（食品科学专业论文）储藏期金华火腿中优势霉菌生长预测模型的建立及其应用.pdf

川l l 水业h 坝 。学位蹬文 摘盟 摘要 对我国八种金华火腿自然块做了微生物菌群分布基本研究及主要菌群霉 菌的分离鉴定，并就霉菌中主要菌群在储藏期生长变化情况做了研究。其主要目的是 为了确定生长预测模型中的目的微生物。根据逐次递进的方法，按照菌种生物量在总 菌落中的优势性，产生毒素及在火腿中检出率稳定的要求，确定了目的微生物为杂色 曲霉。 按照推荐的火腿储藏低温及霉菌适宜生长温度范围，选取五种不同温度建立生长 预测模型。结果表明杂色曲霉在4 。c 、1 0 c 温度条件下，用l i n e a r 模型和q u a d r a t i c 模型拟合效果较好，且后者优于前者；在2 0 。c 、2 8 c 和3 0 c 条件下，用经典g o m p e r t z 模型和l o g i s t i c 模型拟合效果较好。经过t 检验和f 检验过程验证4 0 个生长曲线样本， g o m p e r t z 模型被接受度最好，t 检验达到1 0 0 接受度，而f 检验达到7 8 。 模型数据与实验数据进行对比，验证模型的有效性。结果表明，在低温4 c 和1 0 条件下，采用最佳拟合模型q u a d r a t i c 模型验证，在较高温度2 0 、2 8 。c 和3 0 条件下，采用最佳拟合模型g o m p e n z 模型验证，总效果在5 0 1 0 0 之间。 相对而言，g o m p e r t z 模型与实验数据的拟合效果更好。 采用模型模拟数据，考虑杂色曲霉毒素产生的条件简单且杂色曲霉产毒率为8 0 左右，并结合生物量优势，提出了金华火腿中杂色曲霉的风险内容及未来评估方向 等。该课题研究主要是建立杂色曲霉的生长预测模型，并没有针对其中毒素建立模型， 这成为评价毒素危害最为不利的因素，原因一为建立毒素预测模型难度很大且有效性 有待验证：二是微生物风险评估目前只能进行定性分析。但总而言之，该课题的风险 评估所提出的观点在适用范围内是科学合理的。 关键词：金华火腿，杂色曲霉，生长预测模型，风险评估，h a c c p 体系 川q 水、【k 凡。；f _ ! l 学托沦义 捕要 a b s t r a c t t h e p a p e r h a s a c c o m p l i s h e d r e s e a r g io i lt h e e l e m e n t a r yp a t t e r n o fm i c r o f l o r a ， i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fm a i n f u n g a l m o u l dw i t he x p e r i m e n tm a t e r i a lo fe i g h tk i n d s o fj i n h u ah a mp i e c e s ，a sw e l la st h e g r o w t hc h a n g eo fg e n e r ad u r i n gs h e l f - l i f e t h e p u r p o s e w a st oc o n f i r mt h e o b j e c t i v em i c r o o r g a n i s m i n g r o w t hp r e d i c t i v e m o d e l a c c o r d i n gt o t h e g r a d u a l a p p r o a c hm e t h o d ，t h er e q u i r e m e n t t h a tt h e g e n e r a n u m b e r p r e v a i l so v e rt h ew h o l em i c r o o r g a n i s m ，m y c o t o x i n sm e t a b o l i z i n gd u r i n gs h e l f - l i f e ，a n dt h e s t e a d yr a t e o fb e i n gp i c k e do u t ，t h ea s p e r g i l l u sv e r s i c o l o rh a sb e e nd e s i g n a t e da st h e o b j e c t i v em i c r o o r g a n i s m a st h er e c o m m e n d e dh a m s s t o r a g et e m p e r a t u r ea n dm o u l d so p t i m a lt e m p e r a t u r e r a n g e ，t h e r ew e r ef i v ed i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sd e t e r m i n e dt o e s t a b l i s hg r o w t hp r e d i c t i v e m o d e l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl i n e a rr o o d e la n dq u a d r a t i cm o d e lw e r em u c hm o r e s i m u l a t e dt h eo b s e r v e dd a t ao f a s p e r g j l l u sv e r s i c o l o ra t 4 。