（农产品加工及贮藏工程专业论文）大豆乳清蛋白的加工特性与利用技术.pdf

摘要 大豆蛋白生产过程中的副产物大豆乳清液中含有大豆低聚糖、大豆乳清蛋白质、大豆异黄酮 等成分。过去许多大豆蛋白企业直接将没有处理的大豆乳清液排放到环境中由于大豆乳清液营 养丰富，b o d 、c o d 值超过了l o o o o m g l ，大量排放的乳清液对环境造成了严重的污染。现在 国内已经有不少研究者通过膜过滤的方法提取出大豆乳清中的低聚糖和异黄酮并加以利用，但关 于大豆乳清中蛋白质的营养和利用还没有相关的研究。本课题对大豆乳清中的乳清蛋白的营养价 值和功能性质做了初步的研究，为大豆乳清的开发利用提供了一些依据。 本研究通过膜分离技术浓缩富集乳清蛋白，研究了加热对大豆乳清蛋白粉的体外消化率和抗 营养因子一胰蛋白酶抑制剂的影响并进一步研究了其加工特性和提高其溶解性的工艺条件。研 究结果表明：水浴8 0 加热1 0 m i n 处理可以提高大豆乳清蛋白的消化率。1 0 0 加热5 0 m i n 、1 2 0 加热8 m i n 都可以使胰蛋白酶抑制剂失活。对大豆乳清蛋白功能特性的研究结果表明：大豆乳 清蛋白具有良好的起泡性、持油性、乳化性和乳化稳定性。在喷雾干燥前添加适当的乳化剂可以 解决乳清蛋白溶解性差的问题，当复合使用1 0 o t w e e n 一8 0 、0 7 单甘酯、o 7 大豆卵磷酯、0 7 蔗糖酯时大豆乳清蛋白的分散效果最好，分散时闻为1 1 4 s 。 综上所述，大豆乳清蛋白粉具有良好的加工特性，并且通过适当处理可以获得消化性和溶解 性良好的大豆乳清蛋白粉，所以以大豆乳清蛋白粉为原料，既可以开发出高营养价值的植物蛋白 产品，也可开发出具有加工特性的蛋白产品，减少大豆乳清液对环境的污染，变废为宝。 关键词：大豆乳清蛋白，体外消化性，胰蛋白酶抑制剂，加工特性，分散性 a b s t r a c t t h es o y b e a nw h e yo fs o yp r o t e i ni s o l a t e sf a c t o r yi sr i c hmo l i g o s a c c h a r i d e s ，p r o t e i n sa n d i s o f i a v o n e ，w h o s eb o da n dc o di sh i g h e rt h a n1 0 0 0 0 m g l i nt h ep a s tm a n yf a c t o r i e sl e to f ft h e u n t r e a t e dw a s t es o y b e a nw h e yd i r e c t l ya n dp o l l u t e de n t i r o n m e n tb a d l y r e c e n t l ym a n ys c i e n t i s t si n c h i n as e p a r a t et h eo l i g o s a c c h a r i d e sa n di s o f i a v o n ef r o ms o y b e a nw h e yt h r o u g hu l t r a f i l t r a t i o na n di t l a k e g o o du s eo ft h e m b u tt h e r e i sf e wr e s e a r c hm a d eo nt h eq u a l i t ya n du t i l i z a t i o no ft h ep r o t e i n si n s o y b e a nw h e y t h i ss t u d yi sa i ma ti n v e s t i g a t i n gt h en u t r i t i o na n dr u n i o no f p r o t e i n si ns o y b e a nw h e y s ot og i v es o m es c i e n t i f i cm e s s a g ef o rc o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o nt h es o y b c a nw h e y b yu l t r a f i l t r a t i o n ，t h ep r o t e i n si ns o y b e a nw h e yw a sc o n c e n t r a t e d t h ee f f e c to fh e a t i n go nt h et h e r a t eo fd i g e s t i b i l i t yo fs o y b e a nw h e yp r o t e i n si nv i t r o ，t h ef u n c t i o no ft h ep r o t e i n sa n dt h et r e a t m e n tt o i n c r e a s et h es o l u b i l i t yo fs o y b e a nw h e yp r o t e i n sw a sr e