（材料科学与工程专业论文）促内皮化等离子体聚合薄膜的制备及生物学评价.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第l 页 ，摘要 近年来，医用不锈钢材料被广泛的应用于心血管植介入器械。然而当其 与血液接触时，在界面上会形成一系列的复杂的相互作用，导致凝血反应和 血栓的形成。生物材料表面覆盖内皮细胞层是改善材料血液相容性的理想方 法，但直接把内皮细胞种植在医用不锈钢材料表面不仅增殖速度慢，而且内 皮细胞在短的时间内就容易脱落分离。因此如何通过表面处理，在医用不锈 钢表面形成一定浓度的反应性官能团，并通过官能团有效的固定促内皮化生 物分子明胶来构建具有促内皮化功能的材料表面，从而提高医用不锈钢材料 表面的生物相容性成为研究的重点。 本文采用等离子体聚合沉积方法，通过调控脉冲占空比和放电功率，以 烯丙胺和丙烯酸为反应单体在医用不锈钢表面合成含有伯胺基和羧基的聚合 薄膜，并以伯胺基和羧基为反应的位点在聚合薄膜表面固定了明胶分子。衰 减全反射傅立叶红外光谱( a t r f t i r ) 和x 射线光电子能谱( x p s ) 的分析结 果表明两种聚合薄膜表面分别含有伯胺基团和羧基官能团，相对含量分别达 到最大值2 1 6 ( n h 2 c ) 和7 2 2 ( c o o h c ) ；原子力显微镜照片表明等离 子体聚烯丙胺薄膜都表现为连续、无针孔的致密薄膜；等离子体聚合沉积的 聚丙烯酸薄膜在水中具有较好的动态稳定性；明胶分子固定的聚烯丙胺和聚 丙烯酸薄膜的a t r - f t i r 图谱中出现了酰胺i 和酰胺峰；明胶分子固定的 聚丙烯酸薄膜的x p s 全谱中出现了n l s 吸收峰，且明胶分子固定的聚烯丙胺 和聚丙烯酸薄膜表面的c l s 谱出现了酰胺键的结合能2 8 8 2 e v ，这表明且明胶 分子有效地固定到了聚合薄膜表面，静态接触角测试结果表明固定了明胶分 子的聚合薄膜表现出较好的亲水性。 体外内皮细胞粘附实验及a l a m a rb l u e 评价结果表明固定了明胶分子的 聚合薄膜均表现出良好的内皮细胞粘附性能，且内皮细胞表现出更高活性。 明胶分子固定的脉冲射频等离子体聚烯丙胺薄膜表面的内皮细胞粘附率为 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 i 页 8 5 7 3 ，高于连续波射频等离子体聚烯丙胺薄膜表面皮细胞粘附率8 2 7 3 ， 这可能是由于脉冲射频等离子体聚合能在薄膜表面能保持更高的胺基浓度， 从而使薄膜表面固定的明胶分子浓度更高。通过制备两种脉冲占空比( 5 0 和7 5 ) 的等离子体聚丙烯酸薄膜p p p a a 1 和p p p a a 2 并分别固定明胶分 子，体外体外内皮细胞粘附实验及a l a m a rb l u e 评价均表明低占空比下合成的 聚丙烯酸薄膜固定明胶分子后表面内皮细胞粘附能力更强，7 2 h 在其表面粘附 的细胞增长率为4 1 9 。这可能是由于低占空比下射频等离子体聚合薄膜表 面具有更高的羧基浓度，从而具有更高浓度的明胶分子固定。 关键词：医用不锈钢，等离子体聚合，烯丙胺，丙烯酸，固定明胶，细胞相 容性 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 | l 页 a b s t r a c t m e d i c a ls t a i n l e s ss t e e li s w i d e l y u s e da sc l i n i c a l i m p l a n t a b l e a n d i n t e r v e n t i o n a l d e v i c e s h o w e v e r , o n c e b l o o dc o n t a c tw i t h b i o m a t e r i a l s ， c o m p l i c a t e di n t e r a c t i o nw i l lh a p p e no nt h ei n t e r f a c es oa st of o r mc o a g u l a t i n g r e a c t i o na n dt h r o m b u s i ti sb e l i e v e dt h a tt h ee n d o t h e l i a l i z a t i o no ft h eb l o o d c o n t a c t i n g d e v i c e s u r f a c e m a y o v e r c o m et h e p r o b l e m b i o m o l e c u l e i m m o b i l i z a t i o no nt h em a t e r i a ls u r f a c em a yb ea ni m p o r t a n tm e t h o dt oi m p r o v e t h ee n d o t h e l i a l i z a t i o n t h e r ea r ef e wf u n c t i o n a lg r o u p so nt h es u r f a c eo f m e d i c a l s t a