ca n di o 。c ，i na d d i t i o n ，t h e l a t t e rw a sv e r i f i e dt ob eb e t t e rt h a nt h ef o r m a l a t2 0 ，2 8 a n d3 0 ，t h ee f f e c t so f s i m u l a t i o nb yc l a s s i c a lg o m p e r t zm o d e la n dl o g i s t i cm o d e lh a dg a i n e db e t t e rr e s u l t s a f t e rv e r i f y i n g4 0s a m p l e so fg r o w t hc u r v eb yfa n dt t e s t ，g o m p e r t zm o d e lh a sb e e n t e s t i f i e da st h em o s ta v a i l a b l em o d e lw i t h1 0 0 a c c e p t a n c eb ytt e s ta n d7 8 a c c e p t a n c e b y f t e s t t h ee x p e r i m e n tc o m p a r e dt h ed a t ab ys i m u l a t e dw i t ht h a tb yo b s e r v e d ，i no r d e rt o v a l i d a t i n gt h e e f f e c t i v e n e s so fm o d e l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee n t i r ev a l i d i t yh a s g a i n e d5 0 1 0 0 ，w h e nu s i n gq u a d r a t i c m o d e la t4 ca n d1 0 ( 2a n dg o m p e r t zm o d e l a t2 0 ，2 8 a n d3 0 i nac o n c l u s i o n ，t h ee f f e c to fs i m u l a t i o no fg o m p e r t zm o d e lw a s b e t t e rc o r r e s p o n d i n g l y a c c o r d i n gt ot h es i m u l a t ed a t af r o mm o d e l ，c o n s i d e r i n gt h ef a c t st h a tt h ec o n d i t i o n m e t a b o l i z i n gm y c o t o x i n so f a s p e r g i l l u sv e r s i c o l o rw a se a s yc o r r e s p o n d i n g l y ，a sw e l la s t h e8 0 o fm e t a b o l i z i n gr n y c o t o x i n sr a t e ，ib r i n g e df o r w a r dt h er i s kc o n t e n t sa n dt h e a s s e s s m e n tf u t u r eo r i e n t a t i o no fa s p e r g i l l u sv e r s i c o l o ri nj i n h u ah a m t h ep r e d i c t i v e m o d e l se s t a b l i s h e d ，w h i c hw e r em a i n l ya d a p t e dt os i m u l a t et h eb i o m a s sg r o w t ho f 】i 日瓜_ p 人学顺i j 学位论文捕磴 a s p e r g i l l u s v e r s i c o l o rb u tt h e m y c o t o x i n s ，w e r eg r e a t l y l i m i tt oa s s e s st h eh a z a r do f m y c o t o x