s e a r c h e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eh i g h e s t r a t eo fd i g e s t i b i l i t yo fs o y b e a nw h e yp r o t e i n sw a so b t a i n e db yh e a t e da t8 0 cf u r1 0 m i n t h et r y p s i n i n h i b i t o r w a s d i s a b l e d w h e n t h e t r e a t m e n t c o n d i l i o n i s l 0 0 ，5 0 m i n o r l 2 0 ，8 m i n t h ep r o t e i n sh a dt h es a n l ee m u l s i f i c a t i o na b i l i t ya n dh o l d i n go i la b i l i t ya st h es o yp r o t e i ni s o l a t e s b u ts h o w e db e r e rf o a m i n ga b i l i t ya n de m u l s i f i e ds t a b i l i t yt h a ns o yp r o t e i ni s o l a t e s a d d i n gp r o p e r e m u l s i f i e r sc a l li n c r e a s et h es o l u b i l i t y t h er e s u l t si n d i c a t e dc o m p l e xa d d i t i o n so f e m u l s i f i e r sg o tb e t t e r r e s u l t st h a ns i n g l ea d d i n g t h eb e s ts o l u b i l i t yw a sg o tw h e nc o m p l e xa d d i t i o n so fo 1 t w e e n - 8 0 ， 0 0 7 l y c e m lm o n o s t e a r a o 0 7 p o l y o x y e t h y l e n es o r b i t a nm o n o o l e a t aa n d0 0 7 s u c r o s ee s t e r so f f a t t ya c i d i nc o n c l u s i o n ，t h es o y b e a nw h e yp r o t e i nh a se x c e l l e n tf u n c t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c sa n db yp r o p e r t r e a t m e n t sw ec a ng e tw e l ld i g e s t i b l ea n dd i s s o l u b l es o y b e a nw h e yp r o t e i n s t a k i n gt h i sp r o d u c ta s m a t e r i a l ，w ec a nd e v e l o pp l a n tp r o t e i np r o d u c t sw i t hr i c hn u t r i t i o na n df u n c t i o n a lp r o t e i np r o d u c t s n o t o n l yi tc a nl e s s e nt h ep o l l u t i o no ft h ew a s t es o y b e a nw h e y ，b u ta l s oo a ni n f i k ec o n s i d e r a b l ee c o n o m i c b e n e f i tf o r t h es o y b e a np r o d u c em a n u f a c t o r i e s + k e yw o r d s ：s o y b e a nw h e yp r o t e i n s ，d i g e s t i b i l i t yi nv i t r o ，t r y p s i ni n h i b i t o r , f u n c t i o n ，s o l u b i l i t y i i 独创性声明 y9 3 9 4 6 4 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：二裂k 钧 时间： 扣6年5 月叮日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。- ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：二昶萎存匀 翩虢象川豫 导师签名：彳郴川蔓以 时间：抄i 年占月, g b 时间：沙。