i n l e s s s t e e l s ，s oh o wt og e t r e a c t i v e f u n c t i o n a l g r o u p s a n di m m o b i l i z e b i o m o l e c u l e so nt h es u r f a c eo f m e d i c a ls t a i n l e s ss t e e l sb e c o m ec h a l l e n g i n g i nt h i sp a p e r , t h ep o l y a l l y l a m i n ef i l m sc o n t a i n i n gp r i m a r ya m i n eg r o u p sa n d p o l y m e r i z e da c r y l i ca c i d ( p p a a ) f i l m sc o n t a i n i n gc a r b o x y lg r o u p so nt h es u r f a c e o fm e d i c a ls t a i n l e s ss t e e l sw e r eo b t a i n e db yr a d i o f r e q u e n c y ( r f ) p l a s m a p o l y m e r i z a t i o nb yc o n t r o l l i n gt h ed u t yc y c l ea n dt h er f - p o w e r , a n dt h eg e l a t i n m o l e c u l ew a sf u r t h e rc o v a l e n t l yi m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo ft h ep o l y m e r i z e d f i l m s t h e _ 2a n d c o o hr e t e n t i o no ft h ec o a t i n g sw e r ei n v e s t i g a t e db yx p s ( x r a yp h o t o e l e c t r o ns p e c t r o s c o p y ) a n df t i r ( f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e d s p e c t r o s c o p y ) t h eh i g h e s tc o n t e n to fp r i m a r ya m i n e ( - n h 2 c ) w a s2 16 a n d c a r b o x y lg r o u p s ( - c o o r p c ) w a s7 2 2 a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) s h o w e d t h a tt h e p o l y a l l y l a m i n e f i l mi sc o n t i n u o u sa n dp i n h o l e f r e e t h e p l a s m a p o l y m e r i z e da c r y l i ca c i df i l mh a st h ed y n a m i cs t a b i l i t yi nw a t e r f t i ri n d i c a t e d t h e r ew e r et y p i c a lc h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o np e a k so fa m i d eia n da m i d e1 1w h i c h w e r ea s c r i b e dt ot h eg e l a t i n t h e r ei sn e wp e a ko fnlsi nt h es u r v e ys p e c t r ao f x p s ，w h i c hi sf r o mt h eg e l a t i n t h ea n a l y s i so ff t i ra n dx p sa l s os h o w e dt h a t t h eg e l a t i nm o l e c u l e sw e r ee f f e c t i v e l yi m m o b i l i z e do l lt h es u r f a c eo fp o l y m e r i z e d 西南交通大学硕士研究生学位论文第fv 页 f i l m s c o n t a c t i n ga n g l em e a s u r e m e n ti n d i c a t e dt h ep o l y m e r i z e df i l m si m m o b i l i z e d b yt h eg e l a t i nm o l e c u l ep r e s e n t e db e