（发酵工程专业论文）发酵液中核黄素分离纯化工艺的研究.pdf

中文摘要 本论文研究的主要内容是： 通过对核黄素性质分析研究，提出一种直接离心提取发酵液中核黄素的方法。 该方法分两个主要操作单元：核黄素粗提和粗结晶精制。粗提单元：首先对核黄 素发酵液进行热处理，冷却至常温后用h c i 调节发酵液至酸性。采用离心法使菌 体和核黄素结晶沉淀下来，用n a o h 溶液充分溶解核黄素沉淀，然后离心使核黄 素与菌体分离，最后通过氧化加热含有大量核黄素的上清液，得到核黄素粗结晶。 精制单元：用h c i 酸化核黄素粗结晶一定时间，然后热处理除去粗结晶中部分蛋 白等不溶物，离心得高纯度核黄素结晶。 在粗提单元中研究了不同提取工艺的条件优化：通过对不同热处理温度研究 得出在6 0 下，加热3 0 m i n 能极大提高核黄素的纯度和收率；核黄素的溶解度受 p h 值影响较大，在碱性条件下溶解度较大，在酸性条件下较小。研究表明核黄素 在发酵液p h = 3 时，能使发酵液中核黄素充分析出；通过不同离心条件研究表明 离心转速在9 0 0 0 r m i n ，离心时间1 0 m i n 时能达到很好的离心效果；对不同浓度 n a o h 溶解核黄素研究得出：当n a o h 的浓度为0 4 m o l l 时，不仅能充分溶解发 酵液中核黄素，而且还能保证核黄素不发生可逆变性；研究表明双氧水的浓度控 制在o 3 ( w v ) ，同时配合空气进行氧化能很好的提高收率：氧化温度为8 0 ， 氧化时间为2 h 能很好提高核黄素的粗收率和粗纯度。 精制单元通过不同条件的优化得出：以l g 核黄素粗结晶加入1 5 m 1 0 2 m o l l 的h c l 溶液，酸化4 小时，然后在7 5 下加热3 0 m i n 能极大提高核黄素的终纯度。 核黄素的最终收率在8 5 以上，纯度达到9 9 左右。 关键词：核黄素溶解度提取精制 a b s t i 认c t t h em a i nw o r kp r e s e n t e di nt h i ss t u d yi sa sf o l l o w s ： a n a l y s i so fr i b o f l a v i nb yt h en a t u r em a d ead i r e c tc e n t r i f u g a le x t r a c t i o no fr i b o f l a v i n f e r m e n t a t i o nb r o t hm e t h o d t h em e t h o dw a sd i v i d e di n t ot w om a j o ro p e r a t i n gu n i t s ： r i b o f l a v i nc r y s t a l l i z a t i o no fp r e - e x t r a c t i o na n dr e f i n i n gc r u d e c r u d eu n i t ：f i r s to fa l l h e a t - t r e a t e df e r m e n t a t i o nb r o t ho fr i b o f l a v i n ，w h e nc o o l i n gt or o o mt e m p e r a t u r ew i t h h c it oa d j u s tf e r m e n t a t i o nb r o t h m a d et h er i b o f l a v i na n dc e l l sp r e c i p i t a t i o nt h r o u g h c e n t r i f u g a t i o n m a d et h ep r e c i p i t a t i o nc o m p l e t e l yd i s s o l v e dw i t hn a o h ，t h e ns e p a r a t e d t h er i b o f l a v i nf r o mc e l l st h r o u g hc e n t r i f u g a t i o n ；l a s t , w eg o tt h ec r u d er i b o f l a v i n t h r o u g h h e a t e da n do x i d a t e dt h es o l u t i o nw h i c h i n c l u d i n g l o t so fr i b o f l a v i n c r y s t a l s r e f i n i n gu n i t ：m a d et h ec r u d er i b o f l a v i na c i d i f i c a t i o nw i t hh c l ac e r t a i np e r i o d o ft i m e ，t h e nh e a t e dt h es o l u t