f 年i 月，画 1 1 研究目的和意义 第一章绪论 大豆乳清是大豆分离蛋白生产中的副产物，总固形物浓度约为1 2 其中含有粗蛋白质 2 0 5 ，碳水化台物6 2 1 。大豆乳清的化学耗氧量( c o o ) 为1 50 0 0 - - 2 20 0 0 m g l ，生化需氧量( b o d ) 高达1 0 0 0 0m g l 以上。据有关资料报道，生产7 5 吨大豆分离蛋白所捧出的大豆乳清，其b o d 值相当于一个2 5 3 万人口的城市一天所摊放的生活废水的c o d 值( 高以恒等，1 9 8 9 ) 。目前国内 一些大豆蛋白生产企业向环境排放没有经过处理或处理后仍然没有达到国家排放标准的大豆乳 清废液，对环境带来了污染。随着市场对大豆分离蛋白的需求增加，国内生产大豆分离蛋白的厂 家逐渐增多，生产规模也逐渐扩丈，排放出越来越多的乳清废液所带来的污染问题也日益严重( 郭 心义，2 0 0 4 ) 。对乳清废液常见的处理方法是直接将进行多级生物处理，利用厌氧和好氧法降低 废水中的c o d 及b o d 值，但这样的处理很难达至b 国家排放标准( 储力前，2 0 0 0 ) 。目前人们已 经开始对大豆乳清回收以及综合利用进行了研究，但主要集中在对大豆低聚糖和异黄酮回收利用 的研究上，缺少对大豆乳清中的蛋白质的研究。 大豆乳清蛋白质的氨基酸组成合理，是一种优质的蛋白质。但由于含有胰蛋白酶抑制剂、凝 集素等抗营养因子，并且大豆乳清蛋白是热敏性蛋白，加热后发生变性导致溶解性不好。所以要 开发利用大豆乳清蛋白除了要解决工艺上提取浓缩的问题以外，还要解决大豆乳清蛋白的可消 化性和活性成分生理问题以及蛋白质的溶解性问题。 本课题的目的是提高大豆乳清蛋白的消化性，摸索出抗营养因子的加热钝化条件，测定不 同条件下大豆乳清蛋白的加工特性，以及解决热处理引起的大豆乳清蛋白粉的溶解性低的问题， 为大豆乳清蛋白的开发利用提供理论依据。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 大豆乳清蛋白盼组成与氨基酸分析 大豆分离蛋白的生产一般是在碱性条件下提取，然后调节p h 值到大豆蛋白的等电点p h 4 5 - 4 8 ，使约7 5 的蛋白质沉淀下来，沉淀的蛋白称为酸沉蛋白，还有一部分留在上清液中的非酸沉 蛋白既为大豆乳清蛋白。 大豆乳清蛋白约占大豆总蛋白的8 ，主要是由2 s 组成。早在1 9 5 9 年r a c k i s 就利用色谱 分离与超速离心以及电泳分析技术研究了大豆乳清蛋白的组成，用超速离心分析结果表明大豆乳 清蛋白有8 个组分，它们的s 2 0 w 值在0 9 9 s 一6 1 4 s 之间，同时凝胶电泳分析结果表明，大豆乳清 蛋白的组成非常复杂，至少存在1 3 种蛋白质，其中主要的组分有胰蛋白酶抑制剂、血球凝集素 和淀粉酶。 r a c k i s 在1 9 7 1 分别用碱溶酸沉法、酸沉法、醇溶法、湿热法四种方法制备大豆乳清。结果 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 表明四种方法获得的乳清的得率、乳清的含氮犀、用三氯乙酸沉淀后蛋白氮和非蛋白氮的比例均 不相同。同时研究的结果还表明加热( 8 0 ，5 m i n ) 处理将乳清蛋白质分为两部分：一部分蛋白变 性凝聚，另一部分蛋白仍然存在溶液中，二者的比例为1 3 ：1 。 表l - 1 大豆乳清蛋白的氟基酸组成( 1 6 9 n ) l 、b l ei - 1t h ea m i n oa c i dc o d s t l t u t e so fs o y b e a nw h e yp r o t e i n s 注：引至( r a c k i s 1 9 7 1 ) 蛋白质是人类生存所必需的营养物质，其主要功能是为机体合成蛋白质和其他含氮物质提供 氦和氨基酸。一种蛋白质的营养价值取决于它的消化性、吸收性、氨基酸的利用率。不同来源的 蛋白的氨基酸利用率各不相同，另外加工条件和其他组分的相互作用也会影响氨基酸的利用率。 优质的蛋白质的必需氨基酸组成符合人体所需的必需氨基酸比例，如果蛋白质的氨基酸组成缺乏 一种或两种以上必需氨基酸，这种蛋白质的营养价值是不理想的( f r i e 蛐，2 0 0 1 ) 。大豆蛋白质的 必需氨基酸组成中含硫氨基酸含量较低，远低于谷物蛋白和肉类蛋白质，是大豆蛋白质的限制性 氨基酸( f r i e d m a n ，1 9 9 6 ；s a r w a r 等，1 9 9 3 ) 。 从表卜1 可知大豆乳清蛋白的含硫氨基酸( 蛋氨酸、胱氨酸) 含量高于大豆蛋白质。表1 - 2 所 示是大豆乳清蛋白的必需氨基酸模式。可以得知大豆乳清蛋白的必需氨基酸的组成比例平衡，除 了异亮氨基酸与缬氨酸的含量较低外，其余氨基酸与鸡蛋蛋白质接近。 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 裹1 - 2 大豆乳清蛋白的必需氮基酸模式。 