（发酵工程专业论文）云芝液体深层发酵天冬氨酸蛋白酶抑制剂的研究.pdf

摘要 摘要 本论文主要对云芝液体深层发酵天冬氨酸蛋白酶抑制剂的发酵条件、分离纯化及基 本特性等进行了研究，丰要结果如下： 对甜芝、云芝、韩芝、赤芝g 8 等4 株菌进行平板培养，比较菌丝体牛长速度，其 中云芝和赤芝g 8 牛长最快，速度约为1 3 7 m m d ，且云芝菌丝体最密，相比之下生长 最慢的韩芝只有5 0 m m d 。 对4 株菌进行液体深层发酵，生物量以云芝最高，约为1 5 0 6 9 l ，是韩芝的2 8 3 倍； 将发酵液进行真空旋转蒸发浓缩干燥成粉及真空冷冻t 燥成粉，然后再进行热水抽提、 乙醇沉淀，比较所得物质对胃蛋白酶的抑制效果，仍以云芝发酵组最好，冻干粉抽提液 3 0 8 0 醇沉区段的沉淀对胃蛋白酶的抑制率可达2 9 3 ，烘- 丁粉同样处理后也能达到 2 0 左右。 比较了云芝发酵液细胞破碎前后对胃蛋白酶的抑制效果，破碎后对胃蛋白酶的抑制 率由破碎前的0 5 3 提高到3 7 2 ，说明云芝胞内确实存对胃蛋白酶起抑制作用的物质。 研究了超声波细胞破碎条件对云芝胞内天冬氨酸蛋白酶抑制剂提取的影响，确定最 佳超声条件为：超声时间1 0 m i n 、超声功率3 0 0 w 、处理量4 0 m l 、超声温度2 0 。 从细胞破碎液中分离得一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂( c v p i ) ，建立了云芝胞内天冬 氨酸蛋白酶抑制剂的纯化制备工艺为：摇瓶发酵细胞破碎大孔树脂d 1 0 1 脱色d e a e 5 2 离子交换层析a c a 5 4 分子筛层析进行c v p i 的纯度鉴定及分子量测定。 凝胶过滤测定c v p i 的相对表观分子量约为2 3 4 4 2 ，主要成分为糖和蛋白质，蛋白 比糖约为2 5 ：c v p i 热稳定性较好，1 0 0 保温3 0 分钟后抑制活性几乎没有损失；c v p i 的p h 稳定范围为3 5 7 5 ；抑制活性受温度影响不大，0 1 0 0 基木稳定；抑制效果 在2 小时内随反应时间延长上升较快，2 小时后基本不再升高；抑制剂底物特异性研究 表明，c v p i 对天冬氨酸族的蛋白酶抑制活性较高，以对胃蛋白酶的抑制效果最强；c v p i 对胃蛋白酶和蛋白酶a 作用时的k i 值分别分别为0 8 2 ，1 3 2 p m o l l ；c v p i 对胃蛋白酶 和蛋白酶a 的半抑制浓度i c 5 0 值分别约为1 5 和2 9 1 t g m l ；动力学方法研究 ( l i n e w e a v e r - b u r k 作图法) 发现，c v p i 是胃蛋白酶的非竞争与反竞争混合型抑制剂， 是蛋白酶a 的竞争与反竞争混合型抑制剂。 利用单因素实验，找到云芝液体深层发酵c v p i 的丰要影响因子为接种量、起始p h 和装液量。 在单因素实验的基础上，采用响应面分析法，对培养条件进行了优化，得最佳培养 条件：发酵温度为2 6 ，发酵时间为1 2 0 小时，转速1 7 0 r m i n ，装液量为7 1 3 l m l 2 5 0 m l ， 起始p h 为5 9 7 ，接种量为1 3 9 6 。优化后的抑制剂产量为1 0 1 3 i u m l ，比优化前提高 了1 7 2 3 。 关键词：云芝、液体深层发酵、天冬氨酸蛋白酶抑制剂、基本特性、动力学分析、半抑 制浓度、响应面分析 a b s t r a c t a b s t r a c t t h er e s e a r c hm a i n l yf o c u s e do nt h ef o l l o w i n ga s p e c t sa b o u ta s p a r t i ca c i dp r o t e a s e i n h i b i t o rf r o mc o r i o l u sv e r s i c o l o rb ys u b m e r g e df e r m e n t a t i o n ，i n c l u d i n gf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ，e x t r a c t i n g ，p u r i f i c a t i o na n dt h eb a s i cp r o p e r t i e s c o m p a r e dt h em y c e l i u mg r o w t hr a t eb yp l a t ec