解反应是连续的，故此肽分 子呈现连续分布。 采h j 活性炭吸附法对水解的产物进行脱苦，晟佳反应条件为活性炭蛋白质 = o 1 0 2 ，l ( w v ) 、温度5 0 5 5 、p h 值为4 - 4 5 ，慢速搅拌2 小时。采用流床式离子 交换的方法加以改动，进行脱盐处理，脱盐率达到7 2 3 ，经脱盐处理后，盐分含量 在0 4 6 左右。 对人豆多肽营养饮料的配方进行了探讨，根据三因素三水平正交试验结果可知， 影响感官评定的主要因素依次为：酸的浓度 人豆多肽添加量 稳定剂：产晶最佳配方 为：蔗糖1 0 5 浓缩橙汁5 酸浓度为0 3 8 人豆多肽为1 o 稳定剂刚鼙为 0 4 。选择杀菌效果好的1 0 0 ，1 5 m i n 的杀菌条件。营养饮料在常温下放置6 个月 前没有山现腐败变质的现象，说明其在常温f 至少可保藏6 个月。 关键词：大豆分离蛋白水解蛋白酶多肽饮料 s t u d i e so nt h ep e p t i d e p r o d u c e db yh y d r o l y s i s o f i s o l a t e ds o y b e a n p r o t e i n a n di t sa p p l i c a t i o n si n b e v e r a g e a b s t r a c t t h ea p p r o p r i a t ee n z y m ew a gs e l e c t e dw i t ht h ep a r a m e t e ro f h y d r o l y s i sd e g r e ei no r d e r t oi m p r o v et h ef u n c t i o n a lq u a l i t yo fs o y b c a np r o t e i na n di t sa p p l i c a t i o n si nf o o d s i ts h o w e d t h a t h y d r o l y z e dp o l y p e p t i d ec o n t a i n s l o t so fn u t r i e n t sa n dc a na c c e l e r a t e g r o w t h o f m i c r o o r g a n i s m t h r o u g h t h ea n a l y s i so f s o y b c a n p o l y p e p t i d em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n ， i tw a si l l u s t r a t e dt h a tm o l e c u l a rd i s t r i b u t i o n si sc o n t i n u o u s n u 蛹t i o n a lb e v e r a g ec o n t a i n i n g s o y b c a l lp o l y p e p t i d ew a s s t u d i e d b yd e b i t t e r i n ga n dd e s a l t i n g i s o l a t es o y b e a n p r o t e i n ( i s p ) w a su s e d t h e s u b s t r a t et ob eh y d r o l y z e dw i t ha l c a l a s e p a p a y ap r o t e a s e n e u t r a s e ，p e p s i na n dt r y p s i nu n d e r t h es u i t a b l ec o n d i t i o n sa f t e rh e a t i n g ，i t s h o w e dt h a tt h e h y d r o l y s i sd e g r e eo fs o y b e a np r o t e i n w a s h i g i l w i t ha l c a l a s e t h e a p p r o p r i a t ec o n d i t i o ni nh y d r o l y z i n gs o y b c a np r o t e i nw e r e ：t e m p e r a t u r ew a s6 0 ( 2 ，p hw a s 9 c o n c e n t r a t i o no f s u b s t r a t ew a s 2 b y t h ed e s i g n i n g o f t h i r d - f a c t o r d - s u p e r i o r s a t u r a t i o n w h e