t a b l e1 - 2e s s e n c i a la m i n oa c i dp a t t e r no f s o y b e a nw h e yp r o t e i n s 按鸡蛋蛋白质的氨基酸的计算( m g 幢总的必需氨基酸) 注：引至( r 觚“1 9 7 1 ) 1 2 2 大豆乳清蛋白的特性 蛋白质含有很多化学功能基团，如氨基、羧基、酰基、酰胺基、羟基、硫氢基和二硫基等， 这些基团影响了蛋白质的功能性。不同的蛋白质所含有的化学基团种类和数量各不相同因此具 有的功能特性也不相同。食品加工中，蛋白质的加工特性尤其是蛋白质的溶解性是发挥其所具有 的各种功能特性的前提。大多数蛋白质在等电点时会发生沉淀现象限制了它们的应用范围。由 于大豆乳清蛋白在不同的p h 下都能溶解，所以可以将其功能特性应用在各种食品加工中，尤其 是酸性食品的生产。 有研究报道了大豆乳清蛋白具有很好的起泡性和乳化性( k a j i y a m a 等，1 9 9 5 ) 。蛋白质的分 子量大小，分子构型和表面性质也决定了蛋白质的功能性质。通过酶解将蛋白质水解成小分子片 断后，其功能特性会发生变化。有专利报道用蛋白酶水解大豆乳清蛋白可以获得更好的起泡性， 产品可以用来制作松糕( c h i a n , 1 9 7 6 ) 。这方面国内的研究非常有限，为了更好的开发利用大豆 乳清蛋白。还需要进一步深入的研究。 1 2 3 大豆乳清中的抗营养因子一胰蛋白酶抑制剂 人们对大豆中胰蛋白酶抑制剂的认识已有近百年的历史。1 9 1 7 年o s b o r n e 和m e n d e l 首先观 察到大豆的抗营养作用而后r e a d ( 1 9 3 8 ) 发现大豆粉的水提取物能够抑制胰蛋白酶的活性。据 l i e n e r ( 1 9 9 6 ) 报道生的大豆对大鼠生长的抑制作用有4 0 是由蛋白酶抑制剂引起的。 1 大豆胰蛋自酶抑制剂的分子结构与功能 大豆胰蛋白酶抑制剂是分子量较小的具有生理活性的功能性蛋白质。根据氨基酸序列同源性 可分为以下两类： ( 1 ) k u n i t z 类抑制剂( k u n i t zt r y p s i ni n h i b i t o r ，k t i ) 此类抑制剂由k u n i t z ( 1 9 4 5 ) 首次从大豆中分离并结晶出来，因此而命名。这类抑制剂的分子 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 i i i i i 量为2 0 2 5 k d ，由1 8 1 个氨基酸组成，含有2 个二硫键。活性中一6 , ( u p 直接参与和胰蛋白酶相互 作用的部位) 位于第6 3 个氨基酸( 精氨酸) 和第6 4 个氨基酸( 异亮氮酸) 之间。由于分子内只有一个 活性中心，因而又被叫做单头( s i n 9 1 e _ h e a d e d ) 抑制剂，主要对胰蛋白酶直接地、专一地起作用。这 类抑制剂与胰蛋白酶的结合是定量进行的，i t o o l 的抑制剂可以结台1 m o l 的胰蛋白酶。 ( 2 1b o w m a n - b i r k 类抑伟4 剂( b o w m a n - b i r ki n h i b i t o r ，b b d 此类抑制剂是因为b o w m a n ( 1 9 4 4 ) 首先从大豆中分离并由b i r k ( 1 9 6 1 ) 鉴定而得名。这类抑制剂 的分子量为6 - - , 1 0 k d ，由7 1 个氨基酸组成，含有7 个二硫键。它有两个活性中心，分别位于第 1 6 个氨基酸( 赖氨酸) 平口第4 3 个氨基酸( 亮氨酸) 与第4 4 个氨基酸( 丝氨酸 之间，可分别与胰蛋白酶 和糜蛋白酶结合。由于抑制剂分子内有两个活性中心，故被称为双头( d o u b l e - h e a d e d ) 抑制剂。 k u n i t z 类和b o w m a n - b i r k 类抑制剂在大豆中的含量分别为1 4 和0 6 ，二者占人豆全蛋白 的6 0 h h y m o w i t z ，1 9 9 4 ) 。这两类胰蛋白酶抑制剂对热、酸、碱的稳定性有所差异。纯化的k u n i t z 类抑制剂在温度低于3 0 y 2 ，p h 值l 1 2 范围内保持其活性。在8 0 ( 2 短时间加热能使它可逆地变 性，而在9 0 ( 2 加热则使它不可逆地失活。b o w m a n b i r k 类抑制剂比k u n i t 类抑制剂对热、酸、碱 的稳定性强。 v a n d e n ( 1 9 9 9 ) 报道大豆胰蛋白酶抑制剂的失活根据其耐受性可以分为两个阶段，第一阶段是 k t i 失活，第二阶段是b b i 失活，二硫键的数目的不同是它们对热稳定性不同盼主要原因( b i r k ， 1 9 6 1 ) 。 2 胰蛋白酶抑制剂的抗营养特性 胰蛋白酶抑制剂对动物的有害作用主要是引起生长抑制和引起某些动物胰腺肥人。胰蛋白酶 抑制剂对动物生长产生抑制作用，一般认为有以下两方面的原因： f 1 ) 胰蛋白酶抑制剂能和小肠中的胰蛋白酶及糜蛋白酶结合，形成稳定的复合物，使酶失活， 导致食物蛋白质的消化率降低，引起外源性氮的损失。 ( 2 ) 胰蛋白酶抑制剂可引起胰腺分泌活动增强，导致胰蛋白酶和糜蛋白酶的过度分泌。由于这 些蛋白酶含有非常丰富的含硫氨基酸，使的这些原本用于合成机体组织蛋白的氨基酸转而用于合 成蛋白酶，蛋白酶和抑制剂形成复合物最终通过粪便排出体外，从而导致内源性氮和机体含硫氨 基酸的大量损失( 李德发。