u l t u r e ，c o r i o l u sv e r s i c o l o r a n d g c t n o d e r m al u c i d u mg - 8g r e wt h em o s tr a p i d l y , a b o u t13 7 m m d ，a n dt h em y c e l i u mo f c o r i o l u sv e r s i c o l o rw a st h em o s td e n s e ，g a n t h e r a ml u c i d u mg r e wt h em o s ts l o w l y , a b o u t 5 0 m m d c o m p a r e dt h eb i o m a s so fd i f f e r e n tf u n g ib ys u b m e r g e df e r m e n t a t i o n ，t h em y c e l i u md r y w e i g h to fc o r i o l u sv e r s i c o l o ri st h em o s th e a v y15 0 6 9 l ，i sa b o u t2 8 3t i m e so fg a n t h e r a m l u c i d u m ；d r i e dt h ef e r m e n t a t i o nb r o t hb yr o t a r yv a c u u md r y i n ga n dv a c u u mf r e e z ed r y i n g i n t op o w d e r , a n dt h e nb yh o tw a t e re x t r a c t i o n ，e t h a n o lp r e c i p i t a t i o n ，e v e n t u a l l y , c o m p a r e dt h e i n h i b i t i o nr a t eo fe x t r a c te f f e c to np e p s i n ，c o r i o l u sv e r s i c o l o ri ss t i l lt h eb e s to n e ，t h e i n h i b i t i o nr a t eo fe x t r a c tf r o mp o w d e rb yv a c u u mf r e e z ed r y i n ge f f e c to np e p s i nw a sa b o u t 2 9 3 a n da b o u t2 0 b yr o t a r yv a c u u md r y i n g c o m p a r e dt h ei n h i b i t i o nr a t eo fc o r i o l u sv e r s i c o l o rb r o t hb yp r e a n dp o s tc e l ld i s r u p t i o n e f f e c to np e p s i n ，a f t e rc e l ld i s r u p t i o nt h ei n h i b i t i o nr a t ei m p r o v e df r o m0 5 3 t o3 7 2 ，i t w a ss u g g e s t e dt h a tt h ei n t r a c e l l u l a ro fc o r i o l u sv e r s i c o l o rc o n t a i n st h ep e p s i ni n h i b i t o r s t u d i e do nu l t r a s o n i ct i m e ，u l t r a s o n i cp o w e r , u l t r a s o n i ct r e a t m e n tc a p a c i t ya n du l t r a s o n i c t e m p e r a t u r e ，t h eb e s tu l t r a s o n i cc o n d i t i o n sw a sd e t e r m i n e da s10m i n u t e so fu l t r a s o n i ct i m e ， 3 0 0 wo fu l t r a s o n i cp o w e r , 4 0 m lo fu l t r a s o n i ct r e a t m e n tc a p a c i t ya n d2 0 。