t t e rh y d r o p h i l i c i t ya n dh i g h e rs u r f a c ee n e r g y nv i t r oe n d o t h e l i a lc e l l ( e c ) a d h e s i o nt e s ta n da l a m a rb l u et e s ts h o w e dt h e p o l y m e f i z e df i l m si m m o b i l i z e db yt h eg e l a t i np r o m o t e de c sa d h e s i o na n dh a d b e t t e re ca c t i v i t y t h ec e l la t t a c h m e n tr a t i oo ft h ep u l s e dp l a s m ap o l y a l l y l a m i n e f i l m ( 8 5 7 3 ) w h i c hi m m o b i l i z e dg e l a t i nw a st h eh i g h e rt h a nt h a to ft h e c o n t i n u o u sp l a s m ap o l y a l l y l a m i n ef i l m ( 8 2 7 3 ) i ti sb e c a u s et h a tt h e r ew e r e m o r ea c t i v es i t e s 帆) o nt h es u r f a c eo ft h ep u l s e dp l a s m ap o l y a l l y l a m i n ef i l m s ， s ot h e d e n s i t yo ft h eg e l a t i nc h a i n si m m o b i l i z e do nt h et h ep u l s e dp l a s m a p o l y a l l y l a m i n ef i l m st h a nt h a to ft h ec o n t i n u o u sp l a s m ap o l y a l l y l a m i n ef i l m s t h e v i a b i l i t y o fe c si n c r e a s e da b o u t 41 9 a r e r7 2 hc u l t i v a t i o no nt h e g p - p p a a 一1 ( d u t yc y c l e5 0 ) t h a nt h eg p p p a a 一2 ( d u t yc y c l e7 5 ) t h er e a s o n m a yb et h a tt h e r ew a sm o r et h ea c t i v es i t e s ( - c o o n ) o nt h es u r f a c eo ft h e g - p - p p i a a 1t h a nt h eg - p p p a a 一2 s ot h e d e n s i t y o ft h e g e l a t i n c h a i n s i m m o b i l i z e do nt h eg - p p i 匕气a 1t h a nt h a to ft h eg - p p p a a 2 。 k e y w o r d s ：b i o m e d i c a ls t a i n l e s ss t e e l ，p l a s m ap o l y m e r i z a t i o n , a l l y l a m i n e ，a c r y l i c a c i d , g e l a t i ni m m o b i l i z e d , e n d o t h e l i a lc e l l ( e c ) c o m p a t i b i l i t y 西南交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权西南交通大学可以将本论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 1 保密口，在年解密后适用本授权书； 2 不保密d 使用本授权书。 ( 请在以上方框内打“4 ) 学位论文作者签名：王晦；l 芝 指导老师签名：也 醐咖只争加 醐：儿7 j 剀 西南交通大学学位论文创新性声明 本入郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工作 所得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 本论文的主要创新点如下： 1 、本文采用等离子体聚合沉积方法，通过调控脉冲占空比和放电功率， 以烯丙胺和丙烯酸为反应单体在医用不锈钢表面合成含有伯胺基和羧 基的聚合薄膜， 2 、本文进一步采用化学缩合方法，以等离子体聚合薄膜表面的n h 2 和 c o o h 为反应位点共价固定了具有促内皮化功能的生物分子明胶，实 现了金属材料表面促内皮化的结构设计。