（生物物理学专业论文）草鱼脑芳香化酶的cdna克隆、启动子分离与转录活性的调控.pdf

摘要 摘要 细胞色素p 4 5 0 芳香化酶能够催化雄性激素向雌性激素的转化，被认为是类固 醇激素代谢过程中的一个关键酶。在硬骨鱼中存在两种芳香化酶异构体， p 4 5 0 a r o m a 和p 4 5 0 a r o m b ，分别在性腺组织和脑组织中有高表达。有趣的是，硬 骨鱼的脑芳香化酶活性大约是其他脊椎动物的1 0 0 1 0 0 0 倍，但至今对这种现象未 有合理的解释。在目前的研究中，我们运用r t - p c r 以及快速扩增e d n a 末端 ( r a c e ) 的方法成功克隆了草鱼脑芳香化酶( g c p 4 5 0 a r o m b ) 的e d n a 序列。该 序列全长共有1 9 4 7 b p ，其中开放阅读框( o r f ) 长1 5 2 7 b p ，可以编码5 0 9 个氨基 酸残基。经氨基酸序列比对发现，草鱼脑芳香化酶与其他硬骨鱼类脑芳香化酶有 较高的相似性( 6 6 - 9 3 ) ，而与性腺芳香化酶仅有约6 0 相似性，与哺乳动物芳 香化酶有5 0 的相似性。运用半定量r t - p c r 的方法进行组织分布研究发现，在所 选择的1 0 个组织中，仅在脑和垂体腺中发现了g e p 4 5 0 a r o m a b 的m r n a 表达，进 一步在脑的不同区域中发现g c p 4 5 0 a r o m b 的m r n a 在视前区、下丘脑和垂体区域 有表达。此外，利用基于p c r 方法的基因步移法克隆了草鱼脑芳香化酶基因5 端 的上游序列。所获得的启动子序列共有2 3 k b ，其中包括了1 个t a t a 框，1 个c a a t 框以及许多潜在的转录因子结合位点，包括g a t a s ，a p l ，e r e c r e ，c e b p ， n f - 1 ，s p l ，p p a r a l p h a r x r - a l p h a ，s r e b p - l ，g p ，n f k a p p a b ，a h r a m t ，s t a t x 元件和c r e b p l e - j t m 等等。此外，实验结果显示，g e p 4 5 0 a r o m b 基因的翻译从第 二个外显子开始，与不翻译的第一个外显子之间存在一个较长的内含子，大约有 2 7 k b 。草鱼脑芳香化酶启动子活性的检测是以体外大鼠神经胶质瘤细胞( c 6 ) 为 模型，对5 端上游序列采取5 端逐渐缺失片段构建荧光素酶报告基因的表达质粒 来完成。结果显示，与阴性对照p g l - 3 - b a s i e 相比，几乎所有包括了第一个内含子 全部序列的报告质粒都表现出不同程度的转录活性，而仅含有启动子序列的的报 告质粒都没有转录活性。实验中还初步探讨了下丘脑分泌因子( p a q 心) 和垂体 分泌激素( s t h 、g t h 和a e t i v i n ) 对调控序列转录活性的影响，表明p a c a p 在调控 序列缺失到p g l 3 1 5 9 + 2 8 2 2 后一直表现为明显的抑制作用，而g t h 对不同长短 的启动子序列的转录水平都呈现出抑制作用，特别是在p ( 3 l 3 + 18 5 5 + 2 8 2 2 抑制效 果尤为显著。与之不同的是，生长激素( s t h ) 在报告质粒p g l 3 8 2 8 + 2 8 2 2 显示 出明显的促进作用。但是这种作用在进一步的缺失后被阻断，甚至在+ 8 6 1 + 1 8 5 5 摘要 出明显的促进作用。但是这种作用在进一步的缺失后被阻断，甚至在+ 8 6 1 + 1 8 5 5 区域缺失后转为抑制作用。出乎意料的是，a c t i v i n 对草鱼脑芳香化酶的转录调节 效果与生长激素的相类似。 关键词：脑芳香化酶，克隆，c d n a ，启动子，活性，草鱼 a b s t r a c t a b s t r a c t a sc y t o c h r o m ep 4 5 0a r o m a t a s ec a l lc a t a l y z et h ec o n v e r s i o no fa n d r o g e n st o e s t r o g e n s ，i ti sc o n s i d e r e da sak e ye n z y m ei nt h eh o r m o n a ls t e r o i d o g e n i cp a t h w a y i n t e l e o s t s ，t w oi s o f o r m so fa r o m a t a s ea r ee x p r e s s e dm a i n l yi no v a r ya n db r a i n , w h i c ha r e n a m e da sa r o m aa n da r o m b r e s p e c t i v e l y i n t e r e s t i n g l y ，t e l e o s tf i s ha r o m be x p r e