ni s o l a t e ds o y b c a np r o t e i nw a sh y d r o l y z e di nd i f f e r e n tt i m e ，t h eb e s th y d r o l y s i s t i m ew a s5h o u r sb yw i t ht h e p a r a m e t e r so f h y d r o l y z e dd e g r e ea n d r e c l a i m a t i o nr a t i o h y d r o l y s a t e sf r o md i f f e r e n tt i m e ：3h o u r s ，4h o u r s ，5h o u r s ，6h o u r sw e r eu s e da st h e n i t r o g e ns o u r c eo fm r s ，m 1 7m e d i u m ，i tw a sf o u n dt h a tt h eh y d r o l y s a t e sw e r en u t r t i o u s a n db e n e f i c i a lt om i c r o o r g a n i s mg r o w t h c o m p o n e n t sa n dc h a r a c t e r i s t i c sw e r es t u d i e da f t e rt h ea b o v eh y d r o l y s a t e sw e r ed r i e d a n di tw a ss h o w e dt h a tt h ep e r c e n t a g eo fp r o t e i nw a s8 0 ，w i t ha m i n oa c i d s ，m o i s t u r e ， i n o r g a n i cs a l ta n do t h e r s t h es o l u b i l i t yw a s9 0 a n dv i s c o s i t yw a ss t a b l e w h i c hw a s s u i t a b l ei ne g gw h i t ed r i n k i n ga n d h i g l lp r o t e i nj e l l y s t a b i l i z a t i o nw a sg o o da n db i t t e r n e s s c o p ew a s0 4 0 m o l e c u l a rw e i g h td i s m b u t i o no f h y d r o l y s a t e sw a s a n a l y z e dt h r o u g hu l t r a - f i l t r a t i o na n d s e p h a d e xg - 2 5l a y e r , i tw a ss h o w e d t h a tt h em a i nm o l e c u l a r w e i g h td i s t r i b u t i o no f s o y b e a n p o l y p e p t i d ew a sb e l o w1 0 0 0 i ts h o w e d t h a tt h ep e p t i d ed i s t r i b u t i o na n dh y d r o l y z a t i o n r e a c t i o nw e r ec o n t i n u o u s t h e a p p r o p r i a t er e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ea c t i v ec a r b o n p r o t e i n 2 o 1 0 2 l ( w v ) t e m p e r a t u r e = 5 0 - 5 5 ( 2 ，p h = 4 - 4 5b y m i x i n gs l o w l y h y d r o l y s a t e sw i t h a c t i v e c a r b o nf o r2 h o u r sf o rd e b i t t e r i n g i f t h ea b o v em e t h o dw a s s u b s t i t u t e dw i t h 山em o b i l eb e d t h er a t i oo f d e s a l t i n gw a s1 2 3 a n dt h es a l tc o n c e n t r a t i o no f 山e h y d r o l y s a t e sw