利用小随体多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株.doc

第一学习小组 段志峰 朱江 邢英超刁文涛 冯延宾 张熠唐亦辰 黄云 何骁男利用微卫星多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株摘要我们提出了一种利用多重PCR对微卫星位点多态性分析快速鉴别酿酒酵母菌种的方法。无需使用苯酚，简单提取DNA，利用多重PCR扩增SC8132X, YOR267C 和SCPTSY7位点，用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行带型分析，这种方法可使我们区分30种商用葡萄酒酿酒菌种。该方法被成功应用于一项在15和20摄氏度这两个发酵温度下检验两个菌株间的显性关系的生态学研究中。这种方法在酿酒和酵母生产工业中常规的低成本检测酵母菌株的过程中应该有应用价值。关键词：微卫星，PCR，酵母菌株，葡萄酒，发酵1.前言使用选育出的用于酒精发酵的酵母菌株酿造葡萄酒是现在普遍使用的一种方法。酵母对葡萄酒的质量尤其是口味有很大的影响（现代的酿酒学家发现用不同的酵母菌株发酵可以使葡萄酒产生不同的特点。这导致了具有多种特色并可以应用于不同领域的选育菌株工业生产化。现在市场上提供了几百种葡萄酒菌种，它们几乎都属于酿酒酵母菌属。与此同时，人们对发明快速而且精确检测酵母菌株的方法也产生了兴趣。在葡萄酒酿造中，它的应用包括确定接种菌株对在未发酵葡萄汁中野生菌株的显性优势，实时记录发酵中的菌株动态过程，控制菌株生产的质量并鉴别无效菌株。酿酒时，选育出的菌株被接种于富含野生酿酒酵母和非酿酒酵母的葡萄汁中。快速鉴别酵母菌株的方法应该考虑到菌群生长动态的观察，选育菌株的显性优势和环境因素对酵母菌株的影响。在葡萄酒发酵，温度是影响酵母动力学的一个主要因素（Fleet and Heard,1993）;生态研究也显示出了酿酒酵母菌株的不同行为。(Epifanio et al., 1999; Torijaet al., 2003).事实上，酿酒商要求菌株的一个突出特点是能够在特定的温度下进行良好的发酵反应。很多时候，在一个典型的发酵白葡萄，发酵温度应保持18摄氏度，但达到12-15 摄氏度也不少见，从而提高调味品酯的含量并减少高酒精形成。在此温度下，经常会发生发酵停滞，因此，在这种状况下，选育菌种的低温代谢能力和对野生菌种的显性优势备受重视。 在过去的几年中，研究侧重于用分子生物学方法进行菌株分化（Beh et al., 2006） ，如染色体分析法（Carle and Olson,1985; Blondin and Vezinhet, 1988）和限制性片段长度多态性（ RFLP ）分析mDNA （Querolet al., 1992） ，以及基于PCR的方法，其中包括内部转录序列（ ITS ）的核糖体DNA 测序（Montrocher et al., 1998） ，元件插入位点的多态性（Cameron et al., 1979;Ness et al., 1993） ，扩增片段长度多态性（ AFLP ）的（De Barros Lopes et al., 1999） ，随机扩增多态性DNA （ RAPD ） （Baleiras-Couto et al., 1996） ， 内含子剪接序列扩增（De Barros Lopeset al., 1996）及PCR内含的线粒体基因（Lo pez et al., 2003） 。这些方法在关于分辨率和处理时间方面对经典生理学实验起到了增强作用，但是其中一些方法还有些限制条件，因为它们几乎不能应用于日常的分析中，或者当它们容易实施时，它们并不能在菌种水平上完全区分这些菌株。此外，在一些方法中，如元件分型和RAPD，其重现性取决于DNA模板的纯度和浓度。(Ferna ndez-Espinar et al., 2001; Beh et al., 2006)。这些缺点意味着花费大量时间和资金进行DNA清理步骤，在某些情况下还需要几步反应，以评估非重复性带型发生的可能性。