i n s r e a s o n s w e r ee f f e c t i v e n e s sa n dd i f f i c u l t yo fe s t a b l i s h i n gm y c o t o x i n sm o d e l s ， a n d m i c r o o r g a n i s m sa c t u a la s s e s s m e n t t h a tw a s j u s tb a s e do n t h en a t u r eo fe v a l u a t et a r g e t h o w e v e r , t h ev i e w p o i n t sa n dc o n c l u s i o na d v a n c e di nr i s ka s s e s s m e n tw e r ee f f e c t i v ea n d r a t i o n a l k e y w o r d s ：j i n h u ah a m ，a s p e r g i l l u sv e r s i c o l o r ，g r o w t hp r e d i c t i v em o d e l ，r i s k a s s e s s m e n t ，h a c c p 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人奋导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文 的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分 内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 时间：年月f i 时间：矽彭年多月钞f | 1 】椒、l p 人节1 学化论史 驰。j t绪【仑 1 1 引言 第一章绪论 浙江省金华生产的金华火腿以其鲜艳的色泽，独特的芳香，悦人的风味，俏丽的外形而闻名 天下，是我国腌腊制品中的精品。 据考证，唐开元年间( 公元7 1 3 7 4 2 年) 在陈藏器撰写的本草拾遗中就育金华农村制 作咸肉腌腿的记载。千百年来，金华火腿久胜不衰的秘诀何在。第一是原料采用了名为“两头乌” 的优良金华猪。其二，金华人利用了金华得天独厚的自然地理条件，即在火腿腌制期温度适宜、 洗晒期日照充足、发酵期温度恰当，使火腿得以逐渐风干，正常发酵，自然成熟致香。 据金华民间传说，宋朝名将宗泽是金华府义乌县人，他把家乡的腌腿献给朝廷，康王赵构( 即 高宗) 见其肉色鲜红似火，赞不决口，赐名“火腿”。从那以后，金华火腿成为了贡品，身价倍 增i ”。 火腿是我国最为有名的传统发酵肉制品之一，但是由于生产时间长，生产季节和储藏要求严 格，完整的火腿较大且价格不菲等不利因素，一直成为火腿难以大批量生产和购买的瓶颈因素。 为满足消费者对小包装火腿的要求，近年来以生产火腿小包装的“分割专用腿”应运而生，该课 题针对金华火腿自然块为研究对象。 1 2 金华火腿安全性研究现状及发展 追溯十年前，食品安全在全球范围内还不是一个令人关注的话题，但如今，随着疯牛病和口 蹄疫的蔓延，转基因食品的出现，从欧洲到亚洲，从发达国家到发展中国家，人们普遍面i 临一个 不安的问题：“吃什么才会安全? ” 有的学者认为，食品安全性可以区分为绝对安全与相对安全两种不同的概念。绝对安全被认 为是不可能由于食用某种食品而危及健康，从而造成伤害的一种承诺；相对安全为一种食物在合 理食用方式下或在正常食量的范围内不会导致对健康的危害或损害i 2 , 3 , 4 ) 。 从发作方式看，食品安全问题分为隐性和显性西种。隐性问题主要体现为食品的各项卫生指 标能否达标，如农药残留，这些问题一般产生于生产和运输过程，不易为普通消费者觉察；显性 问题则发生于销售与加工过程中，直接由病菌污染造成，一旦发生，就会造成大面积的中毒事件。 食品安全问题当中，以病源菌污染、真菌污染和农药等化学污染最为引起人们的关注，成为衡量 食品卫生的重要指标口t j j 。 在安全性这个广阔的课题中，食品预测微生物学、h a c c p 体系、风险分析等成为其中主要 的子课题，它们息息相关，共同构筑了食品安全性研究新领域。该课题以霉菌对火腿安全性研究 作为切入点，确定目的微生物优势霉菌，建立目的微生物的生长预测模型，然后将验证有效 的预测模型模拟数据用于该霉菌的风险评估中，并讨论其对h a c c p 体系的影响。 1 2 1 霉菌对发酵火腿安全性的影响 川l 农业凡学f 1 【：! 惮f 立沧立 纷一t 蜥沦 在金华火腿及其它一些腌脂制。w t 制作过程中，尤其是在成熟过程中，表面会长霉。尽管其表 面所长的绿霉基本不分泌毒素，或在盐浓度较高的情况r 可抑制其毒素分泌，但是其它些可能 生长的霉菌及在制作过程中，如腌制过程中真菌代谢可能分泌的毒素都会在腌腊制品中积累。虽 然这些多数为非急性的、毒性低的毒素，却往往有诱变作用。因为毒理实验已经表明，多数霉菌 毒素能诱发肝癌的发生。 