a sa b o u t 0 4 6 n u t r i t i o u sb e v e r a g e c o n t a i n i n gs o y b c a np e p t i d ew a sp r o d u c e dt b z o u g ht h r e ef a c t o r s l i a n dt h r e el e v e l se x p e r i m e n td e s i g n i ts h o w e dt h a tt h em a i nf a c t o rt h a ti n f l u e n c et h es e n s e o r g a n sa s s e s s i n gw a si nt u r na s ：a c i dc o n c e n t r a t i o n p o l y p e p t i d e so f s o y b e a n c o n c e n t r a t i o n s t a b i l i z e r t h eb e s tf o r m u l ao f p r o d u c tw a s ：s u c r o s e1 0 5 。c o n c e n t r a t e d o r a n g e5 ，a c i d0 3 8 ，s o y b e a np o l y p e p t i d e1 o 。s t a b i l i z e r0 4 t 1 1 eo p t i m u m s t e r i l i z a t i o nt i m ew a s1 5 r a i na t1 0 0 t h en u t r i t i o u sb e v e r a g ec a r lb es t o r e df o r6 m o n t h s w i t hn o m t t i n gp h e n o m e n o n l i uw e n h u i ，1 1 1 ef o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o e z h a n g l a n w e i k e y w o r d s ：i s o l a t e d s o y b e a np r o t e i n ，h y d r o l y s i s ，p r o t e a s e ，p o l y p e p t i d e ，p e p t i d eb e v e r a g e i 弓l 言 1 引言 大豆蛋白是一种优质植物蛋白，具有较高的营养价值，但由于其溶解度低、粘度随 着浓度的增高而急剧升高、有一定的抗原性、消化率和生物效价远不及牛奶、鸡蛋等动 物性蛋白，限制了在人豆蛋白食品加：中的应刚( 邓勇等，1 9 9 9 ) 。研究表明通过水解 可以改善大豆蛋白的功能性质，从而使其在食品工业中显示出更广泛的用途和更广阔的 开发前景。目前，关于蛋白质的水解研究已日趋成熟。另外，大豆蛋白水解物中一些多 肽具有的大豆蛋白无可比拟的生理活性及营养功能，也促使人们开始以来源丰富、质优 价廉的大豆蛋白为原料研究开发大豆多肽( 刘大川等，1 9 9 7 ：邓勇等，1 9 9 9 ) 全方位 提高大豆蛋白的营养与商品价值。 1 1 大豆蛋白的营养价值 大豆蛋白是国际上公认的较理想的植物蛋白质，其氨基酸组成与动物蛋白相近( 见 表1 1 ) 。特别是与其他植物蛋白质相比较，大豆中赖氨酸含量较高，是其它植物蛋白 不可比的( 石彦国，2 0 0 0 ) 。 表1 - 1 大豆与动物蛋白质中氮基酸比较 ( 单位：g l o o g ) tab1e 1 - 1t h e a m i n o a c i dc o m p a r eo f s o y b e a n a n da n i m a l p r o t e i n ( u n i t ：g l o o g ) 精氮酸7 36 83 56 6 组氨酸2 42 42 42 , 4 赖氮酸6 39 48 56 3 蛋氨酸1 42 82 63 1 异亮氨酸5 35 55 7 6 8 亮氨酸7 78 7l o 9 o 半胱氨酸1 61 30 92 3 苏氨酸3 94 84 6 5 0 苯丙氨酸4 94 5 5 35 9 缬氨酸5 26 3 7 17 4 色氮酸1 4 1 61 7 大豆蛋白质的必需氨基酸模式接近f a o w h o 建议模式，与动物蛋白的氨基酸模 式接近，是一种较为完善的人类植物膳食蛋白质。有研究表明( m a om 1 9 9 6 ) 。大 豆蛋白可以降低对人体不利的低密度脂类( l d l ) 胆固醇的数量，从而对防治心血管疾 病有益可以克服其它动物蛋白质对人的不良影响。 1 2 大豆多肽的特性 人们通过研究发现。在组成蛋白质的氨基酸构成的物质中，有一类不同于蛋白质的 中间物质这种物质具有特殊的功能。