i o nt or e m o v es o m er o u g hc r y s t a l l i n ea n di n s o l u b l ep r o t e i n a n dg o tt h eh i g hp u r i t yr i b o f l a v i nt h r o u g hc e n t r i f u g a t i o n i nt h ec r u d eu n i td i f f e r e n tc o n d i t i o n sf o ro p t i m i z a t i o no fe x t r a c t i o np r o c e s sw a ss t u d i e d ： t h r o u g ht h es t u d yo fd i f f e r e n th e a tt r e a t m e n tt e m p e r a t u r ef o u n dt h a ta t6 0 ，3 0 m i n h e a t i n gc o u l dg r e a t l yi m p r o v et h ep u r i t ya n dy i e l do fr i b o f l a v i n ；t h es o l u b i l i t yo f r i b o f l a v i nw a sg r e a t l yi n f l u e n c e db yp h t h es o l u b i l i t yo fr i b o f l a v i nh a dq u i t el o wi n a c i d i cs o l u t i o nw h i l et h a th a dh i g hi na l k a l i n es o l u t i o n i ts h o w e dt h a tw h e nt h e f e r m e n t a t i o nb r o t h p h = 3t h er i b o f l a v i nc o u l df u l lo fp r e c i p i t a t i o n ；n l es t u d yo f d i f f e r e n tc e n t r i f u g a ls p e e ds h o w e dt h a t9 0 0 0 r m i n ，a t10 r a i nc e n t r i f u g a t i o nt i m ec o u l d a c h i e v eag o o dc e n t r i f u g a le f f e c t ；i tc o u l db ef u l l yd i s s o l v e dr i b o f l a v i na n da v o i d e d i r r e v e r s i b l ed e g e n e r a t i o no f t h er i b o f l a v i nw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no f n a o hi s0 4 m o l f l ； i th a db e e nf o u n dt h a tw h e nt h eh y d r o g e np e r o x i d ew a s0 3 ( w v ) c o m b i n e dw i t ha i r c o u l di m p r o v et h er e c o v e r yo fr i b o f l a v i n ；o x i d a t i o nt e m p e r a t u r ea t8 0 ，o x i d a t i o n t i m ef o r2 hc o u l di m p r o v et h ey i e l da n dp u r i t yo fc r u d er i b o f l a v i n r e f i n i n gu n i t , t h r o u g ht h eo p t i m i z a t i o no fd i f f e r e n tc o n d i t i o n so b t a i n e d ：a d d i n g15 m l h c ls o l u t i o nw h i c hc o n c e n t r a t i o nw a s0 2 m o l lt olgc r u d er i b o f l a v i na n da c i d i f i c a t i o n 4h o u r s ，t h e nh e a t e da t7 5 f o r3 0 r a i n ，w h i c hc o u l dg r e a t l yi m p r o vt h ep u r i t yo f r i b o f l a v i n t h ep u r i t yo ft h