但是根据民间的加工工艺记载，习惯在这段时间有意识让火腿表面长满霉菌，a # f l 普遍会认 为火腿上的霉菌与火腿的质量和色香味有直接的关系，这样的看法是缺乏科学依据的，林克忠【5 】 研究证明，金华火腿的质量和色香味的形成与火腿在发酵过程中所生长的各种霉菌没有直接的关 系人们曾在发酵阶段采用了人工控温控湿的方法来控制霉菌的生长，同样可生产出色香味俱佳 的优质火腿。但是霉菌的存在并非多余，它对那些引起腐败变质的细菌有着抑制生长的作用。由 于这种抑制作用和霉菌在火腿表面所形成的抗氧化作用，才避免了火腿在漫长的发酵阶段不会腐 败变质。但是有的研究有不同的看法，认为火腿中的霉菌的存在与火腿风味形成有直接的关系。 火腿自然块与一般意义上的火腿还存在一定的区别，因为至少火腿自然块中已经不存在长满 霉菌的表面，并依靠表面霉菌的防腐作用来延长保质期，它更多是在储藏期主要依靠低温和火腿 自然块真空包装来控制0 2 的含量，在消费期通过降低储藏温度来达到良好的保质效果。 人们很早就开始对火腿中霉菌展开研究，但就其安全性问题一赢没有定论，到底是利大于弊， 还是弊大于利。有的研究者认为，我们与其把大量的精力投入在研究其中霉菌是否有利或有害， 还不如将纯种有益霉菌直接接种到火腿，并采取人工盐水注入( 这样可以尽可能少地带入不良微 生物) 的方法生产火腿。理论上讲，我们可以在栅栏技术的指导下，通过添加一些成分降低火腿 的水分活性，同时添加一定防腐成分，并结合低温保存，控制有害霉菌的生长是完全可行的，但 许多研究工作仍有待进行。 1 2 2 其它理化、微生物因素对安全性的影响 1 2 2 1 脂肪及胆固醇氧化产物 金华火腿及其它腌腊制品生产周期很长，在这个过程中，脂肪氧化十分严重。脂肪氧化产生 的小分子物质是金华火腿的特色风味形成的重要因素之一。然而，毒理学研究表明，脂肪氧化物 可引起人体的氧化胁迫，简称o s ( o x i d a t i v es t r e s s ) ，并引起与氧化损伤相关的些慢性疾病。金华 火腿及其它腌腊制品中高含的脂肪、胆固醇氧化产物很可能会诱发和加剧动脉粥样硬化，当然目 前还没有食用腌腊制品引起和加重动脉粥样硬化的直接实验证据，但氧化脂肪对动脉硬化的诱发 和加重是肯定的。 1 2 2 2 盐对健康的影响 盐的过多食用对健康有害。已经证实，长期过多食用盐可导致高血压等心血管疾病，而且加 重肾的负担。添加食盐以促进风味已经给机体造成一定负担，如果再过多食用，对健康必然有害。 1 3 预测微生物学及其在发酵肉制品中的应用 1 3 1 预测微生物学 食品预测微生物学( f o o d p r e d i c t i v em i c r o b i o l o g y ) 是一门在微生物学、数学、统计学和应用计 算机科学基础上建立起来的新学科。它的发展方向是研究和设计一系列能描述和预测微生物在特 定条件下生长和衰亡的模型【6 j 。它是依据各种食品微生物在不同加工、储藏和流通条件下的特征 信息库，通过计算机的配套软件，在不进行微生物检测分析的前提下，判断食品内主要病原菌和 腐败微生物死亡的全过程、残存和增值的动态变化，从而对食品安全做出快速评估的预测方法 7 1 。 其主要目的是运用数学模型对微生物的生产进行定量分析。 模型结果并不一定要求百分之百的可靠，而是作为一种工具来支持我们所要获得的检验结 果。微生物预测模型模拟出来的结果在某种情况下，可以有助于提高实验设计并能预测结果的范 围。并在给定的置信度范围内，结果是可靠与可信的。 1 3 2 预测生长模型的分类 食品微生物模型假设，食品或模型系统中的微生物生长或失活，在正常生物差异限度内是可 以预测的。也能够用若干数学方程式描述。有许多不同的生物模型分类方法，一般根据w h i t i n g 和b u c h a n a n 的分类方法9 懈微生物模型分为两个犬类。即生长模型和失活，存活模型，然后每个 模型具有三个不同层次的模型水平。 1 、初级模型f p r i m a r ym o d d ) 初级模型主要表达微生物量( 或测定一起的响应值，例如浊度) 与时间的函数关系。模型的 微生物定量为每毫升菌落形成量( c f u m 1 ) ，毒素的形成，底物水平、代谢产物等。初级模型的 例子包括指数生长速率、g o m p e r t z 函数一级热失活方程。 、 2 、次级模型( s e c o n d a r ym o d e l l 次级模型主要表达初级模型的参数与环境条件( 例如，温度、p h 值、水分活度a w 等) 变量 之间的函数关系，次级模型的例子包括反应表面方程( r e s p o n s es u r f a c ee q u a t i o n ) 、平方根模型 ( s q u a r e r o o tm o d e l ) 等。 3 、三级模型( t e r t i a r ym o d e l l 三级模型主要指建立在初级和次级模型之上的电脑应用软件程序。这些程序可以在计算机上 运行，随时反映在既定的环境条件下，微生物生物量与环境条件参数的对应关系。 一般预测模型包括温度、p n 、a w 、( 盐或保湿剂) 、防腐剂等几种主要栅栏因子及其相互作用。 