s s i o ni s 1 0 0 - 1 0 0 0t i m e sg r e a t e rt h a nt h a tf o u n di no t h e rv e r t e b r a t e s ，b u tt h em e c h a n i s m r e s p o n s i b l ef o rt h i sp h e n o m e n o ni su n c l e a r i nt h ep r e s e n ts t u d y ，t h ef u l l l e n g t he d n a o fa r o m bw a sc l o n e df r o mg r a s sc a r pb yr t - p c rc o u p l e dt or a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n ae n d s ，n a m e da sg e a r o m b t h ee d n ac o n t a i n e da no p e nr e a d i n gf r a m eo f 15 2 7 b pe n c o d i n gap r e d i c t e dp r o t e i no f5 0 9a m i n oa c i dr e s i d u e s ，w h i c hs h a r e d6 6 9 3 s e q u e n c ei d e n t i t y 、7 l ，i n li t sc o u n t e r p a r t si no t h e rt e l e o s t s ，b u to m ys h o w e da b o u t5 0 i d e n t i t y t om a m m a l i a na r o m a t a s e r t - p c ra n a l y s i sr e v e a l e dt h a tg c a r o m bo n l y e x p r e s s e di nb r a i nf r o m10s e l e c t e dt i s s u e s s u b s e q u e n t l y ，a r o m bm r n a w a sd e t e c t e d i nt h ep a r t i a la r e a so fg r a s sc a r pb r a i n , i n c l u d i n gt h eo p t i cr e c t u m ，h y p o t h a l a m u sa n d p i t u i t a r y f u r t h e r m o r e ，ap c r - b a s e dg e n o m i cw a l k i n gs t r a t e g yw a su s e dt oi s o l a t et h e 5 - f l a n k i n gr e g i o no fg r a s sc a r pa r o m b t h eg r a s sc a r pa r o m b5 f l a n k i n gr e g i o n ( 2 3 k b ) c o n t a i n e dac o n s e n s u st a t ab o x ，ac c a a tb o xa n ds o m ep o t e n t i a lt r a n s c n p t i o n f a c t o rb i n d i n gs i t e si n c l u d i n gs o m eg a t a s ，f o u ra pi ，a l le r e ，t w oc r e ，f o u rc e b p ， t w on f - 1 ，t w os pl ，ap p a r a l p h a r x r - a l p h a , as r e b p l ，ag p ，an f k ；a p p a b ，a l l a h r a m t , t h r e ec r e - b p1 c - j u na n dt h r e es t a t xe l e m e n t s t h et r a n s c r i p t i o na c t i v i t y o fg c a r o m bw a se v a l u a t e di nv i t r ou s i n gl u c i f c r a s ea st h er e p o r t e rg e n e i nt h eg l i o m a c e l l s ( c 6 ) t r a n s f e c t e db yc o n s t r u c t sw i t hd e c r e a s i n gl e n g t ho fg c a r o m bp r o m o t e r ( - 2 2 9 0 + 16 4 ) ，u n e x p e e t i v e l y ，t h eb a s