2 0 0 3 ) 。 r a e k i s ( 1 9 6 3 ) 用不同的大豆组分包括：大豆耪、大豆非水溶性残渣、酸沉蛋白、大豆乳清蛋 白粉、大豆乳清蛋白、对照酪蛋白进行了小鼠的喂养试验，这些样品用两种不同的加工方法处理： 一种没有经过加热处理而通过冷冻干燥提取。另一种经过湿蒸汽或喷雾干燥制得。没有经过热处 理的样品中胰蛋白酶抑制剂活性很高，对大鼠的生长抑制很严重同时引起大鼠胰腺的肿大。胰蛋 白酶抑铝4 剂引起动物胰腺肥大的机理至今尚未完全弄清。一般认为，由于c c k p z 的分泌增加， 因而促使胰腺的分泌过度增加，使胰腺外分泌组织细胞的体积增大和数量增多，从而引起胰腺代 偿性肥大。许多报道表明，用生大豆粉饲喂猪、牛、狗和猴并未引起胰腺肥大( s t r u t h e r ，1 9 8 3 ： g a l l a h e r ，1 9 8 6 ) 。一些研究者认为，不同种类动物胰腺的相对重量与它们对胰蛋白酶抑制剂反 应的敏感性之问似乎有直接关系。据报道，胰腺的重量超过体重0 3 的动物( 如小鼠、大鼠、小 鸡等) ，易受胰蛋白酶抑制剂的影响而引起胰腺肥大：而胰腺重量小于体重0 3 的动物( 如猪、犊 牛) 则不出现胰腺肥大。 4 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 评价大豆抗营养因子适宜钝化程度的目的是为了改进工艺。严格地说，仅仅测定热加工后产 品的脲酶活性、蛋白质溶解度等物理化学指标，不能达到优化大豆加工工艺的目的( b u r n s ，1 9 8 7 ) h o l m e s ( 1 9 8 7 ) 认为胰蛋白酶抑制荆是衡量热加工程度最准确的指标。许多学者认为用于食品 和饲料的大豆及其产品中胰蛋白酶抑制剂的钝化程度应大于8 0 9 6 ，适宜范围为8 5 9 6 9 0 ( r s e s t t ，1 9 9 7 ) ，用于婴儿的大豆制品中胰蛋白酶抑制剂的钝化程度应在9 2 9 7 。h a c k l e r ( 1 9 6 5 ) 等指出认为豆奶中胰蛋白酶抑制剂活性被钝化9 0 才能获得最高的营养价值。 有很多关于加工豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性残留测定的相关研究。郭乾初( 1 9 9 7 ) 测定了 一些常见的大豆饮料中残留的胰蛋白抑伟4 剂活性，结果表明某些应用现代加工方法生产的大豆饮 料在消除抗营养因子的处理上不够充分。r a c k i s ( 1 9 7 1 ) 测得从没有经过热处理的乳清中提取的乳 清蛋白的胰蛋白酶含量为1 0 4 0 m g 1 0 0 9 ，常压蒸汽处理3 0 分钟可以将其含量降低至5m g 1 0 0 9 。 过度的热处理对于蛋白质的变性是非常严重的，蛋白质的营养价值也会损失。所以需要摸索出一 套既可以消除乳清蛋白中胰蛋白酶抑制剂的含量，又可以保持其营养价值的热处理方法。 使胰蛋白酶抑制剂失活的方法有很多。除了生产中常规使用的加热处理以外还有物理钝化的 方法，例如：高频微波电磁场处理、低频超声波处理、辐照处理技术以及使用化学试剂破坏其二 硫键结构使其分子结构发生改变而失去活性的化学钝化方法。近年来，随着生物技术的发展。应 用生物活性酶来消除抗营养因子已成为可能。但大多数的方法仍然处在实验室研究阶段。 1 2 4 大豆乳清中生理活性成分 除了胰蛋白酶抑制剂，大豆乳清中还含有多种生理活性成分：大豆低聚糖、大豆异黄酮、大 豆凝激素等。其中的大豆低聚糖可以促进双歧杆菌的增殖，但对肠道内多数有害细菌几乎不起或 只有微弱的增殖作用，还能阻止病原茁对肠道的感染，促进肠道蠕动防止便秘，分解体内致癌物， 抑制肠道内菌群产生亚硝基化合物等生理功能( 刘国庆，2 0 0 1 ；金其荣，1 9 9 4 ：张慧敏，1 9 9 8 ) 。 1 9 9 5 年a d l e r c r e u t z 首次报道关于大豆异黄酮的研究：异黄酮与哺乳动物的雌激素结构相似，因 此具有雌激素的多种生理活性( a d l e r c r e u t z ，1 9 9 5 ) 。多来年的研究以及动物试验表明大豆异黄酮 除了具有微弱的雌激素活性外还具有抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性( p e t e s o n 等，1 9 9 3 ； p a t e l 等，2 0 0 1 ) ，能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、结肠癌、肺癌、胃癌，乳腺癌和前列 腺癌等多种疾病的发生( k m 2 e r , 2 0 0 2 ；l a m a r t i n i e r c 等，2 0 0 2 ) ，尤其是对乳腺癌和前列腺癌有积极 的预防和治疗作用( h a n 等，2 0 0 2 ；k r i t z s i l v e r s t e i n 等，2 0 0 2 ；a r e n a 等，2 0 0 2 ) 。 1 2 5 膜技术分离大豆乳清的现状 分离技术是在2 0 世纪初出现，2 0 世纪6 0 年代迅速发展起来的一门新兴的分离技术。