结合体外细胞粘附实验，系 统的评价结果表明，经过明胶固定后的等离子体聚合薄膜改性后的医 用不锈钢显示出优良的细胞相容性。 王海波 2 0 0 9 年5 月 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 第一章绪论 1 1 医用不锈钢材料及其在生物医学中的应用 用作生物医用材料的医用不锈钢，具有良好的耐腐蚀性能和综合力学性 能，且加工工艺简便，是医用金属材料中应用最多、最广的一类材料，主要 应用于矫形外科植入材料，如骨科的人工关节骨柄，骨折固定用的骨钉、骨 板；牙科的义齿种植体及矫形丝等；以及官腔内植入物如心脏外科介入治疗 用血管支架等，此外还可用于制作医疗器械和手术器械【l 】。 但由于金属本身所具有的血栓源性和耐腐蚀性差等缺点，使得不锈钢材 料的生物相容性不十分理想。因此如何提高金属材料的生物相容性的研究成 为医用金属材料领域研究的热点。大量临床应用结果显示，不锈钢人工心脏 瓣膜、血管支架植入人体后，材料表面均出现不同程度的血栓、平滑肌细胞增 生以及由此引发的其他不良症状。近年来，一些改性技术用来在3 1 6 l 医用不 锈钢表面生成各种涂层以改善其生物相容性。人们试图通过在材料表面引入 无机或高分子涂层，将金属材料优良的力学性能与无机、高分子材料的良好生 物相容性结合起来，以提高材料的综合性能【2 1 1 3 1 。 1 2 生物医用材料的表面修饰 1 2 1 生物医用材料表面修饰的意义 当生物材料于人体组织接触时，首先与周围组织和血液接触的是材料的表 面，因此材料表面的生物相容性就显得格外重要，生物材料区别与一般材料 的最重要性能是材料的生物相容性，而影响生物相容性的关键不是材料内部 的性能，而是材料表面的各种物理化学性能，故对此类表面有较高的要求， 它必须具有良好的生物相容性和抗凝血性等。但目前许多合成材料与细胞不 亲和、抗凝血能力差，而其最大不足是材料基质表面没有细胞可进行识别的 特定识别位点。因此对生物材料进行表面修饰，使其具有优异的生物相容性， 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 便成为生物材料表面工程面临的挑战，对材料进行表面修饰也是临床应用材 料开发的关键。 生物材料的表面修饰，目的是抑制非特异性相互作用，引入特异性相互 作用位点，使细胞在类似体内细胞外基质中发挥其功能。为了创造一个良好 的人工细胞外基质环境，达到细胞正常生长的需求，表面修饰后的生物应达 到如下要求【4 】： ( 1 ) 良好的生物相容性； ( 2 ) 良好的抗凝血性能 ( 3 ) 适宜的表面亲水一疏水平衡 ( 4 ) 较强的细胞特异性识别能力 1 2 2 表面修饰在生物材料中的应用及常用方法 1 生物活性表面的形成 随着医学科学技术的发展和对生物材料生物相容性的深入研究，对生物 材料的分子设计的基础越来越依赖于仿生学的原理，所以生物材料的表面修 饰也越来越倾向于利用生物大分子作为材料的表面修饰基团。当然利用已被 证明具有良好生物相容性的合成大分子进行材料的表面修饰也是目前生物材 料表面修饰的重要方向之一。 ( 1 ) 伪内膜的形成在抗凝血材料的抗凝血机制研究过程中发现，材料的 抗凝血性能与血浆蛋白、血小板、纤维蛋白、白细胞等血液成分在材料表所 形成的附着层有关。凝血现象的发生必须以激活凝血系统为前提，如果植入 材料后未引起凝血，而是在材料表面形成含有红细胞的纤维蛋白网，1 2 月 后分泌出纤维母细胞，数月后材料内壁形成与血管壁结构非常相似的稳定内 膜一一伪内膜。伪内膜相当于在材料的表面覆盖了一层类生物膜，此膜不会 引起凝血系统，是理想的抗凝血表面。 正常的血管内壁表面的内皮细胞层是维持血管表面不发生凝血的重要组 西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页 织，如果人工制备的材料也具有类似的结构形态，必然得到良好的抗凝血材 料，所以目前有大量的文献报道了在人工血管表面种植内皮细胞的内容。直 到目前为止，研究进展并不十分顺利，其关键的因素就是如何将内皮细胞牢 固地黏合在生物材料表面种植，培养内皮细胞，但是如何利用一般方法将内 皮黏附蛋白种植在材料表面，然后在其上种植、培养细胞。 ( 2 ) 生物大分子的覆盖或接枝利用适当的方法在材料表面涂敷或接枝生物 大分子，在材料表面形成生物大分子的覆盖层，是生物材料的有一个研究方 向，材料与血液接触时首先是血浆蛋白在材料表面的吸附，吸附层的组成与 构象是材料抗凝血性能的关键因素。目前，对材料表面进行分子生物学设计， 其方法主要是将一些有生理功能的物质如蛋白质、多肽、酶和细胞生长因子 等固定在材料表面，充当临近细胞、基质或可溶性因子的配基或受体，使表 面形成一个能与生物活体相适应的过渡层。此方法不会影响材料的本体性能， 可基本保持所固定的生物分子的活性，还可以设计材料表面改性区域，经改 性的生物材料可获得良好的生物相容性和多种优良的生物医学应用性能。据 研究证明【5 l 【6 1 【7 1 ，材料表面进行胶原，明胶和血清蛋白涂层后，材料的抗凝 血能力得到了提高。这是由于亲水性蛋白层的存在改善了材料表面的亲水性， 减少了血小板的吸附。 