ep r o d u c tw a s9 9 a n dt h ey i e l do fr i b o f l a v i nw a sm o r et h a n h 8 5 k e y w o r d s ：r i b o f l a v i ns o l u b i l i t y e x t r a c t i o n r e f i n i n g 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：袁李灞 签字日期： 细9 年月牛日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丕鲞盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：哗月尹 日签字日期：纠年 月 笋日 第一章文献综述 1 1 核黄素简介 第一章文献综述 早在1 8 7 9 年，布力兹从乳清中首次分离出乳黄素( l a e f l a v i n ) 。1 9 1 3 年o s b o r n e 和m e n d e l l 查明鼠类生长中必需的“水溶性因素b ”。1 9 2 0 年，e m m e t t 用热处理 酵母提取液得到维生素b 2 1 1 。3 1 。1 9 3 3 年库恩( k u h n ) 等从鸡蛋中分离出核黄素； 同年，g e o r g e 从植物组织、动物肝脏和肾脏中也得到了类似的荧光物质，分别命 名为草黄色( v e r d o f l a v i n ) 及肝黄素( h e p a t o f l a v i n ) 。与此同时，w a r b u r g 和c h r i s t i a n 从酵母中分离出黄素一蛋白复合物( f l a v i n p r o t e i nc o m p l e x ) ，即黄酶( y e l l o w e n z y m e ) 。1 9 3 5 年核黄素的化学结构被鉴定，k u h n 等用化学合成的方法得到此荧 光色素，由于其分子中含有一个五碳糖核糖，故被命名为核黄素【年7 】。 核黄素( r i b o f l a v i n ) 是一种水溶性的b 族维生素，即维生素b 2 ，其分子式为 c 1 7 h 2 0 0 6 1 , 1 4 ，系统命名为7 ，8 一二甲基一1 0 ( 1 d 一核糖醇基) - 异咯嗪，核黄素 的结构式如图1 1 所示【8 】。 。 g h 2 0 h h 。k h o k 1 2 h o c h 1 1 c h c h 图1 - 1 核黄素结构式 f i g l l r i b o f l a v i n s t r u c t u r e d 核黄素即为维生素( v b 2 ) ，是生物生命活动中不可缺少的维生素之一，与人 体内碳水化合物、脂肪及氨基酸代谢有着密切的关系，对生物生长发育起着重要 作用。主要应用于临床口角炎、舌炎、口内炎、肛门炎、结膜炎及脂溢性皮炎等 缺乏维生素b 2 所引起的病症。近年来，国内外用于抗衰老和保健的多维制剂中 都含有v b 2 ，这类药物不仅限于治病也用于保健，提高机体的抗病能力和延年益 寿，目前国外临床上应用这类药物的各种制剂有2 0 0 多种，国内有3 0 余种 9 - 1 2 。 核黄素的另一个应用领域是作为饲料添加剂及化妆品等。英国l h a 公司公布 了一份研究报告，对目前全球维生素市场进行了评述，全世界维生素的销售总额 第章文献综述 2 0 亿美元，其中v a 、v c 、v e 三大类产品占市场的7 0 ，而核黄素在内的v b 族成交量较低，核黄素占市场规模在0 5 1 5 亿美金。但欧美发达地区的对核黄 素的需求量较高，而世界各地的养殖业的经济发展，人们对各种禽蛋肉类的需求 量的增加，对饲料添加核黄素的需求量的也随之增加【d q 4 ，根据2 0 0 5 年度全国1 0 0 张床位以上级别医院的统计，维生素市场在2 0 0 5 年达到1 8 4 亿元，按照2 0 的 增长率推算，2 0 0 6 年达到2 2 1 亿元，而其中，核黄素市场仅占0 7 7 ，约为1 7 0 2 万元，市场规模比较小，可见，近年来核黄素的消费结构并没有发生根本性变化 1 5 - 1 6 0 2 0 0 5 年6 月，国家发改委公众营养与发展中心宣布，我国将于2 0 0 5 年内推 出营养强化面粉国家标准，以规范生产，大幅度提高中国人口的营养健康水平， 即：从2 0 0 8 年开始将强制在面粉生产过程中添加维生素b 1 、核黄素、尼克酸、 叶酸、铁、钙和锌等7 种营养素，并推荐在食用油中添加维生素a 。即所谓的“7 + l ”营养强化面粉添加配方【丌。 由此我们看出，核黄素的潜在市场价值是非常大的，这也给我们的研究提供 了动力和市场导向。 1 2 核黄素的来源和生产 由于核黄素不能在动物和人类体内合成，只能在微生物和高等植物体内合成， 并且核黄素被世界卫生组织( w h o ) 列为评价人体生长发育和营养状况的六大指 标之一，因此人们必须从体外摄取核黄素。