人们称之为肽( p c p t i d e ) ，又称多肽它是由二 个到几百个不同的氮基酸组成的浓缩物。由两个氦基酸组成的肽称为二肽多个氨基酸 分子以肽键相连接则称为多肽( 刘玉德等，2 0 0 2 ) 。这些多肽多以非活性状态存在于蛋 白质长链中当被酶解成适当的长度时，它们的活性就会表现出来。近年来，多肽渐渐 被人们所认识，随着分子生物学、生物化学技术的飞速发展，人们发现存在于生物体内 的多肽已有数万种，它们时刻发挥着不同的生理功效。 大豆多肽是指大豆蛋白经酶解或微生物技术处理而得到的水解产物，它是由大豆蛋 白水解后的多种肽分子混合组成。其中包括少量游离氨基酸、无机盐等成分( 石彦国， 2 0 0 0 ) 。 大豆多肽主要有以下特性： 1 2 1 营养特性 大豆多肽的氨基酸结构几乎完全与大豆蛋白一样必需氨基酸平衡良好含量丰富。 在早期的研究和观念中认为蛋白质由胃和小肠内的多种分解酶作用完全水解成氨基酸 的形态而被吸收。但是近期的研究发现并非如此，反而小肽要远比相同浓度下某些有利 的氨基酸更容易被肠道吸收( s i e m e n s m ae ta 1 ，1 9 9 3 ) 。自8 0 年代以来由于直接经验 和间接经验的不断积累。肽被完全吸收的观点逐渐被人们重视，其相关研究也空前活跃 井取得了许多结论性研究成果( 陈历俊等1 9 9 9 ) ：与氦基酸运输体系相比肽具有吸 收快，能耗低，不易饱和，且各种肽之间转运无竞争性与抑制性因此肽具有效率高、 迅速、氮基酸组成趋于平衡等优点：动物活体实验也已证明，由肠道直接吸收肽类途径 比氨基酸途径具有更大的输送量( 见表1 2 ) 。 表1 2 蛋白质饲喂正常老鼠1 h 后的吸收率 t a b l e1 - 2t h e a b s o r p t i v i t yo f p r o t e i nf e e d i n gm o u s e i ng e a ra f t e ro n eh o u r 1 2 2 加工特性 大豆蛋白质经过蛋白酶处理后溶解性、乳化力、起泡力等功能特性有所改善，粘 引言 自目! 目日! l 自! 目s 目! ! e ! 自目g ! 自目! # e e = ! ! = ! 目_ # e e e ! e e = e 口e 目目_ 目 度f 降( 盛国华，1 9 9 3 ：张延坤等，1 9 9 7 ) 。由于大豆多肽分子相对质量小t n s i ( 氮 溶解指数) 超过9 5 水溶性很高，即使在质簟分数u ( 多肽) = 5 0 的情况。f 仍然保 持流动性。因此，它作为食品原料，具有低粘度、速溶和无残渣等特点；大豆多肽加热 不凝固，在p h = 4 5 ( 大豆蛋白等电点) 的情况下不产生沉淀粘度随质量分数升高变 化不火，所以可用作蛋自饮料和高蛋白果冻。大豆多肽具有抑制蛋白质形成凝胶、较强 的吸湿性和保湿性、调整蛋白质食品的硬度、改善口感等特性具有广泛的t 【 途。 1 2 3 促进微生物发酵特性 大豆多肽有促进微生物生长发育和活跃代谢作用( 邓勇等，1 9 9 9 ) 。大豆多肽能增 强双歧杆菌的发酵作用井能促进乳酸菌、霉菌、酵母增殖，增强酵母的产气作川( 盛 国华，1 9 9 3 ) 。 1 2 4 感官特性 大豆蛋白具有豆腥味经过酶解后除去与蛋白质结合的风味物质和脂类化合物，使 豆腥味减轻。另一方面，大豆蛋白的平均疏水性较大，酶解后产生含8 一1 2 个疏水性氮 基酸残基的苦味肽，使酶解产物苦味增强影响产品的风味( 赵新淮，1 9 9 6 ) 。 1 2 5 生理活性 人或动物对含氮物质的吸收存在着游离氨基酸和小肽吸收两种相互独立的转运机 制，氨基酸的吸收。存在着中性、碱性、酸性和亚氮基酸四种转运体系。逆浓度梯度转 运。通过不同的钠离子泵或非钠离子泵转运体系进行( m a r y k 1 9 9 4 ) 。 较大分子肽的吸收属细胞间微孔吸收的所谓高吸收的一种。一般是上皮细胞层中细 胞脱落留下的空缺部位或细胞内吞作用造成的，也可以通过溶剂的牵引或别的溶质的存 在的刺激( 如葡萄糖) ，造成了对肽的非选择性吸收。这一点对于肽的生理活性在宿主 中的表达具有非常重要的作用，肽结构方面的信息可能传递给宿主表现处于游离氮基 酸完全不同的生理作用即生物活性( m a r y k ，1 9 9 4 ；v e n f r o k j a e r ，1 9 9 4 ) 。 由以上论述可知：肽制品除具有肽的一般特性外，也会具有与原料和水解方式相关 的特殊性。