顾名 思义，膜分离就是利用一张具有选择透过性的薄膜在外力的推动下，对混合物进行分离、提 纯、浓缩的一种分离方法。由于分离膜具有选择透过性，混合物中的某些成分可以通过，其他 的成分不能通过，从而实现了对混合物的分离( 高以恒，1 9 8 9 ) 。 以压力差为推动力的液化膜分离过程通常根据分离对象可分为：微滤( m f ) 、超滤( u f ) 、纳 滤( n f ) 和反渗透( r 0 ) 四种类型。微滤用于截留直径为0 0 2 1 a m 1 0 p m 大小的粒子，可用于发酵液 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 除菌、澄清及细胞收集等。超滤可分离分子量从上千到数百万的可溶性大分子物质，对应孔径约 2 - 2 0 n t o 。超滤膜规格通常不是以孔径大小作为标准，而是用截留分子量( m o l e c u l a r w e i g h tc u t - o f f ， m w c o ) 为指标。纳滤集浓缩与脱盐为一体，膜平均孔径l 一2 n m ，用于分离溶液中分子量为2 0 0 1 0 0 0 d a 的小分子物质，如抗生素、氨基酸等。反渗透膜因其致密的分离结构，对离子有效截留， 主要用于海水脱盐，纯水制造以及小分子产品浓缩等( 姚红娟，2 0 0 3 ) 。 为了解决大豆分离蛋白生产的副产物大豆蛋白的回收利用问题。国内有许多研究者采用超滤 技术来处理大豆乳清废液。大豆乳清中尚含有未沉淀完全的大豆蛋白、少量脂肪磷酸、植酸、悬 浮固体及无机盐等杂质，超滤时容易造成膜污染。研究者设计了超滤分离大豆乳清蛋白的分离工 艺方案，详细的评价了膜与组件的选择、优化了操作参数，并对膜清洗工艺及浓缩液的应用做 山了全面的研究和论述( 陈寿鹏，1 9 9 4 ) 。为了提高膜过滤的应用效果可以结合超滤处理和反渗透 技术( 储力前等，2 0 0 0 ) 。利用膜技术综合回收大豆乳清中的乳清蛋白、异黄酮、低聚糖( 林杨等， 2 0 0 1 ) 。 关于利用大豆乳清开发新产品的研究也有很多报道。芦耀环等人以大豆乳清为原料来开发 乳清饮料并分析了产品的营养价值( 芦耀环。1 9 9 5 ) 。用大豆乳清为原料利用微生物发酵后调配出 一种富含氨基酸的清凉饮料( 熊善柏等。1 9 9 6 ) 。还可以将浓缩得到的蛋白液作为酵母的培养液 ( 陈寿鹏，1 9 9 4 ) 。在常压下使用蛋白酶来酶解大豆乳清蛋白的效果并不理想，有文献报道高压条 件下用胰蛋白酶、胰凝蛋白酶和肽酶水解大豆乳清蛋白可以得到在不同的p h 条件下都能溶解的 蛋白水解物( e l e n a ，2 0 0 3 ) 。 6 2 1 前言 第二章大豆乳清蛋白的制备与加工特性的研究 超滤具有两大优点：提供了不加热或不发生相变进行大分子质量的浓缩、分离的机会：适于 从分子量分布范围广的复杂混合物中分离出小分子质量组分，并且能耗低、设备简单、占地少， 因此，自2 0 世纪6 0 年代以来，被j l 泛地应用于食品、医药、水处理以及新兴的生物技术等领域。 在国内有许多厂家开始克尝试利用膜技术分离、纯化、回收、浓缩在蛋白质方面应用非常成熟， 据报道已经实现了对乳清蛋白，血清白蛋白、蛋清蛋白等的分离、纯化、回收、浓缩( 姚红娟， 2 0 0 3 ) 。 由丁大豆乳清蛋白是热敏性蛋白，加热后有一部分蛋白质将发生变性凝聚沉淀，通过测定可 以知道大豆乳清蛋白的必需氨基酸组成合理，但加热后的两部分蛋白的必需氨基酸组成不弼，且 均不理想( r a c k i s 。t 9 7 t ) 。因此，可以利用非热处理的膜分离将大豆乳清中的大豆蛋自提取出来。 本试验以脱脂豆粕为原料，根据碱溶酸沉法制得大豆乳清，通过超滤将大豆乳清液中的大 豆低聚糖与大豆异黄酮以及盐分除去，最后将得到的大豆乳清蛋白浓缩液喷雾干燥得到大豆乳 清蛋白粉，测定了其组成成分。因为蛋白质的起泡性、持油性、乳化性、乳化稳定性是通常被 利用的加工特性，并且p h 值与蛋白质的加工特性有密切的联系，所以本研究测定了制备得到 的大豆乳清蛋白的上述加工特性以及p h 值对这些加工特性的影响。 2 2 试验材料 2 2 1 试验材料及主要试剂 试验材料：低温脱脂豆粕，由哈尔滨高科技有限公司提供。 主要化学试剂：氢氧化钠、盐酸、亚硫酸氢钠、氯化钠、甘油、脲、甲醇、三氯乙酸、浓 硫酸、乙醇、溴酚蓝、丙烯酰胺、过硫酸铵、硫酸钾、硫酸铜、甲烯蓝、乙醇、甲基红、硼酸、 硫酸铵等均为北京化学试剂公司分析纯产品；十二烷基硫酸钠( s d s ) 、p 巯基乙醇( 2 - m e ) 、 甘氨酸为s i g m a 公司产品；n ，n - 甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺( t e m e d ) 为f l u k a 公司产 品； i r i sb a s e ( p r o m e g ac o r p o r a t i o n ，u s a ) ；考马斯亮蓝( c b b ) g 2 5 0 为香港f i s h e rs c i e n t i f i c 产品。 