有两种途径：一种是从食物中摄取， 如：干酪，蛋，蘑菇尖，菠菜，芦笋，玉米，蚕豆，肝，鱼类中含v b 2 多的是鲽， 秋刀鱼，青花鱼；另一种就是从药物中摄取0 8 。但是作为核黄素的主要应用领域 饲料添加剂来说，仅从食物中摄取是远远不够的，因此我们必须加大工业生产的 投入和研发。 核黄素很早就实现了商业化生产。目前国际上生产核黄素的工艺方法主要有 四种：植物提取法，化学合成法，微生物发酵法和微生物发酵半化学合成法【l9 1 。 1 2 1 抽取法 核黄素是动植物中黄色酵素的主要成分。乳制品，牛肝脏，卵，酵母和蚕蛹 中均含核黄素，可从此等原料中萃取核黄素。但是这种方法只处在实验阶段，效 率低，产量不高，不适合大规模生产。 1 2 2 化学合成法 2 第一章文献综述 化学合成法一般以葡萄糖或d 一核糖作为起始原料，经氧化，成盐，转化， 酸化，内酯化，催化加氢，环化等过程制得核黄素。该生产方法对环境污染严重， 产品中含有难以根除的杂质和残留毒性，正是由于这些因素导致目前的核黄素生 产方法向生物发酵方向发展。成本高，环保处理困难，已逐步被淘汰。化学合成 法由3 ，4 二甲基苯胺与d 一核糖来合成【2 0 】。 1 2 3 微生物发酵法 微生物发酵法采用的原料主要为植物油，葡萄糖，糖蜜和大米等。用枯草芽 孢杆菌( 召s u b t i l i s ) ，棉囊阿舒氏酵母( a s h b y a g o s s y p i i ) ，解朊假丝酵母( c a n d i d a f a m a t a ) ，阿舒氏假囊酵母( e r e m o t h e c i u ma s h b y i i ) 等菌株来生产核黄素。目前工 业生产上多用的是经过基因改造的基因工程菌来进行核黄素发酵生产，这大大提 高了核黄素的产量。b a s f 公司主要采用豆油作为核黄素的生产原料。湖北广济药 业公司原先主要以糖蜜作为核黄素生产原料，但是糖蜜的供应却难以保障，因此 广济药业公司投资1 8 亿开发了以大米代替糖蜜生产核黄素的新工艺，降低了原料 成本，而且还扩大了核黄素的生产规模( 大米糖化生产线也在2 0 0 2 年元旦正式建 成投产) 。采用新工艺后工厂成本从4 0 万元吨下降到2 0 万元吨。由于微生物发 酵法生产核黄素具有工艺简单，成本低廉，环境污染小，易于分离提纯等优点而 被许多核黄素生产厂商所青睐1 2 1 。2 3 1 。 1 2 4 微生物发酵与化学合成结合法 此方法中和了微生物发酵法和化学合成法，但所添加的化学助剂，残留太高， 难分离。不适合大规模生产。d 一核糖是半微生物发酵半化学合成法生产核黄素的 重要中间产物2 4 1 。 1 3 核黄素在微生物体内的合成途径 核黄素是异咯嗪的衍生物，在异咯嗪环的6 ，7 位上有两个甲基，9 位n 上连着 一个核糖醇。核黄素在不同生物种类的体内合成过程并不完全相同。目前对大肠 杆菌，枯草芽饱杆菌以及一些酵母中的核黄素合成途径了解得比较清楚。菌体通 过e m p 途径和h m p 途径，形成复杂的代谢流。在e m p 途径中茵体降解葡萄糖 为丙酮酸同时产生能量a t p ，而i - i m p 途径是菌体核黄素生物合成的主干代谢流， 因此适当调整菌体代谢中e m p 途径，h m p 途径碳架物质流的比例即适当加大 h m p 途径碳架物质与能量的代谢流，将很可能有利于核黄素的过量合成【2 5 之刀。如 图1 2 所示： 第一章文献综述 e m ph m pc 甘油酸 l 王 l 磷酸烯醇 r 丙酮酸 - 磷酸核糖焦 磷酸( p r p p ) 土 5 磷酸核糖 基r 肌了酸 鸟三磷( 土 2 , 4 , 5 - 三氨萋6 一羟 基吡啶( e r r f ) 2 ，5 一= 氨基6 一羟基4 _ 核糖基 始吡气 5 一氨基2 ，6 - 二羟基4 - 核糖基 氧基吡啶( a d r a p ) 上 6 7 - ：甲基- 8 - 核醇基二氧四氢 黻胍) 核 f m n 分泌到菌体外 j 图1 - 2 核黄素生物合成途径 f i gl 一2 r i b o f l a v i nb i o s y n t h e t i cp a t h w a y 研究表明，甲酸酯，c 0 2 与甘氨酸都加入核黄素分子中，并由这些物质出发 经过嘌呤成为核黄素，而且己证明g t p 是核黄素的真正前体。若以葡萄糖为出发 底物，整个合成代谢途径可分成9 个阶段， l ，由葡萄糖出发，经h m p 途径生戒5 一磷酸核搪，在焦磷酸激酶的催化下与a t p 作用，生成5 磷酸核糖焦磷酸( p l 心p ) 。 4 第一章文献综述 2 ，p r p p 在p r p p 转酞胺酶的作用下生成5 磷酸核糖基胺( p r a ) 。 3 ，p r a 经过一系列反应生成肌苷酸( i m p ) 。 g ，i m p 经过一系列反应生成鸟苷三磷酸( g t p ) 。 5 ，g t p 在g t p 环解酶的作用下裂解，生成2 , 4 ，5 一三氨基6 羟基嘧啶( h t p ) ，同 时失去磷酸核糖。 6 ，h t p 与核糖醇c d p 作用，生成2 ，5 一二氨基6 羟基4 一核糖基氨基嘧啶 ( d h r a p ) 和c d p 。 