a ll e v e l so fl u c i f e r a s ea c t i v i t yc o u l d n o tb ed e t e c t e d i nc o n t r a s t ，a l lr e p o r t e rc o n s t r u c t s 啊t 1 1i n t r o nit r a n s i e n t l yt r a n s f e c t e di n t og l i o m ac 6 s h o w e dd i f f e r e n t i c a lb a s a la c t i v i t y t ot e s te f f e c t so fh y p o t h a l a m u sf a c t o ra n dp i t u i t a r y h o r m o n e so nt h et r a n s c r i p t i o na c t i v i t yo fg c a r o m b ，c 6c e l l st r a n s f e c t e db yc o n s t r u c t s w e r ee x p o s e dt op a c a p ，g t h ，g ha n da c t i v i n i nt h i sc a s e ，b o t l lp a c a pa n dg t h s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d t h e p r o m o t e ra c t i v i t ) r f r o m p g l 3 1 5 9 + 2 8 2 2t o i i i p g l 3 8 2 8 + 2 8 2 2 ，a n dt h i se f f e c tw a sb l o c k e db yt h ef o l l o w i n gd e l e t i o n , a n dt h e n r e v e r s e dd u et ot h ea b s e n c eo f + 8 6 1 + 1 8 5 5r e g i o n c o n s i s t e n t l y , a c t i v i ne x h i b i t e d s i m i l a re f f e c t so np r o m o t e ra c t i v i t yo fg c a r o m ba sg h k e yw o r d s ：b r a i na r o m a t a s e ，c l o n i n g , e x p r e s s i o n , p r o m o t e r , a c t i v i t y , g r a s sc a r p i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得电子科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：錾堑垃日期：d 洲辟6 月年日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解电子科技大学有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权电子科技大学可以将学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 签名导师始她 日期：山7 年6 月9 日 第一章绪论 第一章绪论 细胞色素p 4 5 0 芳香化酶( c y t o e h r o m ep 4 5 0a r o m a t a s e ，p 4 5 0 a r o m ) 是类固醇激素 代谢中的一种重要酶类，是雌激素合成过程的最后一步关键限速酶。芳香化酶由 c y p l 9 基因编码产生，在人体内，它所表达p 4 5 0 a r o m 的数量及活性直接决定了正 常或异常组织中雌激素的水平，从而维持正常组织中与雌激素相关的生理功能以 及影响雌激素依赖性疾病的发生、发展和预后。而在鱼类中，芳香化酶的表达水 平与性别分化以及性别转化有着密切的关系。故近年来，越来越多的学者对芳香 化酶及其基因c y p l 9 的结构、功能以及调控方面有了更深入的研究。 1 1c y p l 9 基因和p 4 5 0 a r o m 的结构 1 1 1 细胞色素p 4 5 0 家族与c y p l9 基因 细胞色素p 4 5 0 芳香化酶属于细胞色素p 4 5 0 超家族中的一员，该基因超家族约 有1 0 0 个家族，包括6 0 0 多个成员【1 1 。是一类以血红素为辅基的b 族细胞色素超家族 蛋白酶，因还原型p 4 5 0 与一氧化碳复合物在4 5 0 r i m 处有一吸收峰，故命名为p 4 5 0 。 p 4 5 0 超家族依次可分为家族、亚家族和亚型。