大豆多肽的生理活性主要有： 1 2 5 1 易吸收性 由以上肽的吸收机制可知，肽较氨基酸更易、更快被机体吸收利用，因而人们有可 能利用低肽来为那些由通常饮食不能充分满足蛋白质需要的特殊人群服务，以达到维护 和改善该人群蛋白质营养的目的，这些特殊人群包括：( 1 ) 酷暑、过度精神肉体疲劳情 况下，肠胃功能降低者；( 2 ) 手术后特别是消化道手术后尚处于恢复期的患者；( 3 ) 消化器官未发育成熟的婴幼儿或消化吸收功能开始衰退的老年人或患者；( 4 ) 高度的运 东北农业大学工学硕士学位论文 动负荷，需要摄入较多的蛋白质，而胃肠叉不堪负重者( 吴建乎一1 9 9 8 ) 1 2 5 2 降血压 大豆多肽混合物中可分离出a l a a 哼一p r o a l a l y s ，k u p r o h u a 曙- p h e a 1 a v a i p r o 1 i y r p m g 1 n a 唱，t y 广_ g 1 r l e u p r o p r o a 曙一p r o l y s l i e - - p r o - - p r o ，l e u l y s 1 h 几种短肽。这些肽可将血管紧张素i ( a n gi ) 转化成 血管紧张素i i ( a n g i i ) 同时可降解激肽，使之必活，这样就抑制了血管紧张索转换酶 a c e 的活性从而抑制了血管平滑肌的收缩，抵抗高血压的产生。这些降压肽实用安 全性高，而且共同的突出优点是对高血压患者起到降压作用，对血压正常的人无降压作 用。所以它对心血管疾病有显著疗效，具有预防动脉硬化、延缓人体衰老等功效 ( m a r u y a m a s s ，1 9 8 2 ；石岗等，2 0 0 2 ) 。 1 2 5 3 降血脂与降低胆固醇 早在本世纪初，人们就发现大豆蛋白质具有降低血脂和胆围醇的作用。有人认为不 同源蛋白导致了体内胆固醇代谢差异，即大豆蛋白导致了胆固醇排出的增多，且降低了 胆固醇和脂肪的吸收，使体内胆固醇沉积降低。而大豆多肽本身不仅具有这样的功能。 而且效果更佳。大豆蛋白消化物的疏水性与胆汁酸的结合呈正相关，大豆多肽能刺激甲 状腺激素的分泌增加，促进胆同醇的胆汁酸化，从而使粪便排泄胆间酵量增加( 彳渊等 2 0 0 2 ) 。有入通过实验发现人豆多肽分子馘在人于5 0 0 0 的部分有这种作用( 陈历俊， 1 9 9 9 ) ，并且具有以下优点：( 1 ) 对于胆围醇值高的人具有降低总胆i 司醇的功效而对胆 固醇值正常的人没有降低胆固醇作用。( 2 ) 胆固醇值正常的人在食用高胆固醇含量食品 时，也有防止血清胆固醇值升高的作用。( 3 ) 使胆固醇中有害的低密度脂类l d l 、超 低密度脂类v l d l 值降低，但不会使有益的高密度脂类h d l 值降低。 1 2 5 4 抗血栓形成 血栓形成是由于纤维蛋白原参与的结果，纤维蛋白原既参与血小板的凝闻义参与 纤维蛋白的形成血纤维蛋白原r 链c 末端h i f h i s l e u g l y g l y a l a l y s g l n a 】a a s p v a l 片段与 删i r a s p s e “p h e 片段，这两种肽都能抑制血小板 的凝集和纤维蛋白原结合到a d p 活化的血小板上。大豆蚩白水解物中含9 肽m e t a i a i l e p r o p r o l y 一a s n a s p l y $ 能有效地抑制a d p 诱导的血小扳凝集。人豆多 肽经小肠吸收进入血液能对血小板的凝集、对纤维蛋白原与活化的血小扳结合起到抑 制作用，从而对人体起到健康保护作h 】( a m f l a t ，1 9 9 3 ：m a z o y e r e 1 9 9 0 ：石岗等， 2 0 0 2 ) 。 1 2 5 5 促进钙磷及微量元素的吸收 人体吸收钙磷等金属离子时必须在小肠粘膜上处于溶解状态才能有效地被人体吸 收人体内存在p h 梯度t 特别是处于吸收段的小肠环境p h 为碱性使得钙易与磷酸 形成不溶性盐，从而大大降低了钙的吸收，在这种状态f 通常人体只能吸收3 0 - - 5 0 * 0 4 从而导致小儿、老年、孕妇等敏感人群普遍缺钙，目前由此引发的少年缺钙、老年骨质 疏松已成为社会关注的焦点问题( 赵晓丹，2 0 0 2 ) 。大豆多肽可以与金属离子形成整合 物保证其可溶状态。有效地防止了不溶性磷酸钙形成，大大促进了人体对钙磷物质及 微量元素的吸收。 1 2 5 6 调节免疫功能 晟早证实肽的免疫刺激作用是从人乳蛋白中获得的肽类，免疫刺激肽就是从人乳的 酶解产物中分离得到的一类具有刺激吞噬细胞功能的肽。人豆蛋白经酶解或微生物水解 法可以得到l e u l e u - t y r 和t y r - t y r m e t p r o l e u - t y r ，只要极低计量( 0 1 i tm ) 就可以 通过鼠腹膜巨噬细胞激活具有吞噬作用的绵羊红细胞，可以增强人体免疫功能的效果 ( 王世英，2 0 0 1 ) 。 1 2 5 7 抗氧化作用 有学者用微生物蛋白酶水解大豆球蛋白得到分子量在7 0 0 - - 1 4 0 0 的肽( h u a m i n g c h e n 。1 9 9 5 ) 试验证明具有抑制亚油酸自动氧化的作用，体外模型实验证明这些肽具 有清除自由基的作用，可用于食品抗氧化剂和抗衰老食品( 张学忠等1 9 9 9 ) 。 1 25 8 低敏性 蛋白质在体内可能会引起过敏反应，而引起过敏反应的过敏原在通常的消化过程中 是稳定的通过体外蛋白酶水解可以消除过敏原。