加工者可根据计算机数据库提供的栅栏，预测未成型产品的可贮性以及可能生长繁殖的微生物【9 j 。 该课题建立的生长预测模型将涉及到初级和次级预测模裂。 1 4 微生物风险评估 3 。+ h t 业人。、 坝h 位沦义 如啦*睦 风险分析( r i s k a n a l y s i s ) 是保证食品安全的一种新模式，同时也是一门正在发展中的新兴 学科。其中风险评估是利用现有的科学资料，对食品中某种生物、化学或物理因素的暴露对人体 健康产生的不良后果进行识别、确认和定量。它分为四个阶段：危害识别、危害特征描述、暴露 评估以及风险描述。 1 _ 4 1 风险评估研究背景l ”，1 1 , ”1 早在1 9 9 1 年。联合国粮农组织( f a o ) 、世界卫生组织( w h o ) 和关贸总协定( c a 邢联合召开 了“食品标准、食品中的化学物质与食品贸易会议”，建议c a c 在制定政荒时应采用风险评估原 理。1 9 9 1 年和1 9 9 3 年举行的c a c 第1 9 届和第2 0 届大会同意采用这一工程程序。1 9 9 4 年，第 4 1 届c a c 执委会会议建议f a o 与w h o 就风险分析问题联合召开会议。根据这一建议，1 9 9 5 年3 月，在日内瓦w h o 总部召开了f a o w h o 联合专家咨询会议，会议最终形成了一份题为风 险分析在食品标准问题上的应用的报告、风险管理和风险情况交流等三个方面，同时对风险评 估的方法以及风险评估过程中的不确定性和变异性进行了讲座。1 9 9 5 年，c a c 要求下属所有有 关的食品法典分委员会对这一报告进行研究，并且将风险分析的概念应用到具体的工作程序中 去， 另外，f a o 与w t o 要求就风险管理和风险情况交流问题继续进行咨询。1 9 9 7 年1 月， f a o w h o 联合专家咨询会议在罗马f a o 总部召开，会议提交了风险管理与食品安全报告， 规定了风险管理的框架和基本原理。1 9 9 8 年2 月，在罗马召开了f a o w h o 联合专家咨询会议， 会议提交了题为风险情况交流在食品标准和安全问题上的应用的报告，对风险情况交流的要 求和原则进行了规定，同时对进行有效风险情况交流的障碍和策略进行了讨论。至此，有关食品 风险分析原理的基本理论框架已经形成。 目前，风险分析已被认为是制定食品安全标准的基础。在风险分析的三个组成部分中，风险 评估是整个风险分析体系的核心和基础。 食品中的危害包括三类，即物理、化学和生物危害。由于物理危害非常简单，可以通过良好 的生产操作规范加以避免，因此基本不作讨论。有关化学危害的联合专家委员会( j e c f a ) $ h f a o a v h o 农药残留联席会议0 m p r ) 在这方面已经进行了大量的工作，形成了一些相对成熟的方 法。比较而言，食品中生物危害的作用和效果都更加直接和明显，但进行有关生物危害的风险评 估却是一门新兴的发展中的科学。 风险评估是一种系统地组织科学技术信息及其不确定度的方法，用以回答有关健康风险的特 定问题。它要求对相关信息进行评价，并且选择模型根据信息作出推论。风险评估过程中的不确 定度来自资料和选择模型两个方面，前者源于可获得资料的有限性以及流行病学和毒理学研究实 际资料的评价和解释：后者是当试图采用某一特定条件下发生的具体事件的资料来估计或预测另 外一种条件下类似事件的发生时产生的。有时，为了克服知识和资料的不足，在风险评估中可以 使用台理的假设。 1 4 2 风险评估内容 风险评估的过程可以分为四个明显不同的阶段：危害识别、危害描述、暴露评估，以及风险 4 描述。危害识别采川的是定性方法，其余三步可以采用定性方法，但最好采用定量方法。相对于 微生物危害而言，这一方法更适用于化学危害，这主要是因为考虑许多混淆因素比较困难。因此， 对微生物危害来说，这一方法仍停留在概念应用阶段。 1 、危害识别 通常按照下列顺序对不同的研究给予不同的重视：流行病学研究、动物毒理学研究、体外 试验和定量的结构活性关系。阳性的流行病资料以及临床资料对于危害的识别十分有用，但是由 于流行病学研究的费用较高，对于大多数危害的研究而言提供的数据有限，因此实际工作中，危 害识别一般采用动物和体外试验的资料作为依据。动物试验包括急性和慢性毒性试验，它们必须 遵循广泛接受的标准化试验程序，同时必须实施良好实验室规范( g o o d l a b p r a c t i c e ，g l p ) 和标 准化的质量保证质量控制( q u a l i t y a s s u r a n c e q u a l i t yc o n t r o l ，q a # q c ) 程序。 2 、危害描述 危害描述一般是由毒理学试验获得的数据外推到人，计算人体的每日容许摄入量 ( a c e e p t a b l ed a i l yi n t a k e ，a d d 。为了与人体的摄入水平相比，需要把动物试验的数据外推到低 得多的剂量，这种剂量一反应关系的外推存在质和量两方亟具有不确定性，此外，女4 量的种属闻度 量系数也是目前争论很大的问题。 