同一个家族的p 4 5 0 其氨基酸的同源 性大于4 0 ，则用c y p 后面加一位阿拉伯数字表示，如c y p l ；如果氨基酸序列同 源性大于5 5 的归为同一个亚家族，用在家族表达式后面加一个大写字母表示，如 c y p l a ；对于每种亚家族中的亚型则在亚家族表达式后面再加上阿拉伯数字表示， 如c y p l a l t l l 。 超家族细胞色素p 4 5 0 是一种末端加氧酶，广泛分布于各种脊椎动物、无脊椎 动物、植物、真菌和细菌t 2 1 ，通 过n a d ( p ) h 获得电子后，能够催化单加氧反应， 在碳源同化、激素合成、外源物质降解、致癌物质消除等方面有着重要作用。目 前研究已经确定了人类的5 7 个p 4 5 0 基因和3 3 个假基因，共有1 8 个家族、4 2 个亚家 族。每个基因之间存在有大量的等位基因，这正是p 4 5 0 弓i 起药物氧化代谢个体差 异和种族差异的生化基础【3 】。 在人体内编码芳香化酶p 4 5 0 的基因( 即c y p l 9 基因) ，是单拷贝基因，其氨基酸 序列具有明显的细胞色素p 4 5 0 基因家族的特征，存在跨膜区、i - 螺旋区、o z o l s 肽、 电子科技大学硕士学位论文 亚铁血红素结合区 4 1 。c y p l 9 基因全长有7 0 k b ，位于1 5 q 2 1 ，共有十个外显子，翻 译的起始密码子位于第二个外显子，第一个外显子为可变的不编码区域，且从不 同组织中分离到的第一个外显子序列几乎不相同，但是不同组织的c y p l 9 基因编 码产生的芳香化酶氨基酸序列是一样的。据报道c y p l 9 基因的表达受组织特异性 的启动子调控，组织特异性表达是其表达模式最大的特点。近年的研究表明， c y p l 9 基因包括许多组织特异性的启动子介导c y p l 9 基因的表达，不同的启动子上 游的基因可以携带不同的调节基因，结合于该区域的核蛋白受组织类型和内分泌 环境的影响。因此，特定组织中，c y p l 9 基因的表达产物芳香化酶p 4 5 0 的含量、 活性及其最终发挥的组织特异性功能各有不同。迄今为止，已经发现1 0 个组织特 异性启动子( p i 1 ，p i 2 ，p i 3 ，p i 4 ，p i 7 ，p i 5 ，p i 6 ，p i i ，p 2 a ，p i f ) ，p i 1 约 位于c y p l 9 基因编码区上游9 3 k b 处，p i 4 约位于7 3 k b 处，p i 7 约位于上游3 6 k b 处 5 1 。 有文献报道，在未成熟的硬骨鱼中，雌激素对脑垂体性腺轴有促进的作用【6 j 。 而在硬骨鱼中却发现有两种不同的基因( c y p l 9 硼c y p l 9 b ) 编码两种不同的芳香 化酶。一种是性芳香化酶( p 4 5 0 a r o m a ) ，主要在性腺组织，特别是卵巢中有较高 的表达，另一种是脑芳香化酶( p 4 5 0 a r o m b ) ，主要在脑和垂体表达水平较高，而 在卵巢的表达水平很低 7 1 。这两种芳香化酶具有特异性的启动子和不同的组织分 布，因此其表达受不同的调节因子的影响，在胚胎发育的过程中有着不同的时空 表达模式，具有独特的功能【8 ，9 】。这种多基因编码同一氨基酸序列的现象可能是由 于进化过程中基因复制时发生串联复制，之后又分散而得来的结果；而单基因多 启动子的现象则是由于复制后的聚合而产生。在鱼类，芳香化酶主要还参与个体 性腺分化的调控【1 0 l ，很多实验已证实芳香化酶可控制多种鱼类的性别分化和性别 转化【i l 】，抑制其活性可以使一些鱼类性别发生反转，即使基因型雌鱼变成表现型 雄鱼，这些鱼类包括赤点石斑鱼【1 2 】以及尼罗罗非鱼f 1 3 】等。 1 1 2 细胞色素p 4 5 0 芳香化酶结构以及作用机理 目前，已经有很多物种包括哺乳类【l 1 刀、鸟类【l 扪、两栖类【1 9 】和鱼类1 9 抛1 的 c y p l 9 基因全部编码序列被成功克隆出来，通过比对发现这些e d n a 编码的氨基酸 序列几乎都有p 4 5 0 超家族特有的功能区，包括跨膜区，i 螺旋区，特异的芳香化区， o z o l s 区以及血红素结合区( 如图1 1 ) ，且这些特殊的区域具有较高的同源性。表 明芳香化酶基因的功能在进化上是比较保守的。 2 第一章绪论 厂_ 瓦 卜。、；0j 卜：鼢溆i 7 冶一、v 7 唰r 】 7 。| ，上j 图】1 芳香化酶结构模式图 绿色代表- 螺旋区；红色代表血红素：蓝色代表血红 素结合区：白色代表底物( 雄性撇素) p 4 5 0 a r o m 基因主要分布在内质网和线粒体内膜上，与一种黄索蛋白一还原型 辅酶i i p 4 5 0 还原酶形成芳香化酶复合物】，以带有不饱和a 环的雄性激素作为反应 底物，可经过连续的三次羟化反应，脱去c 1 9 类固醇( 雄烯二酮和睾酮1 的1 9 甲基， 使a 环芳香化，从而转变成c 1 8 雌激素( 雌酮和雌二醇) ( 如图1 2 ) 。此反应属于 混合功能氧化酶反应，以高度保守的血红素结构域形成配基受体位点，即底物结 合部位，并参与芳香化反应。每催化产生1t o o l 的雌激素，要消耗3t o o l 的氧气和 3 摩尔的n a d p h 。n a d p h 的还原当量通过黄素蛋白转移到细胞色素p 4 5 0 芳香化 酶，依次将氧插入到分子中。