2 非生物活性表面处理非生物活性表面处理方法很多，下面介绍几种常见的 方法 ( 1 ) 氧化乙烯表面接枝聚氧化乙烯或聚氧化乙烷( p o l y e t h y l e n eo x i d e ， p e o ) 是具有( c h 2 c h 2 0 ) n 重复单元的大分子链，其末端基团可以是羟基， 也可能是甲氧基团。p e o 为高亲水性的非离子型聚合物，高分子材料表面若 赋有环氧化乙烯链段时，可有效的排斥其他高分子在材料表面的吸附，能够 抑制蛋白质和血小板在材料表面的吸附和黏连，较好地改善材料的生物相容 性。 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 ( 2 ) 化学气相沉积化学气相沉积主要被用来在金属材料表面引入一层有 机材料，它是将有机化合物的蒸气进行电离，然后使其在低温的金属表面沉 积聚合。利用化学气相沉积法将2 一氧环二甲二苯沉积于具有形状记忆功能的 金属材料n i t i n o l 表面，再用二氧化瘤等离子体处理，材料表面的血小板黏附 数量大大降低【8 1 。将苯环上带有胺基、羟甲基和酸酐等官能团的环二甲基二苯 气相沉积聚合于n i t i o n l 的表面，再利用表面的活性官能团，并采用二异氰酸 酯作为偶联剂，可将具有抗血形成功能的天然大分子水蛭素固定于材料表面， 改性后的材料表面的血栓形成时间延长数倍。以此种材料做成的管状动脉扩 张器，有望有效地预防冠状动脉扩张后的狭窄1 9 1 。 ( 3 ) 低温等离子体法 低温等离子体是以低气压放电产生的电离气体，其中蕴含着丰富的活性 粒子，可对材料表面进行镀膜、聚合、修饰和改性等处理。等离子体对材料 表面的处理方式很灵活，使用不同的气体挥发性化合物，可以获得更广泛的 表面化学组成，适用于血管内支架材料表面改性的需要。 利用等离子体技术处理后，材料表面会产生一定量的活性基团如过氧基 等，这些基团可引发单体在材料表面聚合，从而实现单体在材料表面的接枝。 低温等离子体对材料进行表面改性有如下优点： ( 1 ) 利用等离子体反应的特点赋予改性的表面各种优异的性能； ( 2 ) 表面改性层厚度极薄( 从几纳米到数百纳米) ，整体性质基本不变； ( 3 ) 可以制得超薄、均匀、连续和无孔的高功能薄膜，且该薄膜在基底 上有强的粘着力，便于各种底料的表面成膜。 因此被广泛用于生物材料的表面改性。目前常用的等离子体有0 2 、n h 3 、 n 2 等反应性气体以及带有特定官能团的单体。在这些等离子体的作用下，材 料表面的化学结构或组成发生变化，生成对细胞的黏附和生长具有促进作用 的基副1 0 】1 1 l 】。 西南交通大学硕士研究生学位论文第5 页 ( 4 ) 离子注入法 离子注入过程是将带电离子以高能射入到固体表面，在与固体内原子核 及核外电子云的相互作用中逐渐能力传递消失，同时在以离子经过的轨迹外 层一定半径范围内会使得固体中原有分子原子产生击发、电离等复杂行为， 引起表面化学成分和结构的变化。离子注入法有其自身的优点： ( 1 ) 在表面特定深度注入预定计量的高能离子，可定量控制，仅仅影响材 料表层性能，不会破坏材料本体性能； ( 2 ) 注入的离子渗入材料表层，与基体原子相混合，不会发生脱落现象。 利用离子注入技术可在金属表面生成与基体结合强度极好的表面膜，提高 表面的耐磨性和耐蚀性，还能使金属产生生物活性，使新骨直接沉积于金属 表面且中间无纤维结缔的隔层，制得生物活性金属。离子注入技术的引入也 可改善生物陶瓷材料的生物相容性和力学性能，从而受到了研究者的广泛关 注。 1 3 低温等离子体的性质及其应用 1 3 1 低温等离子体的基本性质 等离子体是在特定条件下使气( 汽) 体部分电离而产生的非凝聚体系。它 由中性的原子或分子，激发态的原子或分子、自由基、电子或负离子、正离子 以及辐射光子组成。体系内正负电荷数量相等，整个体系呈电中性。它有别 于固、液、气三态物质，被称作物质存在的第四态，是宇宙中绝大多数物质 的存在状态。 实验室中获得等离子体的方法有热电离法、激波法、光电离法、射线辐 照法以及直流、低频、射频、微波气体放电法等。根据温度可分为高温等离 子体和低温等离子体，当电子温度为1 0 5 - - 一1 0 8 k 时，成为高温等离子体，属 于热力学平衡或局部热力学平衡等离子体，在低压下通过射频放电获得的等 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 离子体，气体电离度一般为l o 击左右，即大约每1 , 0 0 0 ，0 0 0 个中性原子或分子 中含有一个带电粒子，带电粒子密度1 1 c 约为1 0 9 1 0 1 2 锄一，电子质量最轻， 其温度高达1 0 4 1 0 5 k ；离子、自由基、中性原子或分子等重粒子的温度接近 或略高于室温，这种电子温度和气体温度不等，气体温度保持常温的体系称 为低温等离子体。低温等离子体一方面具有足够高能量的活性物种是反应物 分子激发、电离或断键，另一方面不会使被处理材料烧解或烧蚀，在改性高 分子材料表面具有独特的应用价值。 辉光放电是一种稳定的自持放电，是低温等离子体化学领域中常用的放 电形式。由于辉光放电既可以提供反应活性种或作为化学反应的介质，又能 使体系保持非平衡状态，在很多应用领域辉光放电几乎是低温等离子体的同 义语。