致癌物可分为遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物。某些非遗传毒性致癌物在剂量大小不 同时会产生不同的效果( 致癌或不致癌) ，相反，遗传毒性致癌物没有这种作用。目前，安全系 数般选为1 0 0 ，用以估计试验动物与人体、以及人群不同个体之间的差异。 3 、暴霸评估 暴露评估主要根据膳食调查和各种食品中化学物质暴露水平调查的数据进行的。通过计算，、 可以得到人体对于该种化学物质的暴露量。进行暴露评估需要有有关食品的消费量和这些食品中 相关化学物质浓度两方面的资料，一般可以采用总膳食研究、个别食品的选择性研究和双份饭研 究进行。因此，进行膳食调查和国家食品污染监测计划是准确进行暴露评估的基础。 4 、风险描速 风险描述是就暴露对人群产生健康不良效果的可能性进行估计。目前全球食品安全最显著的 危害是致病性细菌。就生物因素而言，由于目前尚未有一套较为统一的科学的风险评估方法，因 此一般认为，食品中的生物危害应该完全消除或者降低到一个可按受的水平，c a c 认为危害分析 和关键控制点( h a c c p ) 体系是迄今为止控制食源性危害最经济有效的手段。 在制定具体的h a c c p 计划时，必须确定所有潜在的冠害，而这些危害的消除或者降低到可 接受的水平是生产安全食品的关键。然而，确定哪些潜在危害是必须控制的，这需要包括以风险 为基础的危害评估。这种危害评估将找出一系列显著性危害，并应当在h a c c p 计划中得到反映。 目前，对于生物性危害进行定量评估是非常困难，所以该课题就目的微生物进行定量分析不可行， 只能建立在模型数据上的定量。或者危害分析的基础上。 1 5 课题研究内容及意义 1 1 农业人学f 嘲i 学位沦文 辩一啦 晰沦 1 5 1 研究内容 1 、研究金华火腿自然块中微生物菌群的基本构相，并确定霉菌在火腿微生物菌群中的优势 情况： 2 、依据生物量优势，在火腿中检出率稳定及产生毒素特征的要求，并按照逐次递近法，确 定优势霉菌，对该类霉菌进行真菌学鉴定； 3 、就以上确定的霉菌菌种建立模型，使其置性度 9 5 ，并就模型有效性进行验证，讨论 该模型的适用范围和应用价值： 4 、依靠模型模拟数据，对金华火腿中优势的产毒素霉菌进行定性定量风险评估，定性分析 主要就该霉菌毒素的风险，定量分析主要就该霉菌数量。而他们之间相关性为霉菌数量与真菌毒 素成正比关系。 1 5 2 研究意义 现在提起食品安全，更多考虑的是确保食品对人类健康没有直接或潜在的不良影响，而食品 数量安全的意义似乎已“退居二线”。食品安全内涵包括“食物量的安全”和“食物质的安全” 两个方面，现在后一个含义的突出和前一个含义的弱化，反映了我国在基本解决食物量的安全的 同时，食物质的安全越来越引起全社会的关注。 近年来，随着国际上食品安全事件的频繁发生，许多国家加大了对食品安全研究的人财物投 入。而我国食品安全研究工作目前缺乏系统规划和组织，科技成果和技术储备不足，不能很好地 对与食品安全技术有关的法规、标准制( 修) 订提供科学依据。该课题研究为肉制品安全性的研 究提供一定的依据与方法。 食品安全性的子课题包括了危害分析、h a c c p 体系、预测微生物学等，其中预测微生物学 的研究还未在我国系统地开展，目前将模型建立到三级基础，具备代表性的是英国农业、渔业和 食品部( u km 阑开发的“f o o dm i c r o m o d e l ”以及美国微生物食品安全性研究机构( u s d a s m i c r o b i a lf o o ds a f e t yr e s e a r c hu n i 0 开发的应用软件“p a t h o g e nm o d e l i n gp r o g r a m p m p ” 1 3 1 。其 中就常规的肉类，比如新鲜鸡肉、猪肉、牛肉等建立了一系列预测模型【1 4 】。但是针对火腿这样的 传统发酵肉制品还未建立相关模型。所以无论是开发出新的模板，还是将原有模板应用到我国传 统发酵食品模型的建立，该课题都具有其深远的意义。 1 、为我国传统发酵肉食品建立生长预测模型 火腿外来添加物简单( 一般只包括盐) 与仅就储藏期建立模型是建模相对可行的依据。而霉 菌作为火腿中摄有优势的菌群之一，其中可能存在的产毒素真菌对火腿安全性的影响是建立生眭 预测模型的原因。霉菌的存在利弊皆有，该课题通过对验证有效的生长预测模型模拟霉菌中优势 菌在发酵过程中的数量，这样可以大量节约试验时间及成本。 2 、借助微生物生长预测模型辅助风险评估 一项完整的风险评估报告，需要消耗大量的时间、人力物力和财力，如果借助验证有效的模 ? 弘来辅助风险评估可以有效解决这个问题。 一6 。4 收业凡掌坝l 。学位隆文 粥啦绡论 3 、就金华火腿微生物卫生标准建立提供参考依据 随着人们对食晶质量、安全卫生及品控意识的觉醒，未米必然对火腿标准进行合理细分，科 学修正且适合实际运用，目的在于满足高质量产品的生产。但是其中霉菌利弊与否需要经过详细 的风险评估才能判定，卫生标准建立时机尚且不成熟，该研究就霉菌中产毒霉菌建立预测模型， 并提出风险评估内容，对于该标准的建立提供一定的理论参考依据。 