co fu l t r a s o n i c t e m p e r a t u r e o n ek i n do fa s p a r t i ca c i dp r o t e a s ei n h i b i t o rc v p lw a sp u r i f i e d ，t h ep u r i f i c a t i o nw a s c a r r i e do u tb ys h a k i n gf l a s kf e r m e n t a t i o n - c e l ld i s r u p t i o n - d e c o l o r a t i o nb ym a c r o p o r o u sr e s i n d101 一d e a e 5 2i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a m u l t r o g e la c a 5 4g e l f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a m ， r e s p e c t i v e l y t h em o l e c u l a rm a s so fc v p lw a s2 3 4 4 2a se s t i m a t e dv i ag e lf i l t r a t i o n ；t h ei n h i b i t o r s h o w e dar e m a r k a b l eh e a ts t a b i l i t y , i tr e t a i n e di t si n i t i a la c t i v i t ye v e na tu pt o10 0 f o r3 0 m i n ；t h ep hs t a b i l i t yr a n g eo f c v p ii sa b o u t3 5 7 5 ：t h ei n h i b i t o rr a t ei m p r o v e dq u i c k l yi n 2h o u r st i m eo fi n h i b i t o r yr e a c t i o n ，a n di n p r o v e dh a r d l ya f t e r2h o u r sl a t t e r ；b yi n v e s t i g a t i n g t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h i si n h i b i t o ra n dv a r i e t yo fp r o t e i n a s e s i tw a si n d i c a t e dt h a tt h e i n h i b i t o rw a sm o r es p e c i f i ca g a i n s ta s p a r t i ca c i d p r o t e i n a s e ( s u c ha sp e p s i na n dy e a s t p r o t e i n a s ea ) t h a no t h e rp r o t e i n a s e s ；t h ed i s s o c i a t i o nc o n s t a n t s ( k i ) a n dc o n c e n t r a t i o n r e q u i r e df o r5 0 i n h i b i t i o n ( i c 5 0 ) f o rp e p s i nw e r e0 8 2 i t m o l la n d15 t g m l ，a n dt h e d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t s ( k i ) a n dc o n c e n t r a t i o nr e q u i r e df o r5 0 i n h i b i t i o n ( i c s o ) f o rp r o t e i n a s e aw e r e1 3 2 1 a m o l la n d2 9 1 a g m l ；k i n e t i cs t u d i e s ( l i n e w e