通常分子量小于3 0 0 0 的肽可以不具 有过敏性( c h r i s t o p h e r t c o r d i e ，1 9 9 4 ) 。 1 2 5 9 其它活性功能 经研究表明，大豆多肽还具有镇静安神、刺激胰岛索的分泌，对糖尿病患者有治疗 和康复作用。另外还有一些多肽能够抗毒、解毒、保护表皮细胞、防止黑色素沉淀、促 进大脑和神经发育、促进松果素的生成、降低一些变态反应等( y a m a s h i t am ，1 9 6 9 ) 。 1 3 大豆多肽的应用 大豆多肽因具有多种功能特性和生理活性有广阔的利用范围( 葛文光1 9 9 6 ) 如表卜3 所示。 表1 3 大豆多肽的功能应用 t a b l e1 - 3t h ef u n c t i o no f s o y b e a p o l y p e p t i d e 促进体内脂肪代谢 促进发酵作用 促使食品凝胶软化 降低胆固醇作用、非过敏性抑制 有利于减轻运动员体重的食品，特殊食品 发酵食品、酶制剂和药品生产 火腿、香肠、水产糜制品和高蛋白食品软化 降低胆固醇食品、非过敏性食品 1 3 1 在食品工业中的应用 与传统大豆蛋白相比较，大豆多肽具有易消化吸收能迅速给肌体提供能量，无蛋 白变性，无豆腥昧，无残渣、分子量小、易溶于水，在酸性条件下不产生沉淀溶液粘 度低受热不凝固等特性，可以广泛应用到食品加 ：业。 1 3 i 1 在保健食品中的应用 大豆多肽易消化吸收，具有消化速度快的特性，可用于特殊病人的营养剂，特别是 消化系统中肠道营养剂和流态食品，适用于康复期病人，消化功能衰退的老年人以及消 化功能尚未成熟的婴幼儿服用。大豆多肽的使用可以结合其它辅料，强化必需氨基酸、 强化钙、铁、锌等微量元素，制作出各种保健食品。 1 3 1 2 在发酵食品中的应用 大豆多肽对微生物有增殖效果井促进有益菌代谢的分泌，促进微生物的生长、发 育和代谢，被广泛应用于发酵工业。在谷氨酸发酵中，大豆多肽替代等量的氮源，镜检 菌种生长旺盛，发酵周期缩短4 “小时，产酸率也得到了相应的提高，从而提高了生 产率。在酸奶生产发酵剂的制备中加入1 的大豆多肽不仅提高了产品的营养价值， 而且在稳定产品质量方面也起到积极的作刚。把人豆多肽h j 于生产酸奶、干酪、醋、酱 油和发酵火腿等发酵食品中，可以提高生产效率、品质稳定性和产品风味并提高营养性 ( 李书国，1 9 9 9 ) 。 1 3 1 3 在普通食品中的应用 大豆多肽具有良好的吸湿性和保湿效果。可应用丁= 各种豆制品、焙烤制品、糖果、 蚩糕以及冷饮制品等。加入大豆多肽的豆制品不仅品质、风味俱佳，而且营养丰富、易 消化吸收。对鱼肉制品可突出肉类风味提高香鲜度，使其质地柔软、口感、风味均有 较大改善- 总而言之，由于大豆多肽的涉入，食品加工业必将被推进更高的发展阶段。 1 3 2 在医药行业中的应用 大豆多肽含有降压肽( m a r u y a m a s s ，1 9 8 2 ) 、降胆固醇肽、抗血栓肽等肽段。所以 可以用于医药行业中，生产出相应功效的药品。不过，如果应用于医药行业，尽管经酶 解法或微生物分解法所得到的大豆多肽。必须经过分离提纯方能在较小剂量的情况下 6 。，。，。，。，。銎耋二。，。；。，。，。，。一 达到理想功效，从而提高了加工成本。但作为药品的附加值也将大幅度提高。 1 3 3 在化妆品行业中的应用 大豆多肽含有一种类似于胰岛素的白蛋白多肽，是胰岛素的生k 因子，具有保护人 体表皮细胞，消除体内自由基防止黑色素沉淀、抗衰老等功效。人们称之为促青春因 子可以广泛地应用到化妆品中。经常使用含大豆肽的营养霜和面膜，可以快速恢复皮 肤的光泽与弹性，减少皱纹，对延缓衰老起着积极的作用。 1 3 4 在饲料行业中的应用 大豆多肽包含一些寡肽，这些寡肽在动物嗣肠道中不水解，不受抗营养囡千( 如： 植酸) 的干扰而直接被吸收，且比单个氮基酸的吸收速度快。这些寡肽能刺激瘤胃内纤 维分解菌的生长及在动物体内发挥激素功能，故以寡肽作为饲料添加剂正引起人们的兴 趣。随着肽研究的不断进展大豆多肽必将替代饲料中的抗生素药物，为绿色饲料的问 世提供了竖实的理论和物质基础。 1 4 蛋白质水解的研究 1 4 1 蛋白质的水解方式 蛋白质的水解方式较多，主要有化学降解法和生化降解法印酶法降解( c h e i l d c 1 9 7 1 ) 。化学方法是利用酸或碱水解蛋白质虽然方法简单、成本低廉，可是反应条 ，l = 剧烈，生成过程中氨基酸受损严重，破坏了氮基酸的构形，使l - 氨基酸变成d 一氨基酸 井能形成象赖氮酸丙氨酸等有毒副作用的物质，而且很难按规定的水解程度控制水解， 故现在很少采用：而酶解能在温和的条件下进行，并且可以在特定的条件下进行定位水 解分裂产生特定的肽水解的程度易于控制，因而能很好的满足生产活性肽的需要。 