7 目农、l k 人学_ ( ! ；! l 学位论文 第一带 盒卜火心r i - 微生物i z j 腓研究及优势 譬阳的分离筘定 第二章 金华火腿中微生物菌群研究及优势霉菌的分离鉴定 2 ，1 引言 单独考虑霉菌数量问题。一方面，火腿尽量减少微生物的要求与依靠传统自然发酵( 自然发 酵会给很多杂菌、病原菌带来更多机会) 来实现火腿特殊风味或提高防腐、抗氧化作用的要求发 生矛盾；另一方面，不考虑数量多的危害，其中产毒霉菌存在会带来不安全性。如何解决这个矛 盾，针对安全性有威胁的产毒霉菌进行研究，更适合该类产品特征。 金华火腿菌群构相研究及优势霉菌的分离鉴定目的是为分析弗确定预测模型中的目的微生 物。 2 2 材料与方法 2 2 1 火腿中微生物菌群构相基本研究 采自超市不同产地，不同生产厂家的八种金华火腿自然块( 火腿保质期均为5 6 个月，采 集样本日期均小于出厂期1 5d ) ，无菌操作，分别取5 9 样品，加入预先灭菌的1 蛋白胨水4 5 i i l l 中。 总菌落用营养琼脂培养基( 北京奥博星生物技术责任有限责任公司) 于2 3d 后计数，乳酸 菌用m r s 培养基( l a c t o b a c i l l u s b o u i l l o nn a e h d e m a n ，c a t n o 1 1 0 6 6 1 ，m e r c k ，, g e r m a n y , 用前按 照0 1 比例加入n a t a m y c i n ) 于3 4d 后计数；肠道菌群用紫红胆汁葡萄糖琼脂培养基 w r b g v i o l e tr e d b i l eg l u c o s e a g a r , c m4 8 5 ，o x o i d ，e n g l a n d ，平板倒好后，再在其上覆盖薄薄一 层培养基，以便模拟厌氧环境) 于2 4 - - 3 6h 后计数：以上菌群均取l m l ，3 0 ( 2f 平板培养。 厌氧菌用硫乙醇酸盐琼脂【1 5 】( 平板上覆盖一层) ，于9 6h 后计数，3 7 1 2 下，厌氧环境中平板 培养；嗜冷菌用t s 培养基【1 5 l ，于1 0 ( 2 下，1 0d 后计数；霉菌用马铃薯葡萄糖琼脂培养基( p o t a t o d e x t r o s ea g a r , p d a ) ，稀释液取0 2m l ，用涂布法接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基琼脂平板上于 2 8 c 培养3 5d 计数；革兰氏阴性菌培养【1 _ 5 1 取0 1m l 涂布于营养琼脂平板，然后覆盖一层紫红 胆汁培养基( m r b a - v i o l e tr e db i l ea g a r , c a t n o 1 a ) 1 4 0 6 ，o x o i d ，e n g l a n d ) 3 0 c 培养2d 后计数； 以上计数方法均以三个平板均值! 标准差表示。 2 2 2 火腿中优势霉菌的分离与鉴定 2 2 2 1 霉菌的分离 上述马铃薯葡萄糖琼脂培养基菌落长出后5d 7d ，从中选出氏势良好，形态各异的单个菌 落，进行划线接种到高盐察氏培养基( h i g h - s a l t c z a p e k a g a r ，北京奥博星生物技术责任有限责任 公司) 上培养5 1 0d ，得到比较纯化的菌种，但并非挑选的都为纯种菌，为了保证鉴定结果准 + 8 一 中i q 农业人学坝| 学位i 仑义 第二章 会。芦火j j i ! i - p 微牛物l 直群研冗及优讣街荫的分离特定 确性，必要时可反复进行平扳划线，直到晟终获得纯化菌种。 2 2 2 2 霉菌的鉴定 1 、点植培养法 从得到纯化菌种的平板上挑取单个孢子或菌落，点植培养于高盐察氏培养基上，方式为点植 于等边三角形三个顶点处，倒置于2 8 的恒温箱中进行培养。 2 、斜面插片法 无菌操作，打开经点植培养的平皿( 菌落已稍稍形成) ，在己初步形成菌落周围已凝固的高 盐察氏培养基上，用小刀划出两条长方形小槽。长度以能够插入盏玻片为准，宽度取l c m ，取出 划去的培养基，在小槽中插入2 - 3 片盖玻片，将此培养皿放入2 8 = c 培养箱中，7 4 1 4d 观察。待 菌丝附着在盖玻片上时，取出，于显微镜下观察。 3 、直接观察法 鉴定之前直接制片，在载玻片上滴加一滴乳酸一苯酚溶液接种针挑取菌落小片，平摊于 玻片上，加盖盏玻片镜检。 表2 - 1 乳酸苯酚溶液配制 ! ! ! ! ；：! 塾! ! ! ! 鳃! ：盟! 型! 驾! i 缝璺! ! 熬坦! 鲤! ! ! 1 2 1 成分 用量 也可将平板直接放置在显微镜下于不同时间进行观察，采取以上所有方法，反复对比宏观及 微观结果，根据有关的真菌鉴定手册伯氏鉴定手册、常见常用真菌、( n t r o d u c t i o nt of o o da n d a i r b o r n ef u n g i 进行鉴定。 2 2 2 _ 3 优势霉菌属的进一步鉴定 将经过上述鉴定到属的不同纯化霉菌苗种编号，并对在分离步骤处得到的平板且已编号的形 态不同的菌分别计数。