在气体放电中，根据外加电场的频率，气体的辉光放电又分为直流辉 光放电、低频辉光放电( 1 1 0 0 k h z ) 、高频或射频( 1 0 1 0 0 m h z ) 和微波放电 ( 超高1 g h z ) 等形式，直流辉光放电在等离子聚合时，电极上沉积有聚合物 或电极上有绝缘物都会影响放电的稳定性，所以在高聚物表面等离子处理和 等离子聚合反应中应用很少，微波辉光放电的能量高，常用于对金属和无机 材料的处理，射频放电可以增加电离，提高放电效率，在较高气压条件下仍 能维持稳定均匀的辉光放电，在等离子体聚合及高聚物表面等离子体处理中 有重要地位。 1 。3 ，2 低温等离子体表面改性 低温等离子体改性材料表面目前已广泛应用于电子、机械、纺织、航天、 印刷、环保和生物医学等领域。低温等离子体材料表面改性的方法大致可分 为三种情况： 1 等离子体表面刻蚀 刻蚀是更大程度上的等离子体作用，往往将材料表面弱边界大片除去， 是材料表面产生起伏，变粗糙，并有键的断裂，形成自由基。刻蚀对提高黏 西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页 附性、吸湿性等均有明显作用。 2 等离子体气相沉积 气相沉积可分为化学气相沉积和物理气相沉积两大类型，等离子体化学 气相沉积基本过程是将沉积机体放在反应室内，抽真空后通入运载气和反应 气的混合物，将基体加热到合适温度，则在基体表面发生反应，并形成镀层。 表面改性时有机膜常作为基底的覆盖层，赋予基底耐磨、耐腐蚀或导电等性 能；等离子体物理气相沉积有蒸发镀、溅射镀和离子镀三类，其基本过程都 包括物料进入气相、迁移到沉积基体表面和在基体表面成膜三个阶段。 3 等离子体表面接枝 稳定性问题是等离子体刻蚀所面临的主要问题，目前普遍认为接枝是解 决这一问题的有效手段，也就是将具有特定性能的单体接枝于被离子化了的 材料表面，使其具有相应的功能，一般工序有4 种：气相接枝；无氧液相接 枝；有氧接枝；一步接枝。 4 等离子体聚合 等离子体聚合是利用辉光放电把有机类单体等离子化，使其产生各类活 性种，再通过活性种之间或活性种与单体间的加成反应形成聚合薄膜。等离 子体聚合方法与常规的聚合方法相比，等离子体聚合制备的薄膜是连续、无 针孔和致密的，对基体的附着性好。等离子体聚合膜是具有高度交联的网状 结构【1 2 1 ，表现出很好的化学稳定性、热稳定性及力学性能【1 3 】，被人们广泛应 用于机械、电子、光学 1 4 , 1 5 , 1 6 , 1 7 以及生物医学材料 1 8 , 1 9 , 2 0 ，2 1 2 2 1 等各个领域。 然而目前采用的连续射频波等离子体聚合方式对单体结构破坏较大，所 得的聚合薄膜很难保留单体具有的官能团。脉冲射频等离子体聚合是在射频 波等离子体聚合方法上发展起来的新颖的聚合方式，它保留了射频波等离子 体聚合所具有技术优势一合成薄膜柔韧性好、厚度和形貌易调控，又增加了 新的功能一可以选择性地“裁减 保留单体分子官能团，获得含胺基、羟基 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 和羧基等特定官能团的聚合薄膜，兼具接枝与聚合的双重效果。 1 4 明胶及其在生物医学中的应用 明胶是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，明胶与胶原具同源性。明胶 的胺基酸成分主要有甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，它从含有胶原的哺乳动物 骨、皮、肌腱等的材料中经一系列处理后得到。原材料不同所得的明胶成分 不同。分子中既含有胺基又含有羧基和羟基，是能溶于水的聚多肽。分子量 一般为7 万9 万，是分散性的。 明胶用于生物医用材料制造具有以下特点：1 物理方面：抗张强度高，延 展性低，易干裂，具有类似真皮的形态结构，透水透气性好；2 化学方面： 可进行适度交联，可调节溶解性，可被组织吸收，可与药物相互作用：3 生 物学方面：生物相容性好，有生理活性，如有凝血作用。 明胶主要用于生物膜材料、医用纤维以及医用海绵等【2 3 1 。经物理或化学 方法交联过的明胶是一种生物相容性很好的可降解吸收材料，特别适用于作 药物的控释或缓释材料。明胶的化学改性是利用明胶上的各种官能团能与低 分子量或高分子量物质进行反应的功能，使明胶交联或接枝。 1 5 生物材料表面的促内皮化 近年来，随着生物医学工程的飞速发展，各种生物材料制作的人工器官 或医用装置日趋增多，特别在心血管领域，人工血管、人工瓣膜、血管内支 架等已广泛应用于临床，但其远期效果并不十分满意，其中血栓形成是限制其 临床应用的主要因素之一。在生物材料表面种植、培养血管内皮细胞 ( e n d o t h e l i a lc e l l ，e c ) 是改善材料血液相容性的最理想途径，但直接把e c 种 植在高分子材料表面不仅增殖慢，而且短时间内还容易从材料表面脱落下来。 因此，生物材料表面的内度化问题一直是人们的关注热点。 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 1 5 1 内皮细胞的功能 一般心血管疾病最初大都为血管内皮细胞机能的变化和损害引起，内皮 细胞的剥离，血浆成分的浸润，巨噬细胞的浸润，内膜内平滑肌细胞增殖， 在这一系列反应过程中，血管内皮细胞的损害和机能异常发生最早，在心血 管疾患的发生、形成、修复过程中起重要作用。 