7 ，d h r a p 放出n h 3 ，生成5 一氨基2 ，6 一二羟基4 - 核糖基氨基嘧啶( a d r a p ) 。 8 ，a d r a p 与3 羟基丁酮缩合，生成6 ，7 一二甲基一8 一核醇基一二氧四氢蝶啶 ( d m r l ) 。 9 ，最后，d m r l 在核黄素合成酶的作用下，形成核黄素( r i b o f l a v i n ) 。 1 4 核黄素提取纯化工艺研究 核黄素的生产既有化学合成法，又有生物技术法，不过从安全的角度来讲生 物生产法占优势，但生物法杂质含量相对较高。而对于产核黄素基因工程菌发酵 液而言，核黄素的分离纯化即发酵液后处理或下游加工过程( d o w ns t r e a m p r o c e s s i n g ) ，是生物工程中的一个重要组成部分，不但决定产品质量和安全性， 也决定着产品的收率与成本，是一项技术性极强的工序。可以说，没有成功的下 游加工工艺就不会有产业化规模，分离纯化过程是生物工程中的重要手段和环节。 成熟的核黄素发酵液中除含有针状晶体的核黄素外，还含有菌体，细胞碎片 以及核酸，蛋白质以及其他有机粘性物质，黏度很大，给核黄素的分离精制带来 较大困难。核黄素的分离提取过程是整个生产的关键，不仅分离纯化的步骤多， 不易获得高收率，而且常要耗用较大的资金 4 3 - 4 5 】。据b a s f 公司估计，对微生物 发酵法生产核黄素来说，核黄素的分离提取与纯化成本约占整个生产成本的4 0 以上，因此探索一条高效，简约的核黄素提取纯化工艺路线显得尤为重要。 从核黄素发酵液中提取核黄素的方法主要有卜羟基一3 _ 萘甲酸法，重金属 盐沉淀法，m o r e h o u s e 法，酸溶法，碱溶法等。图1 3 所示方法为发酵液中分离提 取核黄素经典方法m 】，该方法首先将核黄素发酵液用稀盐酸水解，释放部分与蛋 白质结合的核黄素；然后加黄血盐和硫酸锌，除去蛋白质等杂质；加入2 - 羟基一 3 一萘甲酸钠，使之与核黄素形成复盐，最后分离精制即可。酸溶法提取核黄素的 能耗较大，经一次溶解，分离，结晶获得的产品纯度只有6 0 7 0 ，张国胜应 用该方法从核黄素枯草芽胞杆菌发酵液中分离提取核黄素，核黄素收率为5 6 6 1 【4 7 1 。 第一章文献综述 酸化，沉淀 心奈 嬲 酸液，过滤 碱液，过滤 上 滤渡 i 转晶，过滤 i 结晶 干燥，过筛 水 水，结晶，p l l 鼬 ，8 0 日 图1 3 核黄素分离提纯流程图 f i gl - 3 f l o wc h a r to fs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fr i b o f l a v i n 第一章文献综述 由于核黄素的提取工艺与生产实践联系比较紧密，因此有关此方面的研究多 以专利的形式出现。在理论上进行的研究多从单因素考虑，而没有一个整体的连 贯性的提取操作。并且随着菌种和培养基的不同，+ 很难在实际生产中推行一个标 准的行之有效的提取工艺。各工厂都根据自己的实际情况进行调整，优化探索出 一套适合本公司的提取方案。 1 4 1n o r e h o u s e 法 1 9 5 8 年专利号u s 2 8 2 2 3 6 1 该方法是一种传统的分离方法其步骤包括l ：调节 核黄素发酵液p h 值为4 - - - 5 ，加热进行巴氏灭菌。2 ：过滤分离发酵液中的细菌残 体等杂质。3 ：往滤液中加入n a s z 0 3 还原核黄素，加碱调节p h 值到9 5 溶解还原 的核黄素。4 ：在高p h 溶液中氧化还原的核黄素。5 ：调节溶液p h 值至4 o 7 5 ， 使核黄素沉淀，过滤出核黄素晶体。6 ：过滤使核黄素沉淀从母液中分离。这种方 法适用于较低浓度的核黄素发酵液，因为它是通过加热使核黄素溶解，当浓度高 于l g l 的时，需要大量稀释后才能进行提纯，不适宜于大规模的工厂应用。用该 方法可得产品纯度达8 7 以上。 1 4 2 酸解法 1 9 9 6 年欧洲专利介绍了酸解法提取核黄素的工艺，其步骤如下：l ：将发酵液 于5 0 7 0 摄氏度下加热4 5 分钟，杀死菌体，降低液体的粘度。2 ：对加热后的发 酵液在2 5 0 0 9 下离心2 3 次，使密度较大的核黄素晶粒与较轻的生物质和无机盐 分离。3 ：核黄素悬液在0 1 至2 的硫酸或盐酸中加热至8 0 摄氏度以上保持8 1 6 h ，降解其中的参与的蛋白质和核酸分子。4 ：酸调节后的核黄素溶液中杂质已 经大大减少，可用过滤和洗脱进行分离，所得晶体纯度可达9 9 】。 1 9 9 7 年费哈夫曼一拉罗切有限公司发表的一篇专利，公开号c n11 4 6 4 5 5 a 。 介绍了一种从发酵后肉汤中回收和纯化核黄素的方法【4 引。该方法主要也是利用酸 溶法来进行核黄素提取。该方法首先把发酵液于6 0 加热3 0 分钟进行巴氏灭菌， 然后将发酵液通过滗析器进行离心分离，通过三次离心分离后可得到8 7 4 的核 黄素纯度( 每次离心的参数有所不同) 。将得到的核黄素浆液用盐酸液溶溶解，其 中固含量3 9 h c l 含量0 6 ( 重量比) ，加热到1 2 0 1 2 5 ，保持3 0 分钟，然 后冷却到8 0 。