反应产物与相同组成的氨基酸具有特殊的理化性能羊生理功能，己成为蛋白质水解制品 的主要发展方向( i , z a w an e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 蛋白水解物的性质及功能特性与底物蛋白质、酶的种类、酶反应的温度、p h 值、 酶与底物的浓度比等条件有密切关系，此外，还与反应体系的离子强度、产物类型和其 它组分等构成因子有关( e v a n s e w ，1 9 7 9 ；p a r k sl l & c a r p e n t e r ，j a 1 9 8 7 ) 。 在生产蛋白水解物中酶的选择是关键。可供选择的蛋白水解酶种类众多酶的专一 性和作用机制对于活性肽的生产至关重要，对于肽而言其特定的氮基酸序列，往往对 其活性起决定作用尤其是肽链的末端氨基酸，其性质直接影响肽与作用底物的结合 从而影响肽生物活性的发挥如研究开发现在的a c e i 肽中，c 的末端是p r o 、p h e 、t y r 或序列中含疏水氨基酸是维持高活性所必需的，因此，筛选具有特定水解专一性的酶很 关键( 崔继科，1 9 9 8 ) 。蛋白质水解酶根据来源可分为来自植物组织的蛋白酶( 如术瓜 蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等) 、来自动物组织的蛋白酶( 如：胃蛋白酶、胰 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等) 和来自微生物的蛋白酶。来自动、植物的蛋白酶安全性较 高但是其产量低，价格高，催化活性普遍较低：微生物蛋白酶与动物蛋白酶和植物蛋 白酶相比溶解性好，活力高对蛋白质作用强烈，非常适合予对蛋白质进行较深度的水 解。 目前，两种较为常见的微生物蛋白酶是：地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 深 层发酵产生的碱性蛋白酶，在碱性条件下具有较高的催化活性，枯草杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 深层发酵产生的中性蛋白酶，在中性条件下具有较高的催化活性。微生物蛋白 酶已经工业化生产，如丹麦诺和诺德( n o v o n o r d i s k ) 公司生产的碱性蛋白酶( a l c a l a s e ) 和中性蛋白酶( n e u t x a s e ) ，中国无锡星达生物工程有限公司( 原无锡酶制剂厂) 的酸 性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶等。 1 4 2 蛋白水解物功能性的变化 蛋白质的功能特性是指除了蛋白质的营养性外能影响其在食品利用中的全部性质： 蛋白水解物的功能性质是指它在晟终产品中的加：t = 、储存稳定性、感官质量、营养或生 物效价的所有物理、化学性质( m a h m o u d 1 9 9 4 ：郭本恒，1 9 9 6 ) 。通过控制蛋白质的 水解程度可以改变和提高蛋自质的功能特性( q u a g l i a ，1 9 8 7 ：m a h m o u d ，1 9 9 4 ) ，如溶 解性、枯性、乳化性、泡沫性、胶凝性和风味特性等。蛋白水解物的功能特性已成为蛋 白质除作为营养食品外的主要应用目的。 蛋白水解物的功能特性与未水解的蛋白质特性不同，在很大程度上取决于分子大小 或水解度，也受蛋白水解所用的酶、水解底物蛋t q 质的理化性质和水解条件的影响( 冯 志彪，1 9 9 4 ) 。 蛋白质水解。随着肽键的断裂发生了系列变化其中三个主要变化影响了功能特性： ( 1 ) 随着肽键的断裂可离解的基团数目增多，导致离子化基团增加，亲水性和净 电荷数也同时增加：( 2 ) 随着分子体积的下降，抗原性大幅度降低，多肽链的分子数 减少；( 3 ) 分子结构改变导致埋藏的疏水中心暴露到溶液环境中。这些变化致使水解 物功能性改变较大如水解物的溶解性即使在蛋白质等电点处，也有火幅度的提高 ( q u a g l i a t1 9 8 7 ：j o s t ，1 9 9 7 ) ，起泡性明显增加，粘度降低( 冯志彪，1 9 9 4 ) ，流变性 质改善乳化能力下降等( 牟光庆，1 9 9 9 ) 。 1 4 3 蛋白水解物的苦昧 对食用蛋白质酶法水解的研究可以以本世纪六十年代为分界线，在此之前，只有少 数几篇关于食用蛋白酶法水解的报道，直到六十年代末期有关研究逐渐增多。七十年代 出现了大量有关食用蛋白水解研究的报道。迄今为止，蛋白质酶法水解物在医药、宇航 食品、饮料以及整个食品工业等许多方面获得应用，这在很大程度上得归功于蛋白质水 b 引言 ! 皇_ l 墨_ 。! 曼墨! 鲁e 皇! 墨j 篁皇 ! ! ! 墨自皇墨舄鲁皇暑罩兰! 葛喜置墨喜篁曼墨毒鲁墨墨鲁芒! 目詈 解苦味问题的解决( 许永红，1 9 9 7 ) 。蛋白水解物的苦味是因为疏水性多肽的存在苦 味是由于疏水性氨基酸和味觉细胞发生反应的结果在完整的球蛋白中，大部分疏水性 侧链被包埋在蛋白质的内部，它们不和味觉细胞接触，因而不会产生苦味。