2 2 2 主要仪器设备 名称 高速台式离心机 台式离心机 酸度计 型号 t g l 一1 6 c t d l - 4 0 b p h s 3 c 7 产地 上海安亭科学仪器厂 上海安亭科学仪器厂 上海虹益仪器厂 中国农业大学硕士学位论文第二章大豆乳清蛋白的制备与加工特性的研究 万分之一电子天平 a y 2 2 0s h i m a d z u ，j a p a n 千分之一电子天平 o f - 3 0 0 a n d , j a p a n 循环水真空泵s h b i郑州市上街华科仪器厂 高速分散器 t 1 8b a s i c i k a ，广州 喷雾干燥机 e y e l as d 1 0 0 0e y e l a ，j a p a n 试验用膜分离装置t 8 5 - 1上海东核级树脂有限公司 喷雾干燥机 e y e l as n l o o o e y e l a ，j a p a n 紫外可见分光光度计s p e c t r u ms p 2 1 0 0 u v上海光谱仪器有限公司 恒温磁力搅拌器9 0 - l 型上海沪西分析仪器厂 2 3 试验方法 2 3 1 大豆乳清蛋白的制备： 称取一定质量的脱脂豆粕与蒸馏水以i ：1 5 ( w v ) 的比例混合，用1 nn a o l f 溶液调整p h 值至8 0 ，室温条件下用恒温磁力搅拌器低速搅拌、抽提l 小时后，离心除去豆渣，再用1 nh c i 将蛋白提取液的p h 值调至4 5 ，静置半小时。4 2 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，除去沉淀后得到大豆乳清 液。因为1 1 s 球蛋白具有冷沉的性质( k o s h i y a m a ，1 9 6 5 ) ，可以利用这一性质进一步地除去大豆 乳清中的球蛋白。1 n 的n a o h 溶液将其调整到7 0 ，在4 x 2 条件下放置1 个小时后。4 2 0 0 r p m ， 1 0 m i n 离心将沉淀除去。然后使用连续式中空纤维膜超滤装置( 图2 - 1 ) 浓缩上述乳清。使用 的膜材料为聚砜，截留分子量为i o k d 。工作压力为0 i m p a ，常温下操作。在连续超滤装置的压 力作用下，小分子量的水和低聚糖以及盐分等成分不断的排出，大豆乳清液不断被浓缩，浓缩 液中蛋白含量不断升高。最后将大豆乳清浓缩液按表2 3 所示参数喷雾干燥得到大豆乳清蛋白。 盎 过 寰 国2 - i 中空纤维超滤系统示意图 f i g 2 - 1h o l l o wf i b e rm e m b r a n eu o t r a f i l t r l t i o ns y s t e m 田2 - 2 大豆乳清蛋白提取工艺流程图 f i g 2 - 2p r e p a r a t i o no f s o y b e a nw h e yp r o t e i n s 表2 - 3 喷雾干燥的工艺参数 t a b l e2 - 3s p r a y i n gd r y i n gc o n d i t i o n s 2 3 4 总蛋白质含量的测定 总蛋白质含量的测定：微量凯氏定氮法 9 中国农业大学硕士学位论文 第二章人豆乳清蛋白的制各与加工特性的研究 2 3 5 大豆乳清蛋白粉总糖、水份和灰分的含量测定 ( i ) 总糖测定：苯酚一硫酸法，以蔗糖为标样( 邹琦，2 0 0 0 ) ( 2 ) 水份测定：g b t5 0 0 0 9 3 - 2 0 0 3 食品中水份的测定方法 ( 3 ) 灰分测定：g b t5 0 0 0 9 4 - 2 0 0 3 食品中灰分的测定方法 2 3 6 起泡性的测定 参考c h e n 等( 1 9 8 5 ) 的方法，具体操作如下： a 蛋白质溶液的制备。 分别配制5 的大豆分离蛋白和大豆乳清蛋白的溶液。 b 搅打试验 分别取上述各溶液1 5 m l 于量筒中，称量量筒和分散液附总重量后，将分散液转移到一不锈 钢容器中。用搅拌器高速搅打，每3 m i n 停一次，搅打3 次。用量筒量取1 5 m l 的泡沫并称 重。重复以上的试验过程3 次。根据以下的公式计算泡沫膨胀的程度，并用膨胀率来表示蛋 白质的起泡性，每个样品做三个重复。 j 掣糊咿型型幽幽掣掰黑掣盟堂塑盟1 0 0 2 3 7 乳化性和乳化稳定性的测定 ( 式2 - 2 ) 参考k e v i n ( 1 9 7 8 ) 和b e m a r d ( 2 0 0 2 ) 的方法。取7 5 m lo 2 的待测蛋白液( o 2 9 蛋白 质溶解到0 2 m ，州值为7 0 的磷酸缓冲液中) ，与2 5r n l 大豆色拉油混合。用均质机在1 4 0 0 0 r t m i n _ 卜均质9 0 s 。分别在搅拌后0 和1 0 m i n ，取出l o o t a 的乳浊液稀释于5 0i l l l 的o 1 的s d s 溶液 中，混合后在5 0 0 h m 下测定吸光值( 以s d s 溶液为空白) ，每个样品做三个重复。 以0 时刻的吸光值表示乳化性( e ) ；乳化稳定性( e 。) 用乳化稳定指数( e s i ) 表示，计算方 法如下： e a l 2 3 0 3 xa o l a 为乳浊液在5 0 0 r a m 下的吸光度，l 为比色杯厚度。 e s i = ( a o a t ) a a a 。为0 时刻的吸光值：a t 为时间差m i r a a 为t 时间内的吸光值羞。 