a v e r - b u r k m e t h o d ) s h o w e dc v p i i sak i n do fn o n c o m p e t i t i v ea n da n t i - c o m p e i t i t v ei n h i b i t o rt op e p s i nw h i l ec o m p e t i t i v ea n d a n t i - c o m p e t i t i v ei n h i b i t o rt oy e a s tp r o t e i n a s ea t h em a i ni m p a c tf a c t o r sw e r ed e t e r m i n e da si n o c u l u ms i z e ，i n i t i a lp ha n dm e d i u m v o l u m eu s i n gs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tm e t h o d h a b s t r a c t t h er e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g ya n ds i n g l e f a c t o rt e s t e df o r t h eb e s tc u l t u r ec o n d i t i o n s i n d i c a t e dt h a tf e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ei s2 6 ，f e r m e n t a t i o nt i m ei sl2 0h ，r o t a t es p e e di s 17 0 r m i n ，m e d i u mv o l u m ei s71 31m l 2 5 0 m l ，i n i t i a lp hi s5 9 7 ，i n o c u l u ms i z ei s13 9 6 ； t h ei n h i b i t o ru n i t sw e r ei m p r o v e df r o m3 7 2 i u m lt o1o 15 i u m l k e yw o r d s ：c o r i o l u sv e r s i c o l o r ,s u b m e r g e df e r m e n t a t i o n ,a s p a r t i ca c i dp r o t e a s ei n h i b i t o r c h a r a c t e r i s t i c s ， k i n e t i cs t u d i e s ， i c 5 0 ，t h er e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 ，、，叮j， 签 名：丝亚趑 日期： d g 富6 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：g 亟砬导师签名：三里至壬 日期： 竺墨：堡：乙 绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 在全球医疗卫生迅速发展的今天，艾滋、恶性肿瘤等仍然是困扰医学界的重大难题， 目前还没有很好的手段束治愈这些疾病。 人类免疫缺陷病毒( h i v ) 是获得性免疫缺陷综台症( a i d s ) 的病原体，是一种逆 转录r n a 病毒，被称为“2 0 世纪的瘟疫”，争球广为传播，至今尚无根治药物。2 0 世纪 8 0 年代以来，绝大部分感染h i v 病毒的患者所面临的是自身免疫系统的无可抗拒的损 坏，随之而来的是各种可怕疾病的侵袭，然后是虚弱、消瘦，直至死亡。1 9 9 6 年在美国 等西方囤家采用了种名为蛋白酶抑制剂的药品，使那些确诊为h i v 病毒感染患者的命 运发牛了巨大改变。1 9 9 6 年至1 9 9 8 年，美国h i v 病毒感染所导致的死亡人数降低了7 0 以上，艾滋病也不再被列为美国十大丰要死亡原因之一。 _i。曼驾萋臻骜鳝盟盆盆篓盘竺7 曩飞、 l j 图1i1 9 8 5 1 9 9 8 年美国成年人艾滋病惠者厦其死亡人数示意图 f i g i le s t i m a t e d i n c i d e n c eo f a i d sa n dd e a t h s o f a d u l t s w i t h a i d sb e t w e e n l 9 8 5 t 0 1 9 9 8 i n t h e u s a 目前抗h i v 药物的研究重点丰要集中在逆转录酶、蛋白酶、整合酶及病毒吸附、融 台等几个靶点 2 1 。