血管内皮细胞裱衬在整个心血管系统的内表面，是血管壁与血液之间的 分界细胞，是形成心血管封闭管道系统的形态基础。现在对它已经有了很深 入的了解，现在认为内皮层不仅仅是血液和组织的屏障，还具有其他多种功 能，如减少血管通透性，调节组织与血液的物质交换，防止血浆成分和血 液细胞无序地侵入；抗血栓作用，平衡抗血液凝固纤溶系统和抗血小板机 能，维持血液的流动性；调节血管平滑肌功能，合成和分泌调节血管平滑 肌舒张和收缩的相关因子；抑制血管壁细胞的游走和增殖。 1 5 2 生物材料表面的内皮化方法 内皮细胞能够抑制血栓的形成，维持血管内表面光滑，保持血流通畅。 抗凝血材料表面内皮细胞化，可以减少血栓形成及血小板激活。完整内皮细 胞化是最好的抗凝血表面。因为细胞一般不会直接黏附在人工材料基体上， 而是靠细胞表面的受体与材料表面相连接。高聚合物表面是疏水的，细胞一 般不会直接在其表面生长，而当材料表面预先涂覆蛋白、肽类、或经等离子 处理或配体处理后，细胞才有可能生长。 m a n s f i e l d 等【2 4 1 最早进行内皮化的研究，他们将种植内皮细胞的涤纶植入 犬的动脉壁，三周后发现涤纶表面无血栓形成，无炎症浸润。为了实现材料 表面的内皮化，有效的方法是向材料表面引入生物活性因子。生物活性因子 在材料表面的引入主要有物理吸附和化学固定等方法。下面所列是对目前常 用的制备具有促内皮化功能的材料表面的改性方法。 西南交通大学硕士研究生学位论文第10 页 1 生长因子涂层 碱性成纤维生长因子( b f g f ) 能促进内皮细胞的生长和增殖。w i s s i n k 等发现b f g f 可以与肝素键合在用e d a c n h s 交联的胶原基材表面上，通过 调节e d a c 的量可以增加肝素的固定量，从而有效增加b f g f 在材料表面的 固定量【2 5 】。实验还发现，b f g f 的存在明显促进人体脐带静脉内皮细胞在材料 表面的增殖，而b f g f 的固定量增加，内皮细胞的增长率提高。 2 蛋白质和多肽涂层 粘连蛋白和多肽，主要是y i g s r 和r g d 肽链，能促进内皮细胞黏附， 影响细胞迁移。k o u v r o u k o g l o u 等【2 6 】研究了用y i g s r 和r g d 修饰表面对内皮 细胞迁移行为的影响，发现y i g s r 和r g d 不仅影响内皮细胞的迁移速度， 而且还能增加细胞的运动持久性，提高细胞的自由运动吸收；s t e f a n ot u g u l u 等【2 7 1 人将a 喀g l y a s p ( r g d ) 接枝到聚2 一甲基丙烯酸羟乙酯( p 三m a ) 表面， 结果表明r g d 多肽有利于内皮细胞的黏附行为，能够促进与血液接触的材料 的表面的内皮化。w uz h o n g 等【2 8 1 将r g d 多肽固定到聚对苯二甲酸7 , - - 酯 ( p e t ) 表面得出内皮细胞在接枝r g d 的p e t 薄膜表面细胞黏附及活性明显 高于表面涂层纤维连接蛋白的p e t 。 另一多肽序列是羧基端联有肝素的纤维粘连蛋白，它也能促进血管内皮 细胞的黏附和增殖。h w e b s c h 等俐将f n c h v 共价联接到聚苯乙烯( p s ) 和p e t 膜上，能明显促进内皮细胞的黏附和铺展。 3 光学活性物质涂层 为了促进人工血管内腔的抗凝血性和外壁的组织再生，k i t o 和m a t s u d a 3 0 1 合成了具有光学活性的硫酸软骨素、透明质酸和明胶。这三种水溶性物质在 紫外光的照射下可转化成凝胶。将硫酸软骨素或透明质酸涂层在血管支架内 壁，而将明胶涂层在外壁，体外血小板和内皮细胞黏附实验表明在明胶涂层 一面有较好的黏附性，而在硫酸软骨素或透明质酸的一面黏附较少，这一技 西南交通大学硕士研究生学位论文第 页 术用于小直径( 5 r n m ) 涤纶和聚氨酯人工血管支架表面进行修饰，然后植入 杂种狗腹动脉后发现，血管支架内壁由于涂层不均匀，而出现局部凝血现象。 尽管这一实验没有得到较好的结果，光学活性物质涂层的技术还有待进一步 改进，但它提出了一种新型的用不同物质修饰人工血管支架内外表面的技术， 这为更有效地修饰血管支架材料提出了一个新的方向。 4 等离子体处理 将等离子体聚合薄膜与生物分子固定相结合的表面改性技术，应用于构 建生物传感器的研究已有一些报道。p u l e od a 等人【3 1 1 在t i 6 a 1 4 v 表面通过 等离子体聚合形成含胺基等离子体聚合物薄膜，通过胺基化反应固定骨形成 蛋白( b 4 ) ，表现出成骨诱导生物活性。 等离子体处理可以改变材料的表面性能而不会影响材料的本体性能。而 且经过等离子体处理后，材料的表面可以接枝很多特定功能基团的化合物， 因此被广泛应用于修饰人工血管支架材料。s o p h i em o n g e 等人【3 2 】利用丙烯酸 丙烯酸混合等离子处理硅树脂，引入了羧基不但增强了硅树脂的亲水性，而 且在改性后的薄膜材料表面种植猪的大动脉内皮细胞，表现出了良好的细胞 相容性。r a m i r e s 等【3 3 】用胺基和氧气复合等离子体处理p e t 表面后，可促进 人脐血管内皮细胞增殖，表现了较好的生物相容性。 自从1 9 7 8 年h e r r i n g l 3 4 】等首次将d a c r o n 人工血管表面种植自体内皮细胞 获得成功以来，人门已逐渐认识到材料表面内皮化是改善材料血液相容性的 理想途径之一。