在芳香化反应过程中，伴艟着a 环芳香化为酚环结构， 失去的c 1 9 甲基生成蚁酸 】q 。 图】- 2 芳香化酶催化反应机制 电子科技大学硕士学位论文 1 2 芳香化酶的分布 1 2 1 芳香化酶在哺乳动物体内的表达分布 早在7 0 年代，n a f t o l i n 等人发现人脑组织可以将雄性激素发生芳香化变成雌性 激素，即雄性激素对脑组织的作用可以通过脑内的芳香化酶，将雄激素转化为雌 性激素( 主要是雌二醇) 来实现t 2 s 。后经研究又发现正常情况下，p 4 5 0 a r o m 分 布于人及其它哺乳动物的多种组织中，在脑，性腺，胎盘，肾，肝，脂肪组织， 骨以及消化管中都有所表达【2 6 】。此外在中枢神经系统、胎盘合体滋养细胞、卵巢 颗粒细胞和黄体细胞、脂肪组织及其间质细胞、睾丸l e y d i g 细胞、几乎所有的生精 细胞和脑组织( 包括下丘脑和海马) 、乳腺、骨骼的成骨细胞以及腹部、股和臀 部的脂肪组织等等【2 7 ，2 引。在许多雌激素依赖的疾病病灶中也有较高的表达，其中， 研究较多的有乳腺癌和妇科肿瘤，如子宫内膜癌、子宫内膜异位症、子宫腺肌症、 子宫肌瘤、卵巢性肿瘤等。芳香化酶在脑内的表达特点通过酶活性分析、免疫细 胞化学、原位杂交及r t p c r 等方法进行研究，已在若干动物脑内检测到芳香化酶 的表达，主要资料来自啮齿类和鸟类的研究。这些方法所获得研究结果基本一致， 芳香化酶主要表达在神经元边缘和神经内分泌区域【1 1 ，2 9 1 。p 4 5 0 a r o m 在这些组织中 分别以不同的作用机制发挥其生理或病理功能，并受其他多种因素的影响。研究 证明，在哺乳动物的胚胎期以及围产期芳香化酶的活性达到最高，在向成年期过 渡的过程中逐渐下降。 1 2 2 鱼类组织中芳香化酶的表达 在鱼类存在的两种不同的芳香化酶中，脑芳香化酶具有异常高的活性，g a l l a n d 人等发现芳香化酶在鱼类的脑和垂体中的活性比其他脊椎动物的高出1 0 0 1 0 0 0 倍 【3 0 】。成熟的金鱼和琵琶鱼的脑芳香化酶主要集中在脑垂体和前脑部分p0 。，在虹鳟 1 3 1 】和非洲鲶鱼【3 2 】的间脑中脑芳香化酶的活性也很高。有很多学者认为，雄性鱼类 的精巢不能合成雌激素，其脑组织是雌激素合成的主要场所，雄性鱼体内血清中 低含量的雌激素主要是来自于脑芳香化酶催化雄性激素转化而来的i j 。在未成熟 的硬骨鱼体内，脑芳香化酶的催化活性与鱼的性别关系不大【3 4 】，但是脑芳香化酶 的活性会随着季节变化而出现波动。与哺乳动物不同的是，在幼鱼期芳香化酶的 表达很低，而在逐渐成熟的过程中，芳香化酶的表达量也随着增加【i u j 。有研究表 明，赤点石斑鱼在生殖季节的脑芳香化酶活性最耐3 5 】。硬骨鱼中，脑芳香化酶主 4 第一章绪论 要表达在放射性神经胶质细胞中【3 引，通过标本整体的原位杂交及斑马鱼成鱼的 脑部、垂体以及卵巢滤泡的石蜡切片观察发现脑芳香化酶在脑部的嗅球( o b ) 、 端脑腹面( t e l ) 、下丘脑视前区( p o a ) 、下丘脑环带腹部或尾部( h t ) 以及 垂体前部圆形突起有很强的表达1 3 9 。此外，运用r t - p c r 的方法和n o r t h e r n 杂交的 方法，发现鱼类芳香化酶的表达还存在于繁殖系统以外的组织，包括肝脏组织、 脂肪组织、头肾、鳃等组织。研究表明日本鳗鲡【加1 、欧洲尖嘴鲈【4 1 1 、大西洋缸【4 2 1 的性芳香化酶以及虹鳟的脑芳香化酶都在多种组织中都有所表达，但同时又表现 出了种群的表达差异性。 1 3 芳香化酶的表达与调控 芳香化酶广泛存在于大多数脊椎动物中，可以影响哺乳动物中枢神经系统的 功能和发育，调节神经内分泌和繁殖功能以及性行为【4 3 】。在不同的组织中受到组 织特异性启动子的调节。而同一种硬骨鱼的两种芳香化酶在氨基酸组成上大约有 6 0 的同源性，表明在鱼的生长发育过程中，二者的表达调控以及生物功能存在一 定的差异。芳香化酶和细胞色素p 4 5 0 超家族的其他成员一样，其表达调控过程比 较复杂。目前已发现许多化学物质和激素参与调节脑芳香化酶的表达。研究证明， 在大鼠生后发育阶段及成年期，雄激素通过雄激素受体介导可调节脑内芳香化酶 的表达i l o ，4 叼。c a m p 的刺激因子如f s h 、l h 、h c g 等，和c a m p 膜转运类似物如糖 皮质激素等以及多种血浆因子都能影响芳香化酶基因的表达。此外，核受体家族 成员也能够促进芳香化酶的表达，如类固醇生成因子s f 1 ( n r s a l ) ( o r p h a nr e c e p t o r s t e r o i d o g e n i cf a c t o r - 1 ) 。而属于生长因子家族的i g f 贝u 可以对芳香化酶的表达起抑 制作用【4 5 1 。 1 3 1 雌激素对芳香化酶的表达调控 鱼类的脑组织是雌激素产生的主要器官，而雌激素在个体发育、分化以及维 持内环境稳态方面都有着重要的作用，雌激素也发挥了很有效的神经保护和神经 营养作用。雌激素可以通过两种机制调节基因的表达，一种是“基因组机制， 即通过与特异雌激素受体结合后对靶基因转录进行调节。