其中逆转录酶是一种天冬氨酸蛋白酶，之外天冬氨酸蛋白酶还包括： 胃蛋白酶、h i v 蛋白酶、血管紧张肚原酶、蛋白酶a 、组织蛋白酶d 、天冬氨酸膜内裂 解蛋白酶等，这些蚩白酶的生物学功能主要体现在：消化食物蛋白、降解抗原、促进其 他酶的活化、位点特异性水解逆转录酶病毒前体蛋白以产牛病毒体复制所必须的酶蛋 白、调整血压等等。天冬氨酸蛋白酶在艾滋病、恶性肿瘤、高血压等世界上几种难治疾 病的发病机制巾都发挥了一定的作用口】，深入了解天冬氨酸蛋白酶抑制剂，对治疗这些 顽固性疾病将有一定的帮助。 蛋白酶抑制剂泛指对蛋白酶有抑制作用的一类物质参与生物体内蛋白酶解活动的 控制“，对维持正常的生命活动具有重要意义。它的来源十分广泛，在多种动植物的组 织器官及某些微生物中部有存在。按其所抑制的目标蛋白酶活性中心的不同，可分为以 下几种：丝氨酸蛋白酶抑制剂( s e t p i n ) ：如胰蛋白酶抑制剂；半胱氨酸蛋白酶抑制剂 江南大学石贞。t 学位论文 ( c y s c ) ：如木瓜蛋白酶抑制剂；天冬氨酸蛋白酶抑制剂：如胃蛋白酶抑制剂、h i v 蛋 白酶抑制剂、血管紧张肽原酶抑制剂和蛋白酶a 抑制剂；及金属蛋白酶抑制剂：如羧肽 酶抑制剂【5 1 、血管紧张素转化酶抑制剂( c a p t o p r i l ) 等【6 。】。 目前国内外报道的天冬氨酸蛋白酶抑制剂大多数都是通过化学法合成的，这些抑制 剂在应用中受到相当大的限制；国外曾有人从马铃薯、番茄及豆科植物中提取出天冬氨 酸族蛋白酶抑制剂【8 。9 】；本实验室曾从灵芝发酵全粉中提至u g l p i a l 和g l p i a 2 两种蛋白酶 a 抑制剂【l o 】，并从马铃薯块茎中提取一种蛋白酶a 抑制剂【l l 】。这些蛋白酶抑制剂在医药 及食品添加剂等领域都有很好的应用前景。 云芝是我国传统的名贵药材，富含丰富的营养及多种生物活性成分，具有药用保健 作用，是一种具有广泛药理活性的药用真菌。云芝液体深层发酵的发酵产物复杂，主要 为云芝多糖和云芝糖肽。 云芝多糖是良好的生物效应调节剂，具有抑制肿瘤、调节免疫、降低放射、化疗毒 副反应等多种药理作用，并有抗艾滋病毒活性l i6 | ，能调节人体的免疫功能，增强巨噬细 胞的吞噬作用【1 2 d 5 1 ；因射线等引起免疫功能低下者，云芝多糖能显著提高其溶菌力；云 芝多糖最重要的作用是它对肝脏的保护；云芝多糖对冠心病具有一定的治疗作用、抗动 脉粥样硬化、提高鼠大脑皮层、抗衰老【1 7 。1 8 】、肝组织的抗氧化作用，治疗高血脂【19 1 ，对 顿抑心肌的功能和超微结构有显著保护作用，对慢性应激引起的学习和记忆障碍有明显 的改善作用【1 2 彩j 。 云芝糖肽是一种有效的免疫增强剂，抗肿瘤、镇痛【2 刚、免疫调节、抗缺氧、促进多 种细胞因子、抗乙肝病毒的产生；云芝或灵芝糖肽与螺旋霉素合用，具有潜在的抗弓形 虫感染的效果。 利用云芝发酵制备天冬氨酸蛋白酶抑制剂，除了对天冬氨酸蛋白酶具有抑制作用 外，还可能兼有云芝多糖和云芝糖肽等的活性功能，保证了其应用的安全性，在医药保 健及食品饮料等方面将有很好的应用前景。 1 2 研究现状 1 2 1 真菌液体深层发酵的研究 真菌药物是我国中药的组成部分，具有悠久的历史。随着人们生活水平的提高 和科学技术的发展，真菌生产己从野牛采集到人工栽培，现已发展到应用牛物工程 新技术，把真菌学与工业发酵技术相结合形成液体深层发酵的新兴产业，这种生产 方式能大大缩短生产周期，扩大生产规模，简化生产工艺，降低牛产成本，充分利 用发酵产物的牛理活性，这是真菌研究开发的走向和热点。 李平作【2 7 】等研究灵芝液体深层发酵中的丰要牛物活性物质；田亚平【2 8 】等灵芝深层发 酵水溶性活性物质的研究；徐鹏【2 9 1 等添加中药的灵芝发酵及其酪氨酸酶抑制活性的研 究；湖北工业大学张华山、李亚芳、余响华1 3 0 】赤芝在气升式反应器中的深层培养实验。 山东农业大学皇传华【3 1 1 平菇与鸡腿蘑液体菌种培养及应用技术研究；山东农业大学刘 敏、贾乐【3 2 】产漆酶杏鲍菇原生质体紫外线诱变育种及其发酵条件研究；成都中医药大学 2 第一章绪论 李羿、万德光1 3 3 】茯苓优良菌种的选育、保藏和液体发酵的研究；陕西师范大学张建强、 张润光1 3 4 1 金针菇乳酸加工技术的研究；王谦，闫蕾蕾，王永利【3 5 】等研究了金项侧耳的深 层液体培养及相关检测；大连医科大学戴兵【3 6 】对香菇菌丝体发酵液提取蛋白抗肿瘤机制 进行了研究；王谦、闫蕾蕾、王超1 37 j 等对茯苓液体培养条件进行了研究。 