基于具有长度多态性的简单序列重复基因位点分散在整个基因组中，微卫星分析已成功地被用来区分酵母菌株（Field and Wills, 1998;Gonzalez Techera et al., 2001; Perez et al., 2001;Hennequin et al., 2001; Malgoire et al., 2005）。最近，利用对具高度多态性的微卫星位点的多重PCR方法可以分离一系列商用酵母菌株 (Schuller et al., 2004;Bradbury et al., 2005; Legras et al., 2005)。微卫星位点PCR高辨别能力以及其稳定性和实用性使其成为区分酵母菌种最受欢迎的方法之一。这个方法用于常规检测的瓶颈发生在扩增子分析的步骤：利用聚丙烯酰胺凝胶及测序分析仪确定扩增子的大小较为费时费力。为了避免这个限制，有人提出利用简单的高张力琼脂糖凝胶电泳（Routman and Cheverud, 1994;Ferraro et al., 1998) 。最近，Howell 等人（2004）建议利用对SC8132X 位点的PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶加EB染色电泳来进行酿酒酵母的分型。为了建立一种快速精确并且甚至适用于那些低预算高通量实验室的鉴别菌种的方法，我们对3个高多态性微卫星位点的多重扩增（Gonzalez Techera et al., 2001），然后用琼脂糖凝胶电泳进行带型分析。作为第一步，我们对一组29种商用酵母菌株进行测试，另加一酿酒酵母菌株作为参考，以检查该方法的鉴别能力。然后，我们在测试发酵温度对共接种的两个选育菌株的生长速率和竞争能力的影响的实验中检查了这种方法的实际适用性。2.材料与方法2.1酵母菌株和培养基酿酒酵母菌株采购于酿酒酵母生产商。酿酒酵母菌株见表1。酵母菌模式菌株（CBS 1171）从CRA-Istituto Sperimentale per lEnologia of Asti, Italy (ISE)的收集品中获得。商用干菌株悬浮于无菌5%的蔗糖液体培养基中，40摄氏度下放置30分钟，稀释，然后涂布于YMA平板(10g/L葡萄糖, 5g/L蛋白胨, 3g/L酵母浸出物, 3g /L 麦芽膏和20g/ L琼脂),然后在24摄氏度下培养48小时。2.2 DNA抽提 在第一步检验这种方法的鉴别能力时，我们用Harju等人（2004）的方法抽提DNA。简单的说，将单个菌落重悬浮于200ml的lysis buffer(2% (w/v) TritonX-100, 1% (w/v) SDS, 100 mmol L_1 NaCl, 10 mmol L_1TrisHCl pH 8.0, 1 mmol L_1 EDTA pH 8.0)中。这些试管放置于-80度冰箱中3分钟（直到完全冻住），然后在 95摄氏度下于Thermomixer（Eppendorf AG, Hamburg, Germany）中放置一分钟（不要振荡）使它们快速溶化。重复上述过程，然后以最大速度旋转试管30秒。向试管中加入200ml氯仿冰浴，然后振荡试管2分钟，20，000g ，5摄氏度的条件下离心5分钟。取上清液与另一试管中加入400ml冰的纯乙醇，20摄氏度下静置沉淀10分钟，然后在20，000g ，5摄氏度下离心10分钟。去上清，DNA沉淀用0.5mL 70% (v/v)乙醇纯化，45摄氏度下真空干燥。得到的DNA溶于15mlTE (10 mmol L_1 Tris, 1 mmol L_1 EDTA, pH 8.0)。第二步检验该方法适用性的过程中，用微量加样吸头直接从单菌落中提取菌体直接悬浮于事先加好PCR混合物的0.2ml孔中。2.3 .PCR与电泳三个微卫星位点，SC8132X,YOR267C和SCPTSY7被使用是由于他们具有高度的多态性。扩增是依赖于几对特异性的顺式与反式的引物进行的（见表二）SC8132X位点的引物与YOR267C位点的顺式引物是由Field和Wills所设计的，YOR267C位点的反式引物是由Gonzalez Techera et al制作的，而SCPTSY7位点的顺式引物是由Perez et al制作的。