通过橡胶衬里离心机进行离心，然后在对离心液进行酸溶，并加 入核黄素晶种和活性炭，搅拌一小时后用带金刚石滤器的橡胶衬里滤器过滤，过 滤后将滤液倒入已经加热到7 8 8 2 玻璃衬里的结晶容器中进行热结晶，并在不 断搅拌下使混合物降到4 0 然后将结晶混合物稀释后攻入搅拌卸料滤器中。用离 心机在9 5 0 叩m 下离心稀释浆液。每次离心时都要用去离子水进行冲洗以减少损 7 第一章文献综述 失。最后将核黄素滤饼装入锥形干燥器内并在6 0 - - - 3 5 m m h g 压力下，于6 8 - - - 7 2 干燥8 小时。此时可得到纯度9 8 的核黄素。 酸解法所得产品纯度高，但消耗大量酸和热能，并且对仪器设备腐蚀严重， 对环境污染大，切成本较高。工艺流程图如下： 发酵藏 水解 i压滤 2 ，3 酸钠核黄素 酸化上沉降，压滤 2 ，3 酸核黄素 酸溶 1分离 核黄素酸溶液 l 氧化1 l 过滤 氧化液 上 结晶 土 核黄素粗品 上 分离 上 粗结晶 转晶j r 过滤 湿结晶 上干燥过筛 成品 图l - 4 酸法提取核黄素流程图 f i g l - 4f l o wc h a r to fr i b o f l a v i na c i de x t r a c t i o n 1 4 3 滗析分离法 b a s f 公司申请的中国专利c nl0 5 36 1 2 中介绍了一种全封套并有螺旋输送 器的沉降式离心机h 卵( 如图1 5 所示) 。该方法首先将核黄素悬浮液在6 0 - 7 5 下 加热l 3 小时，使核黄素小颗粒转化为较大的晶体。然后于1 5 小时的过程中 将其冷却至0 一3 0 c ，继而进入滗析器。料液离心后得到液体部分和沉降部分。液 体部分实际上不含结晶核黄素，通过溢流出口排出滗析器。沉降物部分从溢流槽 底部排出，其主要含固体核黄素晶体，需要时可按每份以0 5 2 份( 体积) 的水 将沉降物进行再悬浮并重复进行上述分离步骤，进一步纯化核黄素。如再用无 第一章文献综述 图1 5 全封套并有螺旋输送器的沉降式离心机 f i g l - 5f u l l - p a c k e td e c a n t i n gc e n t r i f u g ew i t hc o n v e y e ra u g e r l 离心机转筒c e n t r i f u g eb a s k e t 2 螺旋输送器c o n v e y e ra u g e r 3 圆筒形沉降部分c y l i n d e rs e d i m e n t a t i o np a r t 4 锥形脱水部分t a p e rd e h y d r a t i o np a r t 5 悬浮液入口s u s p e n s i o ne n t r y 6 可调式溢流高度z o o mt y p eo v e r f l o wh i g h n e s s 7 溢流直径o r e r f l o wd i a m e t e r 8 沉降物排放直径p r e c i p i t u md i s c h a r g ed i a m e t e r 9 放液口d i s c h a r g es i d e 1 0 沉降物排放口p r e c i p i t u md i s c h a r g es i d e 9 第一章文献综述 机酸处理后过滤精制，所得核黄素纯度不低于9 6 。因为分离是在滗析器中进行， 所以对滗析器的设计要求较高。 在使用滗析器进行核黄素发酵液分离时有些关键因素是必须要考虑的，如：核 黄素的结晶类型和结晶的大小，必须是能够与菌体分离；发酵液的质量是否在粘 度上允许核黄素结晶有很好的沉降能力；离心设备中离心机的转桶的形状和旋转 速度是否能够将结晶甩到旋转的桶壁上能够将液体滗析出来，螺旋输送器的旋转 差速度能够将固体份推出排料口，溢流高度和悬浮液的通过量的参数等。只有这 些综合的参数合适配合才能够达到预想的结果 2 0 0 4 年d s m 公司申请的世界专利( w 0 2 0 0 5 0 1 4 5 9 4 ) 报道了有关核黄素提取 工艺中所得到的结晶进一步提纯精制的部分内容。在这个工艺中使用的微生物为 e r e m o t h e c i u ma s h b y i i ，这种菌属发酵过程较长并产生的生物量往往大于b a c i l l u s s u b t i l i s 菌属的生物量，在提取过程中会由于发酵液中过量的生物量残片或细胞内 释放物质而影响结晶的纯度，而且结晶过程的不同结晶类型影响纯度和结晶的稳 定性。 该专利主要是通过制定出滗析器分离的各种参数，然后进行液体的分离将大 部分细胞内释放的生物物质随液体分离出去；然后在对发酵物浆体进行酸化并加 热到9 5 1 1 5 ，使残余的生物物质或蛋白、脂类、d n a 等分解被除去，收集核黄 素晶体，最后将酸化的反应浆体进行酸化过滤，获得最终的纯化晶体。在这个过 程中有相当多的杂质是无法除去的，特别是d n a 等小分子物质，这份专利中对结 晶的不同类型进行研究和总结提出有效的手段和检测方法。 