但是内皮细胞在材料表面粘附的牢固程度和繁殖速度一直不 能令人满意，为了改善内皮细胞在人工血管表面的粘附和生长，人们设想在 材料表面营造类似体内细胞外基质( e x t r a c e u u l a rm a t r i x ，e c m ) 环境，使材料表 面更接近细胞生长的生理条件以促进细胞的粘附、生长。为此，c l a p p e r 等【3 5 】 用光偶联剂将纤维粘连蛋( j ( f i b r o n e c t i n ，烈) 和胶原( c o l l a g e n ，c l ) 固定在 多孔的聚氨醋和聚四氟乙烯人工血管表面，体外实验证实促进了内皮细胞的 西南交通大学硕士研究生学位论文第12 页 粘附和生长，动物实验显示该方法可提高人工血管的通畅率。r u o s l a h t i 等1 3 6 】 研究发现，精氨酸甘氨酸天门冬氨酸三肽( r g d ) 是e c m 中很多粘附蛋白如 纤维粘连蛋白、玻连蛋白和胶原等所共有的细胞间最小的识别序列，而这一 序列在介导细胞粘附和铺展方面起着非常重要的作用，因此在材料表面固定 r g d 三肽或含r g d 的多肽序列成为一种促进细胞粘附、铺展和生长的重要 途径。有人将n 羟基琥珀酰亚胺活化的光偶联剂6 ( 4 叠氮基2 硝基苯胺) 己 酸键接上g l y a r g - g l y a s p ( g r g d ) ，再通过紫外光照射将g r g d 偶联到壳聚 糖表面，选用人体脐静脉内皮细胞进行细胞培养实验，结果表明能明显促进 细胞的粘附、铺展和生长，内皮细胞生长速率提高了5 0 左右。 虽然内皮化方法在高分子材料表面改性领域有很多的研究，但是在金属 表面改性中的应用很少。近年来，越来越多的研究者致力于金属医用材料表 面内皮细胞相容性研究，v a n d e rg i e s s e n t ”】等首先进行了血管内支架的内皮化 研究。支架上的内皮细胞有利于减轻和修复p t c a 术后损伤的血管内皮，弱 化诱发再狭窄的始动因素，避免金属支架与血流直接接触，使血流平稳，减 少了不良刺激；尤其是内皮细胞可以分泌一氧化氮( n o ) 、前列环素( p g t 2 ) 等 活性物质，可有效防止血栓形成；经基因修饰的内皮细胞还可以产生组织型 纤溶酶原激活物( t p a ) 、血管内皮细胞生长因子( v e g f ) 等活性物质，有效防止 再狭窄的发生、发展。y a b i nz h u 3 8 】等人通过在聚氨酯( p u ) 膜和血管支架表 面与1 ，6 己烷二胺的氨基化反应在其上引入自由氨基。然后以氨基为反应位 点进一步固定明胶、胶原和甲壳素等生物大分子，体外人脐内皮细胞黏附实 验结果显示，改性后的薄膜表面具有促内皮化作用。 b o 一3 9 】等将人脐内皮细胞种植到多层聚电解质薄膜，结果表明了多层聚 电解质薄膜表明既不引起内皮细胞的毒性反应，也不引起细胞的显性反应， 与单层的聚电解质薄膜相比更有利于内皮细胞的黏附，为材料表面改性提供 了一种新的方法。但是，目前生物材料内皮化研究多局限于体外或短期体内 西南交通大学硕士研究生学位论文第13 页 观察阶段，黏附于材料表面的e c 在体内抗血流冲击能力差一直是困扰各国学 者的难题。 1 6 论文研究的背景、目的及内容 1 6 1 研究的背景 由于不锈钢具有良好的机械力学性能、易加工性和可靠性，广泛用于人体 植入材料，但由于金属本身所具有的血栓源性和耐腐蚀性差等缺点，使得不 锈钢材料的生物相容性不十分理想。因此如何提高不锈钢一类的金属材料的 生物相容性的研究成为医用金属材料领域研究的热点。 近年来，陆续开展了生物材料表面生物化的相关研究。相对高分子材料 表面生物化研究，对金属生物材料的生物化的研究却较少。这主要是由于医 用金属生物材料表面较难生成反应性官能团，如何通过表面改性方法在金属 材料表面形成反应性官能团，并通过反应性官能团固定生物大分子，实现金 属材料表面的生物化成为研究的热点。 通过前面对等离子体的了解，可以发现低温等离子体聚合反应具有其他 方法所不能比拟的优点。利用等离子体聚合在医用不不锈钢基底表面沉积富 含( 一也或c o o h 等) 的聚合物薄膜，一方面，薄膜表面形成的极性基团 不仅提高了不锈钢材料表面的亲水性；另一方面，材料表面官能团的存在还 提供了与其它生物分子反应的活性位点。本论文在医用不锈钢表面引入胺基、 羧基，用戊二醛和e d c 作交联剂，在表面共价键合明胶生物大分子。 用体外培养人脐内皮细胞的技术，观察固定明胶材料表面的细胞的黏附， 生长等情况，证明此改性技术的有效性，以期得到具有促内皮化功能的薄膜。 1 6 2 研究目标及技术路线 通过在医用不锈钢基底沉积等离子体聚合物薄膜并实现促内皮化结构设 计与控制一即利用脉冲等离子体聚合反应在材料表面构建含有官能团的等离 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 4 页 子体聚合物薄膜，并以此固定生物分子明胶，制备具有促内皮化功能的等离 子体聚合物薄膜，实现医用材料的表面生物化。通过控制等离子体聚合物薄 膜的表面组成，以体外人脐静脉内皮细胞在材料表面的粘附与增殖行为， a l a m e rb l u et e s t 等为指标，评价固定促内皮化生物分子的等离子体聚合薄膜 的细胞相容性。 具体