这种调节方式的完成需 要一个相对较长的时间( 数小时到数天) ；另一种是相对快速的反应途径( 数秒 到数分钟) 一“非基因组信号通路 ，即通过某些膜受体激活第二信使后进行转 录水平的调节m 。雌激素对脑芳香化酶的调控主要是依赖于雌激素受体，形成配 5 电子科技大学硕士学位论文 体受体复合物后，与靶基因启动子的雌激素反应元件( e r e ；a g g t c a l 、斟n t g a c c t ) 结合，从而调控基因的转录。在硬骨鱼体内有三种不同的雌激素受体e rq 、 e r1 3 和e ry 4 7 】，虽然目前还没有证据证明雌激素受体和芳香化酶在同一种细胞中 有共表达的现象【4 3 1 ，但是在e r e 存在的情况下，雌激素能够刺激脑芳香化酶的转 录活性是得到证明的【4 8 - 5 0 1 。 1 3 2 雄性激素对芳香化酶的调节 雄性激素不仅可以作为芳香化反应的底物，同样也参与了对芳香化酶活性的 调控。对硬骨鱼的研究中发现，已经克隆得到的性腺芳香化酶基因启动子序列往 往含有雄性激素反应元件( 触通；a q a c a m 心汀g t t c t ) ，提示着雄性激素与 芳香化酶的表达调控上存在着一定的关系。而在某些鱼中对脑芳香化酶基因的转 录调节上，雄性激素所发挥的作用是通过雌激素受体间接实现的【5 1 】。 1 3 3 依赖于c r e b ( c a m p 反应元件结合蛋白) 对芳香化酶的调节 近年来越来越多的研究显示，c , 6 d v i p p k a 信号通路参与了哺乳动物芳香化酶 基因的表达调控m ，矧，同样，c p , j 三元件也存在于多种硬骨鱼的芳香化酶基因5 端 调控序列中阱巧9 1 ，说明c a m p p k a 信号通路对硬骨鱼类的芳香化酶基因表达有重要 作用。许多刺激因子通过其受体以及一系列胞内信号级联反应能够促进c a m p 的产 生，而c a m p 对下游靶基因的作用主要是通过经蛋白激酶a ( p k a ) 作用下磷酸化 的c a m p 反应元件结合蛋白( c r e b ) 与芳香化酶基因启动子区域特异的d n a 序列 c r e 元件结合，从而对转录水平进行调节。通常该顺式作用元件的核苷酸序列为 t n a c g t n a 。 1 3 4 核受体对芳香化酶的调节作用 核受体超家族( n u c l e a rr e c e p t o rs u p e r f a m i l y ) 是由类固醇激素受体、甲状腺 激素受体、维生素d 3 受体、维甲酸受体和最近几年所发现的数目众多的孤儿核受 体( n u c l e a rr e c e p t o r ) 组成。在结构上，核受体一般包括四个独立的但是又相互作 用的功能区，即调节区、d n a 结合区和配体结合区【删。核受体超家族的大多数成 员受经典的内分泌激素调节，但也有一些成员在调节靶基因表达时不需要配体参 与，或者至今没有发现有相应配体的参与，把这类成员称为孤儿核受体。孤儿核 受体可以参与非经典激素引起的反应，包括维生素a 衍生物、前列腺素、脂肪酸和 6 第一章绪论 固醇等。其效应元件往往出现在代谢酶类基因的启动子区域。s f 1 就是孤儿核受 体成员f t z f 1 ( t h ef u s h it a r a z uf a c t o r - 1 ) 中的一员，是种细胞特异性的转录因子， 最早是在肾上腺细胞中发现能够调节类固醇羟化酶的表达，广泛分布于产生类固 醇的细胞中，后研究发现s f 1 可以通过a g g t c a 序列或者相似的序列调节芳香化 酶基因的表达，特别是在哺乳动物某些组织中的芳香化酶或硬骨鱼的性芳香化酶 基因。 1 4 本课题研究目的和内容 草鱼，又名鲩鱼，是我国重要的经济淡水鱼中的一种，号称“四大家鱼 之 一。由于草鱼达到性成熟的时间较长( 5 6 年) ，因此作为我们研究模型的一年 龄草鱼正处于所谓的“青春前期 ( p r e p u b e r t a ls t a g e ) ，而非性别分化时期，但 是草鱼芳香化酶在脑组织中依然有较高表达。那么，在这个快速生长过程中的草 鱼脑芳香化酶的作用又是什么呢? 与生长和生殖调控有关的激素或因子是否参与 它的表达调控以维持该生长期的神经内分泌平衡? 为此，本课题试图阐明草鱼芳 香化酶的基因结构，进一步分析其表达和调控特征，明确脑芳香化酶参与神经内 分泌的功能地位，为阐明硬骨鱼脑组织中芳香化酶高活性表达的机制提供有益线 索。 本课题首先获悉一年龄草鱼脑芳香化酶的e d n a 编码序列，并通过其氨基酸 序列比对以及进化树的构建分析，确定草鱼脑芳香化酶基因在生物进化中的地位。 同时运用半定量r t p c r 的方法，探索草鱼脑芳香化酶基因在不同的组织中，以 及脑组织不同区域中的m r n a 表达水平，发现在非性别分化的草鱼体内脑芳香化 酶基因发挥功能的场所。为获悉草鱼脑芳香化酶基因在转录水平的调节，该基因 的5 上游启动子序列被分离，并构建一系列含不同长度启动子序列及荧光素酶表 达质粒，瞬时转染进入大鼠神经胶质瘤细胞( c 6 ) 后，通过检测荧光素酶活性分 析相应启动子序列的转录活性。