1 4 4 絮凝法 发酵液中存在大量细胞碎片、蛋白质及核酸等大分子物质，粘稠度十分高， 因此，考虑采用絮凝处理以便于进行固液分离除去发酵液中菌体等杂质 3 6 - 3 9 】。研 究表明对复杂组分发酵液的絮凝，用做絮凝剂的聚电解质，其电荷密度越高，分 子量越大，絮凝能力越强。有报道称用有高电荷密度的壳聚糖以及分子量为( 1 2 ) 1 07 d a l t o n 的阳离子聚丙烯酰胺对细菌发酵液的絮凝，除菌率可达到9 0 以上 1 a o - 4 2 o 2 0 0 5 年浙江钱江生物化学股份有限公司发表的一篇专利：维生素b 2 的提取 方法。专利号c n1 6 8 7 0 6 9 a 该专利通过加入氯化钙，磷酸氢二钠和聚丙烯酰胺进 行絮凝，过滤后加入双氧水沉析，然后结晶，重结晶博。 具体步骤如下：首先按l ：1 加水稀释核黄素发酵液，用液碱调节p h 值至1 1 8 ， 使之溶解。然后往料液中加入氯化钙，磷酸氢二钠和聚丙烯酰胺进行絮凝，加入 量分别为料液的0 4 ，0 4 和2 5 ( 聚丙烯酰胺应先配成o 5 的水溶液再加入) 。 l o 第一章文献综述 在所得滤液中加入o 2 o 2 5 的双氧水，通空气鼓泡搅拌，时间为3 0 m i n - - - l h 。 同时用盐酸调节p h 值至4 0 - - 4 2 ，使固体析出。静止沉淀，将上清液倒去一半， 下层物料加热至沸腾，在迅速冷却过滤，得维生素b 2 粗结晶。然后加入1 3 - - - 1 5 倍的水稀释粗结晶，用液碱调节p h 至1 1 8 ，使之溶解，再过滤。然后再进行一次 氧化结晶，稀释过滤。可得到v b 2 的重结晶。在6 0 摄氏度下烘干，粉碎后用8 0 目筛过筛。此方法可使核黄素的收率达到8 5 - - 8 7 ，产品纯度可达9 8 - - - , 10 0 。 该方法在加入絮凝剂后没有采用离心或版框过滤来分离不容菌体和一些沉淀 物来进行固液分离，减少了能量消耗。在核黄素精制过程中没有采用高温水解， 只是简单的通过反复进行氧化结晶，溶解稀释而达到高纯度的核黄素，又进一步 减少了能量的消耗。 1 4 5 微膜过滤法 2 0 0 4 年，上海凯赛生物技术研发中心有限公司，李乃强等发表专利：核黄素 发酵液的提取工艺。公开号c n1 7 6 5 8 9 7 a 。该专利公开了一种核黄素发酵液的提 取工艺，包括发酵液的预处理，膜过滤，酸化，氧化和转晶等步骤，并采用回收 工艺对酸化母液中的核黄素予以回收1 5 州。 具体做法是( 1 ) 将发酵液进行预处理，发酵液进行盐酸处理p h 调节5 o 7 0 ，随之用碱液进行处理，调节p h l o 1 3 ，使发酵液中的核黄素结晶充分溶解。 ( 2 ) 将碱调节后的发酵液进行微膜过滤，此时的微膜可以采用有机膜、无机膜或 陶瓷膜等材料，压滤温度控制在4 - 3 5 时压入微膜，压入的压力为0 2 0 5 m p ， 此时的出膜压力应在0 1 0 2 m p 压力下。( 3 ) 经过微膜过滤后的滤液加入盐酸调 节p h 至4 o 7 0 ，( 4 ) 充分搅拌的情况下加入氧化剂进行氧化，搅拌时间l 2 小时。( 5 ) 将充分氧化的发酵滤液进行加热处理，温度控制在7 5 - 9 0 ，充分搅 拌1 2 小时，之后迅速冷却至2 5 3 0 ，结晶后的滤液进行离心，收集结晶品或 进行板框过滤，当结晶工艺中加入适当的有机熔剂，研究发现乙醇的回收率较高， 可达5 3 。通过这种以酸溶氧化的提取工艺可以获得含量9 5 的核黄素产品，提 取收率约9 0 ，得到的产品可以用于医药级和饲料级的应用。 2 0 0 8 年南京九思高科技有限公司，刑卫红，仲兆祥等人发表的一篇专利介绍 了采用纳滤膜回收结晶母液中溶解性核黄素的方法晦别。该方法首先将发酵液与其 体积比为2 5 倍的p h 为1 2 1 3 的碱液混合搅拌，调节p h 至为1 l 1 3 ；碱调时 间为0 5 - - 5 m i n 。然后将上述混合液进多级微滤或超滤膜分离设备进行连续过滤和 洗涤，往上述膜过滤的渗透液中加入无机酸和氧化剂，调节核黄素水溶液的p h 值 至4 - - - 6 ，氧化还原电位值至5 5 0 - - - , 7 7 0 m v 。控制稳定化处理后溶液的温度为4 1 0 ，并在溶液中按稳定化处理后溶液质量0 0 1 - - 0 0 5 的质量百分比加入核黄素晶 第一章文献综述 体，搅拌1 3 h 得结晶母液。将此结晶母液进微滤或超滤膜分离设备进行过滤， 浓缩液进行干燥，制成核黄素成品。 通过将核黄素发酵液经过调碱，多级连续膜过滤，洗涤除杂，稳定化处理， 结晶，膜分离浓缩晶体等步骤直接得到含有高于9 8 的核黄素产品，其中膜分离 浓缩晶体步骤的渗透液进膜分离回收步骤，采用纳滤膜回收结晶母液中的溶解性 核黄素，渗透出水经深度处理回收利用，或达标排放，整个工艺的产品收率高于 9 5 。