作为热点之一的云芝真菌液体深层发酵的菌种、工艺、发酵产物牛物活性方面 的研究也有一定的基础。 云芝( c o r i o l u sv e r s i c o l o r ) 又称为采绒革盖菌、彩纹云芝、千层蘑、彩云革盖菌等， 属于担子菌多孔科云芝属，别名杂色云芝。云芝味甘、淡，性微寒，有健胃利脾，止咳 平喘，清热解毒，抗肿瘤的功效。现代药理研究表明云芝多糖为该菌的丰要有效组分， 具有抑制肿瘤、抗溃疡、保肝、抗病毒、降血脂、抗衰老等多种药理作用【1 0 。2 4 】，现已正 式投产，并广泛应用于临床。 云芝的各种活性成分大多是从其子实体中分离提取的，即使利用现代人工栽培技术 也很难做到规模化生产，所以云芝液体深层发酵技术近年来得到较快发展。而目前的研 究主要集中在云芝多糖【3 8 】、云芝胞内糖肽【3 9 】等方面。云芝多糖是良好的牛物效应调节剂， 具有抑制肿瘤、调节免疫、降低放射、化疗毒副反应等多种药理作用，并有抗艾滋病毒 活性，能调节人体的免疫功能，增强巨噬细胞的吞噬作用；因射线等引起免疫功能低下 者，云芝多糖能显著提高其溶菌力；云芝多糖最重要的作用是它对肝脏的保护；云芝多 糖对冠心病具有一定的治疗作用、抗动脉粥样硬化、提高鼠大脑皮层、肝组织的抗氧化 作用，对顿抑心肌的功能和超微结构有显著保护作用，对慢性应激引起的学习和记忆障 碍有明显的改善作用。云芝糖肽是一种有效的免疫增强剂，抗肿瘤、镇痛、免疫调节、 抗缺氧、促进多种细胞因子、抗乙肝病毒的产生；云芝或灵芝糖肽与螺旋霉素合用，具 有潜在的抗弓形虫感染的效果。 江南大学余晓斌、尤蓉、胡卫珍【3 引等对云芝菌丝体多糖的分离纯化、云芝糖肽的液 体发酵及控制p h 值对云芝发酵罐液态培养的影响进行了研究；新乡医学院郭伟云【4 0 】等 对云芝产漆酶发酵条件进行了研究；深圳职业技术学院黄志立、张丽君、刘冬【4 l 】等研究 了p h 值对云芝菌丝体生物量及s o d 活性的影响：南京工业大学林晓霞、熊强、陆利霞 【4 2 】等进行了云芝糖肽的液体发酵培养基的研究；河南工业大学徐淑霞【4 3 】等进行了杂色云 芝漆酶和发酵液降解对苯二酚的研究；天津师范大学马海燕、郭成金】对云芝菌丝体液 体培养基进行筛选；陕西省资源生物重点实验室邓百万、陈文捌4 5 】对云芝液体培养及富 集硒进行了研究；华南理工周少奇【4 6 j 等研究了云芝菌丝体发酵清液的流变特性与表面张 力；安徽师范大学潘继红【4 7 】等研制了云芝保健饮料；浙江大学吴坤、朱显峰【4 8 】对杂色云 芝产漆酶的发酵进行了研究等等。 从以上众多学者的研究可以看出，云芝生产可以大规模利用发酵法进行，它代表了 云芝研究和开发的一种发展趋势：既从野生采集到人工栽培，再到应用牛物工程新技术， 把真菌学与工业发酵技术相结合形成液体深层发酵的新兴产业。这种生产方式能够大大 缩短生产周期，扩大生产规模，简化生产工艺，降低生产成本等。 江南大学硕十学位论文 1 2 2 蛋白酶抑制剂的研究 蛋白酶的抑制剂是泛指对蛋白酶有抑制作用的一类物质，它可以是大分子的蛋白， 小分子的有机物，或者是寡聚核苷酸。参与牛物体内蛋白酶解活动的控制，对于维持正 常的牛命活动具有重要意义。它的来源十分广泛，在很多动植物的组织器官及某些微生 物中都有存在。按照其抑制的目标蛋白酶活性中心的不同，大致可以分为一下几种：丝 氨酸蛋白酶抑制剂( s e r p i n ) 如胰蛋白酶抑制剂( t r y p s i ni n h i b i t o ri t ) ；半胱氨酸蛋白 酶抑制剂( c y s c ) ：如木瓜蛋白酶抑制剂；天冬氨酸蛋白酶抑制剂：如h i v 蛋白酶抑 制剂，胃蛋白酶抑制剂、蛋白酶a 抑制剂和血管紧张肽原酶抑制剂；金属蛋白酶抑制剂： 如羧肽酶抑制剂、血管紧张素转化酶( a c e ) 抑制剂等。 按照其作用方式的不同可分为：不可逆性抑制剂，可逆性抑制剂，后者又可分为竞 争性抑制剂，非竞争性抑制剂，和反竞争性抑制剂【4 9 j 。 不可逆性抑制剂可以通过与蛋白酶的活性基团不可逆结合，从而使酶因活性中心的 结构发生改变而丧失活性。如果是可以专一识别并结合某些特定基团的不可逆抑制剂， 称为酶的专一性不可逆抑制剂。专一性不可逆抑制作用可分为k s 型和k c a t 型。k s 型抑制 剂是一些具有专一的化学结构并带有一个活泼化学基团的类底物，它可以与相应的酶结 合，并且与酶的必需功能团起反应，对酶进行化学修饰，从而限制酶的活力。