然而，当蛋 白质被水解以后。疏水性氨基酸含量丰富的多肽被释放到溶液中，于是它们便和味觉细 胞反应产生苦味( t a n f o r d c 。1 9 7 2 ) 。 很多研究表明苦肽的苦味不仅与其琉水度有关而且与氨基酸排序顺序和多肽空间 结构有关。i s h i b a s h i 等人( i s h i b a s h in e ta l ，1 9 8 7 ) ，研究了含有l e u 、p h e 、t y r 等疏 水性氨基酸残基的多肽的苦味与此类氨基酸嗾序的相互关系，指出此类氮基酸存在于多 肽的c 末端时，苦肽的苦味更强，同时推测此情况适合于绝大部分疏水性氨基酸残基。 此后i s h i b a s h i 等( i s h i b a s h i ne ta 1 ，1 9 8 8 ) 义详细地研究了许多含有许多中性氨基 酸残基的多肽的苦味，指出苦肽的氨基酸残基的侧链结构应该至少由三个碳组成否则 此多肽不会呈苦味。后来研究又证明：苦肽显出摄强的茜味必需特定的分子构象，如 n 端疏水性片段在立体空间中要处于相邻位置( 即多肽链折叠同转) 。而多肽中的脯氮 酸残基对多肽链的回转结构起着重要作用因脯氨酸具有特有的亚胺基环结构不能与相 邻氨基酸形成氢键。 酶法水鹪蛋白质产生苦味与否以及苦味的犬小还与底物蛋白质的种类、酶的类型、 水解度及分离方法等因素有关。研究表明：疏水性氨基酸由于肽键的形成居于肽链非端 基位置时，表现出的苦味最大，当它居于c 、n 端时苦味较低，以游离氨基酸的形式苦 味最低( a n t is ，e ta l ，1 9 7 0 ；t a r n u r a m ，1 9 9 0 ：郭本恒1 9 9 6 ：u m e t s u h ，e ta ， 1 9 8 3 ) 人们对蛋白水解物的苦味研究很多，k i r i m u r a 等( 1 9 6 9 ) 研究了六十种合成二肽的 味觉特征，这些二肽分别带有酸味、苦味或无味，其中苦味肽都含有些长链基侧链或 芳香侧链的氮基酸到七十年代左右对蛋白水解物中的苦味物质进行了系统深入的研 究，弄渍了这些苦味物质的化学本质。它们是一些疏水性的肽类。在弄清了苦味成分的 化学性质后，人们有针对性地找到了许多解决这一问题的方法( 竺尚武。1 9 9 2 ；许永红 1 9 9 7 ) 。 至目前为止。蛋白水解物的苦味脱除方法大体有以下几种( t a m u r am ，1 9 9 0 ： 庸传核等。1 9 9 8 ) ： ( 1 ) 选择性分离法：利_ l = j 苦味的疏水性。采用乙醇抽提或疏水性树脂吸咐。去除 苦味；( 2 ) 掩盖法( m a s k i n g ) ：采用环状糊精、多磷酸盐、谷氨酸、天门冬氨酸等物 质来掩盖苦肽的苦味；( 3 ) 膜分离法：其实也是一种选择分离法利用苦肽一般分子 量较小的特性，进行超滤分离；( 4 ) 酶法( 或微生物法) ：利用外切型蛋白酶作用分解 疏水性多肽的方法另外，在水解过程中通过蛋白质底物的选择、蛋白酶的筛选、控制 水解程度也可以降低水解物的苦味( 许永红，1 9 9 7 ) 。选择分离法去除苦肽一般会造成 一定的经济损失，据资料估计，采用活性炭来脱蛋白水解物中的苦味会损失2 6 左在 的多肽，而掩盖法脱苦也存在需要加入较多量掩盖剂的缺点。至于酶法脱除苦味也存在 风味差的缺限因酶作用过程中会游离出相当量的氨基酸以及低分子肽于是，不能说 哪种方法最好。要根据不同的情况而论 9 1 5 大豆蛋白水解的研究 人们对蛋白酶解制取多肽进行了大量的研究，认为多肽的酶法水解及其产品的性能 与制取过程的各个环节均密切相关。如水解反应物( 底物、酶) 的选择、水解工艺参数 的确定、产品的定性分离与纯化工艺、水解产物的处理等。 1 5 1 水解反应物 底物：大豆蛋白来源广泛，对于酶法水解人豆蛋白来说，商品化的大豆分离蛋白、 浓缩蛋白以及价格低廉的大豆脱脂粕都可作为原料，但对丁二纯度较低的底物原料来说， 其中含有的皂苷、植酸盐等可能影响蛋白水解，异黄酮、酚类及一些不饱和脂肪酸氧化 形成的醇和醛会使水解产物的异味增强。对于纯度较高的人豆分离蛋白，其成分的差异 也会对酶解产生很大的影响，有人对1 3 种不同的商品大豆分离蛋白进行了比较，当水 解在相同条件下进行至同一水解度时，其产品的性能与肽分布模式均有著异( r u t h l h e n r i ，1 9 9 8 ) 。 酶：酶的专一性和作州机制对丁多肽的生产来说至关重要对丁多肽而言，酶的应 用决定其产品性质。同时，由于大豆蛋白中存在“疏水核”及膜蛋白酶抑制剂，因此， 在选择酶时应考虑使用多种内肽酶的混合物。单一的纯化酶水解能力低，不利于底物转 化率的提高，酶的安全性经济性和有效性也是需要考虑的。通常，植物蛋白酶成本低， 但对其肽键选择性差，不适于直接水解大分子蛋白：微生物蛋白酶具有特异性，价格低， 适用于商业化生产( 邓勇等，1 9 9 9 ) 。 1 5 2 水解工艺参数的确定 商业规模生产蛋白水解物通常采用间歇式生产。但这