对照鉴定结果，即可获得火腿中各己鉴定到属的霉菌数量，确定霉菌菌种 数量优势性，并做1 0 d 为周期的检测，确定出数量最有优势且检出率稳定的菌种，绘出其在发酵 火腿中生长曲线。鉴定到种的原则为按霉菌数量优势性逐次筛选，直到该霉菌为产毒素霉菌，则 确定该霉菌为建模目的微生物。 1 、形态特征 采用宏观菌落形态观察和以上2 2 2 2 章节所提到霉菌鉴定法结合，更严格观察苗落在培养基 中的颜色、菌落形成是否规则，菌落大小，菌丝体是否发达。微观镜检到的孢子形状、菌丝体有 否横隔膜，孢子梗形态等。 q 一 “l 农业人! # 坝0 学位论文 筇二喾 盒# 火心c 般生物荫徘研究及优坍曜黹的分离特定 2 、培养特征 将该霉菌属接种在不同霉菌培养基中，观察其在不同培养基中的培养特性。 以上为霉菌属进一步鉴定到种的方法，在鉴定过程中，通过以上方法，如果依据常见常用 真菌手册或 i n t r o d u c t i o nt of o o da n da i r b o m ef u n g i ) ) 已经有足够证据可以鉴定到种，则以 后的生理生化试验、电镜扫描孢子、包子梗、菌丝体图片，d n a 狈4 序等鉴定步骤可省略。 2 3 结果与讨论 2 3 1 结果 2 3 1 1 火腿中微生物菌群构相基本分布 发酵火腿中微生物经过培养得到的总菌落、霉菌、革兰氏阴性菌、乳酸菌、厌氧菌、嗜冷菌 及肠道菌群见表2 2 。 表2 - 2 金华火腿中微生物构相基本分布 t a b l e2 - 2m i c r o f l o r ai nj i n h u ah a m 样品微生 物l o g ( c f u g ) ( n o j总菌落 霉菌乳酸菌革兰氏阴肠道嗜冷菌 厌氧茵 性菌菌群 i2 5 1 - + 0 8 9 1 9 1 _ + 1 4 31 1 8 _ + 0 9 11 0 0 - 0 0 0 1 3 0 - 0 0 0l1 1 125 6 _ + 1 6 7 2 1 9 - + 1 0 21 2 4 - + 0 7 3 1 6 5 _ + 0 7 9l 11 i i i2 3 8 _ + 1 1 32 0 1 _ + 1 4 11 6 4 1 2 5 1 6 1 _ + 1 1 21 1 1 i v 2 5 4 - + 1 5 22 3 1 _ + 0 6 41 1 2 + _ 1 1 11 7 4 - 1 2 11 1 1 v 2 4 7 + 0 8 42 1 9 _ + 1 3 52 0 1 - + 1 1 2 】5 6 + 1 0 l 1( 1( 1 v l2 6 1 - + 1 3 82 弭0 8 71 6 5 + _ 08 1 17 5 如6 21 1 1 v i i 2 7 6 0 6 72 ，4 8 - + 0 7 42 1 1 + - 0 7 11 4 0 _ + 0 a 61 0 0 - + 0 0 01 1 v i i i2 4 5 - - 1 - 2 11 9 5 - - 0 5 41 , 7 8 _ + 0 5 7 1 4 7 + _ 0 4 3 11l 备注：1 、咀上数据均为样品从超市取回后第一次测定值 表2 - 2 表明金华火腿卜v i i i 样中菌群分布，同时表明火腿中霉菌为主要菌群，霉菌为嗜温好 氧菌，数量为总菌落的0 5 倍左右，乳酸菌、革兰氏阴性菌次之。嗜冷菌和厌氧菌在金华火腿中 未检出，肠道菌群数量甚微，检出率不稳定，且只有两个样中检出。原因为该金华火腿自然块中 检测到的n a c l 含量达到7 8 ，而肠道菌群不适宜于高盐环境下生长。 2 r 3 1 2 霉菌鉴定结果 1 、霉菌的鉴定 根据菌落宏观形态观察和显微镜检结果分析，得到的霉菌属一共8 种，其中5 种为曲霉属， 2 种为青霉属，1 种为根霉属。所有样品的青霉、曲霉和根霉数量统计结果见表2 3 。 1 0 巾m 农业凡学坝i 。学位论文 笫一尊 会华火腿中微生物苗群研究及优势露荫的分离浆定 表2 - 3 火腿中霉菌分离鉴定结果 t a b l e2 - 3i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no im o u l di nh a m 根据火腿最佳储藏温度、超市最低储藏温度、霉菌产毒素条件及霉菌生长最佳温度等条件， 选取4 、1 0 、2 0 、2 8 、3 0 五个温度作为建模的温度点。 观察样品i 在不同温度储藏期曲霉和青霉变化情况可知( 见图2 - 1 、图2 - 2 ) ，随着温度升高， 霉菌繁殖较快，且曲霉数量大多优于青霉。青霉数量总体呈现上升趋势，且生长较快，而曲霉则 相对缓慢，生长曲线平稳。o 4 0d ，2 8 和3 0 条件下，青霉相对曲霉无竞争优势，3 0 1 2 ，6 0d 后，曲霉生长有呈现进入衰退期趋势。青霉与曲霉在1 0 ( 2 和加条件下，生长速度均缓慢，而 在2 8 和3 0 条件下，3 0 4 0d 之间数量上升较快。可见，实验温度范围内，3 0 c 对霉菌繁殖 相对较适宜。 8 7 言6 季5 霎。 墓s 鞫 箍2 l o 01 02 03 04 05 06 07 0 时间( 由 p 3 0 - - - o - - - 2 8 2 0 - - x 一1 0 p 4