这种抑制 剂对酶的抑制活力取决于它与必需功能团结合的解离常数与非必需功能团结合的解离 常数之比，因而被称为k s 型，如对甲苯磺酰一l 赖氨酸甲酰( t l m e ) 。k c a t 型的不可逆抑 制剂，是酶的底物的结构类似物，同时也是酶的一种底物，在被酶催化的同时，其活性 基团暴露，修饰酶的必需基团，从而抑制酶的活性，如d 一卤代一d 一丙氨酸抑制丙氨酸 消旋酶。但大多数不可逆抑制剂所攻击基团的标志不明显，被称为非专一性不可逆抑制 剂，如有机磷类化合物，氰化物，硫化物等和酰化剂乙醚咪唑，可以同酶分子侧链基团 的羟基，氨基，巯基，酚基等发牛反应。 竞争性抑制剂和底物竞争结合酶的活性部位，一旦底物与酶的活性部位结合后，抑 制剂便不能再结合到上面，反之亦然。它的特点在于不存在e i s 或e s i 的三元络合物。这 类抑制剂通常与底物在结构上有某种程度的相似。 在非竞争性抑制剂的作用下，底物和抑制剂两者与酶的结合互不相关，即不互相排 斥，也不互相促进，即底物抑制剂可同时独立的与酶结合。 反竞争性抑制剂不能单独与酶结合，必须要在酶与底物结合之后，才能结合到酶与 底物复合物上，发挥其抑制作用。 值得一提的是混合性抑制剂，底物对酶的亲和力大于对酶抑制剂，而所形成的e i s 为无活性的不能分解出产物。 每一种酶，不管它的作用是合成还是分解，都作用于一种名为酶作用物的特殊物质 的分子。这种酶作用物可以是人体内众多物质中的任意一种，其中包括蛋白质和核酸。 这一过程发生在酶的活性部位。活性部位是一个凹槽或口袋的形状，专门用来容纳一个 或最多几个形状相似的酶作用物。打一个不太恰当但却有助于理解的比方，将酶作用物 比作手，而将酶的活性部位比作手套。这正象一只手套装得下各种尺寸的手只要它 4 第辛绪论 们都基本是手的形状。但是一只手套却不能同时容纳两只或更多只手。一旦一只给定的 手装在了一只手套里，即使它并不是很合适，但是这只手套也无法有效地装进其他的手 了。因此当抑制化合物进入活性部位后，它就会阻止酶反应的进行，这种抑制化合物是 酶的竞争性抑制剂。也有一些抑制化合物不能完全进入酶的活性中心，但能够通过与酶、 底物或者是酶与底物复合物结合而影响酶活性中心的结构，从而使酶失活。 在长期的生物进化过程中，蛋白酶及其抑制剂都可作为各种牛物之间的进攻及防御 手段，所以几乎每一种蛋白酶都有其相应的抑制剂。对蛋白酶抑制剂的抑制特性进行研 究，可有助于其在各行各业的应用，尤其是在医药领域。 自从1 9 7 9 年一种广泛用于降血压的药品血管紧张素抑制剂( c a p t o p r i l ) 研制出来以 后，蛋白酶抑制剂在临床上的使用已达2 0 多年之久，c a p t o p r i l 是通过“药品研制”( 就是 通过一步步的完善和重复试验对药品进行精细调制) 所开发的第一种蛋白酶抑制剂。 1 9 9 6 年首先在美国等西方国家采用了一种防治艾滋病的蛋白酶抑制剂，使得美国h i v 病 毒感染导致死亡的人数降低了7 0 以上。如今已有五种h i v 蛋白酶抑制剂陆陆续续研制 出来，并得到美国食物药品管理局的认可，现已被加入到艾滋病药品“鸡尾酒”中【5 ，这 五种抑制剂分别是a m p r e n a v i r ，i n d i n a v i r ，n e l f i n a v i r ，r i t o n a v i r 和s a q u i n a v i r ，它们和血管紧 张肽原酶抑制剂虽然在结构上不同但在化学成分上却称得上是血管紧张肽原酶抑制剂 的后代。另外在治疗恶性肿瘤方面，蛋白酶抑制剂的研究也在进行当中，依据l i o t t a 提 出的肿瘤细胞浸润模型：肿瘤细胞必须附着于细胞外基质，降解并越过基质，由于 蛋白酶能水解破坏周围组织、因此在浸润中起一定作用。人尿中提取的u t i ( 人尿 胰蛋白酶抑制剂) 可与肿瘤细胞上u t i 受体结合，调节纤维蛋白酶活性，从而抑制 肿瘤细胞的浸润和转移【5 1 】。从一种放线菌发酵液中提出的胃蛋白酶抑制剂一p e p s t a t i n 可用作胃溃疡、关节炎、高血压等的抗性药物【52 1 。从人尿牛肺或牛胰腺中提取的 抑肽酶、黄豆中提取的大豆胰蛋白酶抑制剂及人工合成的甲磺酸肌己苯酯及其衍生 物，可用作胰蛋白酶的抑制剂，起到保护胰脏的作用。 除医药领域，蛋白酶抑制剂也可用在食品添加剂方面。如蛋白酶a 抑制剂可用于增 强纯牛啤酒的泡沫稳定性【1 0 j 。 另外在农业上，蛋白酶抑制剂也有较广的应用。从植物中提取到的蛋白酶抑制 剂可抑制昆虫消化道内的蛋白酶，使昆虫无法正常消化食物，从而导致害虫死亡p 引。 