SCPTSY7位点的反式引物是由我们使用免费软件Primer 3所设计的，目的是使其产生几个电泳带具有明显位置区别的扩增子而不与其他两个位点重叠。PCR扩增是进行在一个具有20微升体积液体的Biorad MyCycler热力周期仪中。20微升液体是有以下部分组成的：1微升DNA的萃取溶液（包含20-40ng DNA），3.1mmol/L浓度的MgCl2，0.4mmol/L浓度的各种dNTP,2微升去镁的PCR缓冲液，2个单位Taq DNA聚合酶，SCYOR267C位点引物各10pmol，SC8132X位点引物各15pmol以及SCPTSY7位点的引物各40pmol。PCR反应组分各成分的浓度被设计得尽量减小非特异性扩增。在发酵实验中，反应体系的体积为10微升，试剂组分与所占比例与上述反应体系相同，这样做可以节省Taq聚合酶与其他昂贵的试剂。为了优化对三个位点的多元化扩增，方案如下：94保持4分钟，以a.94保持30秒;b.56保持45秒;c.72保持30秒为一个周期，重复28个周期，最后以72保持10分钟处理。将产物在尺寸为15*10cm2浓度为2.5%（w/v）的琼脂糖凝胶上，浸于TBE缓冲液中，在100V条件下电泳80分钟，凝胶将被溴化乙錠所染色。当使用聚丙烯酰胺凝胶电泳时，应使用预制的8.6*6.8cm210%(w/v)的TBE凝胶，在100V条件下电泳60分钟。Marker应使用标记分子量为100-20bp的Sigma低阶marker。电泳分布情况被集群分析软件处理，该软件使用一种类似于二进制的指标，它使用UPGMA的方式创建系统树图。同表象相关性将被用于探知由Rossetti和Giraffa描述的确定的与非确定的聚类。同表项相关性的百分比在各个分支中给出。2.4.该方法的可重复性与微卫星标记的稳定性通过对每个菌株取五份菌落DNA萃取液进行扩增来检测可重复性，对扩增产物的分析是将其分为五个不同孔道进行琼脂糖电泳而进行的。为了检验微卫星标记在酒精发酵中的稳定性，检验是在随意挑选的三个菌株中进行的：菌株2，菌株3和菌株5。再水化后，每个菌株被单独接种在盛有灭菌葡萄汁的500ml烧瓶中。在16的条件下发酵20天。表二 用于扩增的三株啤酒酵母微卫星位点引物分析在十组随意选出的菌落中进行，这些菌落取自发酵开始时和结束时的每个菌株。2.5.发酵两株酵母菌株，DSM Cepage Chardonnay和Vitilevure DV10被选中进行发酵试验，因为他们具有相似的用途与特征（用于白葡萄发酵，醇耐受性和表型杀伤性相似），就像制造者说的一样。Vitilevure DV10是耐冷的。灭菌的葡萄汁被用于培养基。它包含浓度均为150mg/L的硫酸铵和磷酸铵作为发酵氮源。浓度为200g/L的蔗糖被加入作为糖源。发酵开始时将1.6L灭菌的葡萄汁加入到容积为2L的带有磁力搅拌器的锥形烧瓶中。这个仪器以一个有孔的橡皮塞封口，有一根以棉线固定的巴斯德吸管插在孔中。以单菌株涂平板，再挑出单菌落以多元的PCR分析方法检测它们的同一性。然后将相同的菌落悬浮培养于预配的培养基中，该培养基由灭菌的葡萄汁组成，可以提供氮源但无糖源。在20下进行每分钟震动100次的好氧生长后，形成混合的接种物，每个菌株都具有均一的浓度，为5*105个细胞/L。由浓度为1*106个细胞/L的单菌株形成的接种物用来检测每种菌株完成发酵的能力。发酵温度被控制在15-20之间，并且设有条件相同的对照组。样本被取于每个菌株发酵过程中的的相同时间，这几个时间点分别为：发酵开始时（接种后的十分钟），葡萄汁中残余60%糖分时，葡萄汁中残余30%糖分时以及发酵结束时（2g/L）。发酵过程中糖分浓度是由高性能液体色谱检测的，使用一根OAKC聚乙烯圆柱棒与一个折光指数检测器。将样品稀释并涂布于YMA平板培养基上。在25下培养48小时后，将含有菌落数为150-200的菌落随机挑选进行PCR分析。在每个时间点，每个菌落分析48-60个菌落。总共900个菌落被检测。3.结果3.1 酵母菌菌株分类 图.1为琼脂糖凝胶电泳结果。对于每一菌株，除了最明显的一条电泳带外，还观察到好几条模糊的带，可能是因为非特异性扩增。将单一引物扩增的带形图和多引物扩增带形图比较发现19和30（菌株）的电泳图中有大量的这些带。