在此基础上，实验中选用具有代表性的下丘脑分 泌因子和垂体分泌激素，包括垂体腺苷酸环化酶激活多肽( ( p i t u i t a r ya d e n y l a t e e y c l a s ea c t i v a t i n gp o l y p e p t i d e ，p a c a p ) ) 、促性腺激素( g o n a d o t r o p i n ，o t h ) 、 激活素a ( a c t i v i na ) 以及生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，g h 或s o m a t o t r o p i n ，s t h ) 研究它们对草鱼脑芳香化酶基因转录活性的影响。 7 2 1 实验材料 电子科技大学硕士学位论文 第二章草鱼脑芳香化酶的c d n a 克隆 2 1 1 实验动物 一年龄的草鱼购自成都通威水产公司，平均体重为l k g 左右。 2 1 2 菌种和质粒 克隆宿主菌：大肠杆菌( e s h e r i c h i ac o l i , e c o l o 菌株j m10 9 ，由实验室保存。 克隆载体：p g m t 载体购白天根生化公司( 北京，中国) ，t 7 和s p 6 为该载体 的通用引物，其图谱及多克隆位点如下图所示： t 7t l m f l mr 口啪5 咖 广_ 嚣t 6 t w k 烈汽 c 屯”岵5 c ：c ； 盯1 8 6g c c c 6 c 5 t ：g 0 r e ：1 c = cg c , q - g c c 盯5 掣 0 对? 封c 节； 0 t 0 + ：a ：簖1 c ：c g 僦t o ： 0c ：t c 巴0 0 gc c e s cc ：1 虻 。可鬲赢磊r 一iii ll 口i 时，埔 州i帅f 麓器：黑星怒嬲1 陋嘲t ) y 轰麓嚣婴溉罢芝器錾岳罢害器磊嚣 虹r , 生a zi 割b 一龟掣l 占 碱 a , m s , ：r l a e 譬，l + c 时g 8 品6 j 5 c tc c c a a 0 6 筒亿c - 盯6 m ；c t l 5 5 1 付t ：t ? 6 t b t c c a a a r 6 i a l a ：= ：1 c 一：队g j 酊r t5 c 5 ： ：c j r o l a t - ：5 c t u a i - a 厶睢t ：j o 0 甜tr t a iiiili 吾手石志百一 蛐l l -田i粕i 图2 - 1p g m - t 载体图谱及其多克隆位点 8 ， r 煳赁竹柏他的斟阳”丌s骋钉 第二章草鱼脑芳香化酶的c d n a 克隆 2 1 3 主要实验仪器和设备 8 0 超低温冰箱( t h e r m o 公司) ，冷冻离心机5 4 1 5 r ( e p p e n d o r f 公司) ，离心机 5 4 1 5 d ( e p p e n d o r f 公司) ，移液枪( e p p e n d o f f 公司) ，m a s t e r c y c l e r 梯度p c r 仪 ( e p p e n d o r f 公司) ，水平电泳仪( b i o r a d 公司) ，凝胶成像系统( b i o - r a d 公司) ，恒温 空气浴( e p p e n d o r f 公司) ，高压灭菌锅( t h e r m o 公司) ，恒温摇床( t h e r m o 公司) ，电 子分析天平( d e n v e r 公司) ，紫外可见分光光度计( 普析通用公司) ，4 c 冰箱( 荣事达 公司) ，恒温磁力搅拌器( 沪西公司) ，p h 计( t h e r m o 公司) 。 2 1 4 实验试剂 t a q 聚合酶，l o n gt a q 聚合酶试剂盒，d n am a r k e r ( i 、i i 和) 均购自 天根生化公司( 北京，中国) ；m m l v 反转录试剂盒和d n a 胶回收试剂盒购自 p r o m e g a 公司( m a d i s o n ，美国) ；t 4d n a 连接酶购自t a k a r a 公司( 大连，中国) ； 氨苄青霉素购自a l l r e s e , o 公司( s o l o n ，美国、) ；t r i z o lr n a 提取试剂盒，s u p e r s c r i p t 反转录试剂盒和g e n e r a t e r 试剂盒购自i n v i 仃o g e n 公司( 美国) ；琼脂糖购自 o x o i d 公司( 英国) 。 