o ( 式2 - 3 ) ( 式2 - 4 ) 中国农业大学硕士学位论文 第二章大豆乳清蛋白的制各与加工特性的研究 2 3 8 持油性测定 参考哈高科( 2 0 0 2 ) 的方法。称取5 0 9 分离蛋白样品置于烧杯中，并称取4 5 0 9 精制植物 油倒入烧杯中，在2 5 c t 搅拌5 分钟，形成均匀的悬浊液，取l o m l 悬浊液于刻度离心管中， 在1 , 5 0 0 r p m 下离心2 5 分钟，读取离心管中析出油的体积毫升数，每个样品做三个重复。 2 4 结果与讨论 持油性( ) = 堡型喾盟1 a 口 2 4 1 大豆乳清蛋白粉的主要成分含量 ( 式2 5 ) 大豆乳清中低聚糖的含量非常高，通过超滤将分子量小于i o k d 。的低聚糖、盐分、水份排 出。乳清不断的被提纯、浓缩。最后得到喷雾干燥的乳清粉的组成如下图2 - 3 所示： 8 0 7 0 e o 5 0 雹“ 删 缸3 0 2 0 1 0 o 蛋白质水分 总糖灰分 其它 图2 - 3 大豆乳清蛋白粉的组成 t a b l e2 - 3c o n t e n to f c o m p o s i t i o n si ns o y b e a nw h e yp r o t e i n sp r o t e i n s 超滤将大豆乳清分为浓缩液和透过液两部分，浓缩液中是分子量火于超滤膜截留分子量的 中国农业大学硕士学位论文 第二章大豆乳清蛋白的制各与加工特性的研究 蛋白质，透过液中主要是分子量小的异黄酮、低聚糖和盐分。在实际的生产中可根据产品要 求，确定需要的浓缩倍数，得到不同蛋白质含量的大豆乳清蛋白粉。本试验得到的大豆乳清蛋 白耢中蛋白质含量高于7 0 ，基本满足了测定蛋白质加工特性以及其它试验分析的需要。 2 4 1 大豆乳清蛋白的起泡特性 大豆蛋白分子具有典型的两亲结构，所以在分散液中表现出较强的界面活性，具有一定程 度降低界面张力的作用，所以当大豆分离蛋白溶液受到急速机械搅拌时大量混入的气体和水形 成界面，大豆蛋白质分子吸附在界面上，降低界面张力，促进界面的形成，就此形成了泡沫 ( g a r c t a , 1 9 9 7 ) 。本试验分析了大豆乳清蛋白和大豆分离蛋白的起泡能力。 如图2 - 4 所示，大豆乳清蛋白的起泡能力高于大豆分离蛋白，是分离蛋白的1 3 4 倍。有 研究表明起泡性与蛋白质的分子量有关，分子量越高起泡性越差( c a l d e r o nd el a b a r c a ，2 0 0 2 ) ， 泡沫形成的快慢与蛋白质的结构有关结构越疏松，盘绕越无序则泡沫形成的速度越快 ( h a l l i n g , t 9 8 1 ；d a m o d a r a n ，1 9 9 0 ) ，因为大豆乳清蛋白的分子量范围为7 9 7 5 1 0 2 0 0 0 d a ，大豆 分离蛋白的分子量范围为1 8 0 ( 0 0 ( m a r u 2 a m ae ta 1 ，1 9 9 8 ；t h a n he fo f ，1 9 7 9 ) v 3 7 50 0 0 ( k i t a m u r a “ 以，1 9 7 6 ；u l s u m ie t a l ，1 9 8 1 ) ，而且大豆分离蛋白多为球状、规则结构，所咀大豆乳清蛋白的起泡 性要好于大豆分离蛋白。因此大豆乳清蛋白可以应用在冷冻甜食、蛋糕、奶糖和蛋白甜饼等食 品的生产中。 3 5 0 3 0 0 2 5 0 主2 0 0 碍 崔1 5 0 琏 1 0 0 5 0 大豆分离蛋白大豆乳清蛋白 图2 4 大豆分离蛋白和大豆乳清蛋白的起泡性 f i g 2 - 4t h ef o a m i n ga b i l i t yo f i s o l a t e ds o y b e a np r o t e i n sa n ds o y b e a nw h e yp r o t e i n s e r r o r h n 件p r e 韩n 协o l l e s t a n d a r de r r o r a r o u n d t h e m e a n ( n - 3 ) 不同字母表示n 卸0 5 水平上有显著性差异 中国农业大学硕士学位论文 第二章大豆乳清蛋白的制备与加工特性的研究 2 4 2 大豆乳清蛋白的持油性 大豆分离蛋白具有理想的持油性可以添加到肉制品和煎炸制品中，增强持油性，减少油 腻和油脂的析出。本试验以大豆分离蛋白为对照，分析了人豆乳清蛋白的持油性。图2 - 5 表明 大豆乳清蛋白和大豆分离蛋白的持油性基本一样，同样具有理想的持油性，可以作为配料应用 在需要减少脂肪流失的食品加工中。 童 祷 藿，5 0 图2 5 大豆分离蛋白和大豆乳清蛋白的持油性 f i g 2 - 5t h eh o l d i n go i ln b i l i t yo f i s o l a t e ds o y b e a np r o t e i n sa n ds o y b e a nw h e yp r o t e i n s e r r o rb a r sr e p r e e n t s o n e s t a n d a r d a r o u n d t b e m e a n f , 3 - 3 ) 相同字母表示n = 0