具体实验流程如下图所示 图1 - 6 纳滤法提取核黄素流程图 f i g l - 6f l o wc h a r to fn a n o f i l t r a t i o ne x t r a c t i o no fr i b o f l a v i n 1 4 6 碱溶法 由g y u r e 等1 9 8 9 年申请1 9 9 2 年批准的美国专利u s5 1 0 30 0 5 提出用碱性溶 液溶解核黄素，然后在溶液中加氧化剂，最后再用酸液调整p h 值，使核黄素沉淀 析出1 3 引。g y u r e 等在专利w o91 0 13 2 0 中较详细叙述了碱溶工艺，先调整发酵液 的p h 值高于1 0 ，进而用超滤方法除去菌体，然后加入氧化剂，使核黄素处于氧 化状态，并将溶液p h 值下调至3 0 1 0 0 ，然后仍采用超滤获得核黄素产品【3 3 】。 1 9 9 8 年，无锡轻工大学章克章等对核黄素的溶解度进行了研究，p h 对核黄素 溶解度的影响极大，特别是在p h 值达到1 1 0 以后，值只要8 i 曼d , 的变化，核黄素 的溶解度就会产生很大的波动。调节溶液的p h 值在1 1 3 - 1 2 2 的范围内，核黄素 的溶解度在5 0 0 0 - - 2 0 0 0 0 m g l 之间，如下表所示。该质量浓度范围已覆盖目前发 第一章文献综述 酵生产核黄素的最高质量浓度，而且溶解时间极短，一般不超过5 m i n t 3 4 1 。 表l - l核黄素在不同p h 值条件下的溶解度( 2 5 c ) t a b l - 1r i b o f l a v i ns o l u b i l i t ya td i f f e r e n tp hv a l u e s ( 2 5 。c ) 根据研究结果，提出了采用碱溶法来分离提纯核黄素，具体流程如下： 图1 7 碱溶法提取核黄素流程图 f i g l 一7 f l o wc h a r to fr i b o f l a v i nd i s s o l v e di na l k a l ie x t r a c t i o n 碱溶法提取核黄素不仅收率高，而且能耗低。在碱性溶液中核黄素的溶解度 很大。在温度低于3 0 ，避光和p h 值1 3 0 的条件下，存放3 0 r a i n ，发酵液中 的核黄素由于分解造成的损失不会超过3 。调节发酵液的p h 值在1 1 8 1 3 0 之 间，可以充分溶解其中的核黄素，经离心可以较方便地除去发酵液中的菌体和其 他杂质。离心获得的上清液回调到偏酸性值在3 0 - 5 0 之间后，核黄素溶解度大 第一章文献综述 幅度下降( 约2 0 0 m g l ) 晶体大量析出。以质量浓度为6 4 0 0 m g l 的核黄素发酵液 为原料，用碱溶法，经二次分离结晶，最终获得的成品纯度达到9 2 6 ，总收得 率接近8 0 。随着离心分离设备的不断改进，碱溶法分离提取核黄素的优越性将 越来越明显。 然而碱溶法也存在一些问题，在实际操作中有很多需要注意和改进的地方， 主要是由于在碱性条件下核黄素容易发生不可逆变性反应，表现为不稳定性较差， 如果控制不好，就会造成损失。在研究碱溶性条件下核黄素的稳定性问题上发现： 溶液的温度，避光条件，溶液的p h 值，核黄素在溶液中的作用时间和核黄素的浓 度等对核黄素的稳定性都有影响。研究证明，在避光，低温，高核黄素初始浓度 以及短作用时间等条件下进行碱溶法提取核黄素是非常有效的。 对于产核黄素基因工程菌发酵液，当发酵到一定程度时，核黄素以针状晶体 从发液中析出，悬浮或沉于发酵液中。此外，发酵液中还含有菌体，细胞碎片， 核酸，蛋白质及其他有机粘性物质，发酵液粘度大。有关发酵液中核黄素的分离 提取较详细的资料以专利文献为主，天津大学李文钊博士收集、分析并归纳整理 发酵液中核黄素的分离与纯化方法【5 3 1 ，如图i - 8 所示： 发酵液 发酵液预处理 i 加热石冷却氧化回收 活性炭吸附后过滤 重结晶 图1 8 核黄素发酵液分离提纯方法汇总图 f i g l 一8m e t h e d so fs e p a r a t i o na n du r i f i c a t i o no fr i b o f l a v i nf e r m e n t a t i o nb r o t h 1 4 第一章文献综述 1 5 本文的主要研究内容 根据国内外核黄素提取研究的情况以及本实验室在此项研究的基础上，我们 提出一条高效，简捷的核黄素发酵液提取工艺，即酸碱结合直接离心法。 本文的主要研究内容如下： ( 1 ) 核黄素发酵液的制备以操作控制。 ( 2 ) 通过酸碱结合的方法提取核黄素。 ( 3 ) 优化提取过程中的相关条件。 ( 4 ) 探索核黄素粗结晶精制的条件。 第二章实验材料和实验方法 2 1 实验材料 第二章实验材料和实验方法 2 1 1 菌种及培养基 2 。1 1 1 菌种 本实验室构建的枯草芽孢杆菌工程菌 2 1 1 2 培养基 l b 固体培养基： 胰化蛋白胨1 ，酵母抽提物o 5 ，氯化钠l ，琼脂1 5 9 l ，p h 7 5 。 种子培养基： 葡萄糖2 ，硝酸钠1 ，硝酸铵0 7 ，七水硫酸镁0 1 5 ，磷酸二氢钾o 1 ， 磷酸氢二钾o 2 ，酵母抽提物0 4 ，氯化亚铁2 m g l ，硫酸锌2