2 1 5 溶液配制 l b 液体培养基： 胰蛋白胨1 0g l ，酵母提取物5g l ，n a c l1 0g r l ，用2m o l ln a o h 调节p h 为7 o ，高温高压灭菌后4 c 保存； l b 固体培养基： 在l b 液体培养基中加入1 5 的琼脂粉，高温高压灭菌后4 c 保存； s o b 液体培养液： 胰蛋白胨2 0g l ，酵母提取物5g - l ，n a c l0 5 8g l ，k c lo 3 8e e l ，m g c l 2 6 h 2 0 0 2g l ，m g s 0 4 7 h 2 0o 2 5g l ，用5m o l ln a o h 调节p h 为7 o ，高温高压灭菌 后4 c 保存； t b 缓冲液： 1 0m m o l lk - m e s ，4 5m m o l lm n c l 2 ，1 5m m o l lc a c l 2 ，2 5 0m m o l lk c l ， 过滤膜( 0 2 2l a r a ) 灭菌后存于4 c ； o 电子科技大学硕士学位论文 1 0 x t b e 缓冲液： 称取1 0 8gt r i s ，7 4 4gn a 2 e d t a h 2 0 ，5 5g 硼酸，置于1l 烧杯中，向烧杯 中加入约8 0 0r n l 去离子水，充分搅拌溶解，加入去离子水将溶液定容至1l 后， 室温保存，稀释十倍作为电泳工作液； 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ) 储液： 1 0 0r a g m 1 ，溶于灭菌去离子水中，工作浓度1 0 0 删，置一2 0 c 保存； 溴化乙锭储液： 1 0m g r n i ，溶于灭菌去离子水中，剧烈振荡待充分溶解后，稀释成工作液浓度 1 删； 1 od e p c ( 焦碳酸- - 7 , 酯) 水溶液配制： 取1m ld e p c ，加入1l 去离子水中，搅拌过夜，分装后高压灭菌，4 0 c 保存， 并用1 d e p c 水分别配制7 5 的乙醇溶液用于r n a 提取过程。 2 2 实验方法与操作 2 2 1 总r n a 的提取 取新鲜草鱼组织至研钵内，加入液氮，研磨至粉末状( 对于脑和垂体，用针 筒反复吹打使组织完全溶于1 血t p j z o l 试剂) 。将1 0 0m g 1 5 0m g 各组织的粉末 转移至盛1m lz r i z o l 试剂的1 5i n l 离心管中，剧烈震荡1 5s e c 混匀，室温放置1 0 m i n 。按照加入2 0 0l a l 氯仿( t r i z o l ：氯仿= 5 ：1 ) ，震荡混匀，室温静置1 0 m i n ， 1 6 ，1 0 0 g4 c 离心1 5m i n 。将上清转移至一个新的离心管，加入5 0 0 山异丙醇 ( t r i z o h 异丙醇= 2 ：1 ) ，轻微混匀，室温静置5m i n ，1 6 ，1 0 0g40 c 离心1 5r a i n ， 弃上清。缓慢加入1m l7 5 乙醇( ，n 也o l ：乙醇= 1 ：1 ) ，充分洗涤沉淀，1 6 ，1 0 0 x g4 c 离心1 5r a i n ，弃上清。室温干燥沉淀，当沉淀颜色从白色转为透明时，加 入适量d e p c 处理的水，待r n a 沉淀完全溶解后置于液氮中保存或直接用于 r t p c r 。 2 2 2 反转录合成c d n a 模板 首先用紫外一可见分光光度计测量所提取的总t l n a 的浓度，取3 - 5 岭总r n a 1 0 第二章草鱼脑芳香化酶的e d n a 克隆 做为反转录p c r ( 2 0g , 1 体系) 的模板。按下列步骤加样：把所需r n a 的量补d e p c 处理的水至9 山，加入2 “1 的s u p e rr n a s ei n h i b i t o r 和1 山的o l i g o ( d t ) 18 ，混合均 匀，于6 5 反应5 r a i n ，放置在冰上至少2m i n ，然后，加入4 肛1 的5xr t p c rb u f f e r ， l 山的2 5i i 州斟t pm i x t u r e ，2 “l 的s u p e r r n a s ei n h i b i t o r 和1m 的m m l v ，混合 均匀，4 2 反应l h3 0 m i n ，之后于9 5 ，5 m i n 终止反应，合成的e d n a 可以置 于2 0 冰箱保存。 2 2 3 引物设计 引物设计原则： 引物长度常用为2 2 2 6 b p 左右；两个引物之间的相对位置，即扩增子的跨度以 2 0 0 - 2 0 0 0 b p 为宜，特定条件下可扩增长达1 0 k b 的片段。引物中的四种碱基( a 、t 、 c 、g ) 最好均匀随机分布，避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。g + c 含量以4 0 6 0 为宜，g + c 太少扩增效果不佳，g 屺过多易出现非特异条带。尽量 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3 端的互补( 可以通 过d n a m a n 软件进行相应的分析) 。否则容易形成引物二聚体，或产生非特异 的扩增条带。引物3 端的碱基，应该严格要求与扩增的目标基因配对，以避免因 末端碱基不配对而导致p c r 失败，引物3 端五个碱基中，g + c 含量最好不要超 过6 0 ，以免因3 端错配后不容易解链而导致的扩增失败。经n c b ib l a s t 比 对，所设计的引物应与核酸序列数据库中扩增靶基因以外的其他基因序列无明显 同源性。进行p c r 扩增实验时，每条引物的浓度0 1 1l g n o l 或1 0 - 1 0 0p m o l ， 以最低引物量产