图2中，这些微弱的带同样出现在由单一引物进行扩增的带形图中，说明不是由3个位点的引物的交互作用引起的，尽管这些带是可复制的，但是它们并不被认为有基因多态性价值。各片断在数量和大小上的差异已被发现。对于1、3、4、6、8、10、11、15、20、24和25这些菌株，仅有3条比较明显的带出现，然而大部分菌株显示，电泳图中每个位点出现3到9条带而不是1到3条带。带形图的电脑分析显示，在所有的菌株里面，3与7、18与29、8与20、14与16有80%以上相似，仅在带宽上有很小的差异，同时2与9、4与11菌有100%的相似度。所有有80%以上相似度的组群导致可靠的100%同表象相关。为了核实这些结果，将PCR得到的产物的10%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果和琼脂糖凝胶电泳结果进行比较（图.4）。电泳结果（图.4b）显示：18与29、8与20、14与16展现出在电泳带数量和位置方面的清晰而有价值的差异。3与7、4与8的结果非常相似，但是，可通过用SCPTSY7引物对3于7进行扩增产生的扩增子和用SCPTSY7与SC8132X引物对4与7进行扩增产生的扩增子进行区别。最后，DSM Fermivin（菌株 2）和Laffort Zymaflore ST（菌株 9）在所有的电泳分析中显示相同的结果。在重复实验中，对任一菌株的五个重复试验结果显示出相同的带形图，用Bionumerics软件分析各片断大小与平均值的标准偏差不超过1.5%（图.3），达到100%匹配。在发酵开始和结束时对3个所挑选菌株的扩增，产生相同的轮廓，说明在发酵过程中微卫星标记是稳定的。3.2 发酵在发酵试验中，通过对采集和重悬的细胞群落直接进行PCR与用冷冻萃取法提取DNA后扩增所得到的带形没有差别。得到的带都很清晰，而且所用的两个菌株的差别很明显。蛋白质和细胞组分干扰信号会很快地消失，不会影响到DNA的迁移。由两个菌株发酵试验所得到的结果如图.6所示。在15试验中，菌株5再发酵中很快占据优势；当30%的糖分被消耗后，该菌株在整个菌群中的百分比达到70%，在发酵结束时，菌株3已基本消失（图.6a）。在20发酵中（图.6b）两个菌株的行为是不同的。在实验上半过程中，他们互具优势，而在以后的发酵过程中菌株5的数量增加。当糖分全部消耗后，菌株5再整个菌群中占的比例达到85%-90% 。4、讨论虽然允许对扩增子的精确测定的分析序列，仍然是菌株的微指令卫星分型的参考标准，但昂贵的成本和有限的产量是它在酒类研究领域中得以日常应用的障碍。我们基于对由多元PCR产生的样本的分析而提出的方法是有辨识力和分析及成本的时间需要两者的好的折中。我们能够区分30种大量生产的检测过的菌株其中的29种，那种与琼脂糖电泳相似的菌株可以进一步分析和被聚丙烯酰胺预制的凝胶体区别。只有2种DSM Fermivin和Laffort Zymaflore ST,是琼脂糖和聚丙烯酰胺预制的凝胶体均不能加以区分的。最近，利用17多形态标记对以上2种菌株的遗传分析显示，它们仅在第4位点有轻微的不同（包括SC8132X）。SC8132X位点表明，在这个研究中，DSM Fermivin的1个等位基因和Laffort Zymaflore ST的2个等位基因在47bp被识别。这个重要的区别应该被琼脂糖和聚丙烯酰胺预制的凝胶体二者之一区别。然而，我们的分析，表明2种菌株总体上在扩增子的数量及大小SC8132X扩增中区别很小。这个争论可能因为在许多不同酵母生产过程中的变异而引起的一个小的遗传差异。令1个假设是酵母生产者在不同的市场上用了同1个商业名称出售2种酵母菌株。有趣的是，一些菌株给出了很多强烈的带。当每个位点的带的数目多于1个时，这可能是因为倍数染色体位点杂合现象、在挑选的葡萄酒酵母中普通的多倍体的或非整倍体的菌株。(Bakalinsky andSnow, 1990; Hennequin et al., 2001; Bradbury et al., 2005); 从对生物直接PCR而得的结果证明了此法的简单与活力，此外，给DNA提取设旁路的可能逐步缩短了加工时间和琼脂糖的使用，这有益于安全和费用。在酵