1 2 3 天冬氨酸蛋白酶抑制剂的来源 各种生物体的生命活动少不了酶的参与，也同时会适时产生能调节其活性的因子， 其中就包括各种酶的抑制剂。其中天冬氨酸蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物的组织器官 及某些微生物中，所以除了通过人工合成外，也可从生物体内提取得到。 目前国内外报道的天冬氨酸蛋白酶抑制剂大多数都是通过化学法合成的，这些抑制 剂在应用中受到相当大的限制，所以有必要寻找天然抑制剂。国外曾有人从马铃薯、番 茄及豆科植物中提取出天冬氨酸族蛋白酶抑制剂 8 - 9 1 ；本实验室曾从灵芝发酵全粉中提 到g l p i a l 和g l p i a 2 两种蛋白酶a 抑制剂i l ，并从马铃薯块茎中提取一种蛋白酶a 抑制剂l l 。在微生物方面，如果能从一些药用真菌中提取出天冬氨酸蛋白酶抑制剂，将 “南大 f i 口k 女 会有很好的应用前景。 然而真菌这方面活性成分的研究并不多见，相关报道丰要集中在灵芝酸的作用上。 1 9 9 8 年月木科学家发现g a n o d e f i o lf 和灵芝酮二醇( g a n o d e r m a n o n t d 0 1 ) 有较强抑制 h i v - i 蛋白酶活性的能力；1 9 9 9 年挺围k i m 发现灵芝提取液具备葡糖醛酸酶抑制活 性和保肝作用；2 0 0 6 年江南夫学徐鹏等进行了添加中药的灵芝发酵及其酷氨酸酶抑 制活性的研究口8 】；本实验室田北平、李屹松等曾从灵芝发酵全粉中提取出两种蛋白酶a 抑制剂”。真菌能产生各种活性成分，其中一定也不乏存在一曲酶抑制剂，在灵芝提取 液的各种药殚作j j 如调节、增强人体免疫力，对十十经衰弱、风湿性关节炎、冠心病、高 血矗、肝炎、糖尿病、肿瘤等柯良好的m 同治疗作用，抗疲劳，美容美颜，延缓衰老， 防治艾滋病等功效哪刮叶 ，可能也会存在抑制剂的协同作用。目前国内外还没有利用真 菌发酵制备天冬氨酸蛋白酶抑制剂的丰 | 关报道。 1 2 4 以胃蛋白醇作为天冬氨酸蛋白酶抑制剂筛选靶醇的意义 h i v 蛋白酶、血管紧张肽原酶、蛋白酶a 、组织蛋白酶d 、天冬氨酸膜内裂解蛋白 酶等都与胃蛋白酶一样，在活性巾心都含有天冬氩酸，因此都类属于犬冬氨酸族蛋白酶t 它们的抑锕j 剂都腻于兀冬氩酸蛋白酶抑制剂。基于天冬氨酸蛋白酶在消化食物蛋白、降 解抗原、促进其他酶的活化、位点特异悱水解逆转录酶病毒前体蛋白以产牛病毒体复制 所必须的酶蛋白、调整血压等方面的活性功能，我们知道，这此蛋白酶在艾滋病、恶性 肿墙、高血压等世界上几种难治疾病的发病机制中都发挥了一定的作用j ，因此深入了 解天冬氨酸蛋白酶抑制荆，对治疗这些顽固性疾病将肯定的帮助。 对酶的结构及其氨基酸序列进行译解，能看到酶活性部位的外貌，重建酶和底物之 间发生的实际的化学反戍。这为针对特定的晦制造或寻找抑制化合物提供了有力的工 具。因此，在寻找蛋白酶抑制剂的过程中，有必要确定蛋白酶的结构，在这几种天冬氧 酸蛋白酶当中，以胃蛋门酶的结构最为叫确，早在1 9 3 4 年国外就有人拍摄出第一张胃 蛋白酶的x - 光品体图片畔】。所以我们选择胃蛋白酶作为犬冬氨酸蛋白酶抑制剂筛选的 靶酵。下面是几种天冬氨酸蛋白酶的三维结构1 i 意图。从中我们可以看到，它们确实有 着非常相似的卒间结构。 圈1 2h i v 蛋白酶【6 5 州 f i “2h i v p t e l n 一”“1 图i3 蛋白酶a 哪i f i g13p r o t e i n a s e a 以胃蛋白酶作为靶酶的另一个原因是 等。 1 3 立题意义 图14 胃蛋白酬”i f i 9 14p e p s i n 胃蛋白酶最容易获得，而且价格低廉、无毒 真菌药物是我国中药的组成部分，具有悠久的历史。随着人们生活水平的提高 和科学技术的发展，云芝生产已从野生采集到人工栽培，现已发展到应用生物工程 新技术，把真菌学与工业发酵技术相结合形成液体深层发酵的新兴产业，这种生产 方式能大大缩短生产周期，扩大牛产规模，简化牛产工艺，降低牛产成本。充分利 用发酵产物的牛理活性，这是云芝研究开发的走向和热点。 云芝属于天然牛物，营养成分丰富且营养价值高，国内外研究工作者已从云芝 中分离得到数十种如多糖、多肽、三萜、核苷、牛物碱、甾醇和云芝蛋白质等生理 活性物质，而且已经证实这些牛理活性物质有抗肿瘤，抗衰老，提高人体免疫机能 等作用，其中云芝糖肽是一种有效的免疫增强剂抗肿瘤、镇痛、免疫调节、抗缺氧、 促进多种细胞因子、抗乙肝病毒的产生：云芝或灵芝糖肽与螺旋霉素合用，具有潜在的 抗弓形虫感染的效果。 利片j 云芝发酵制备天冬氨酸蛋白酶抑制剂，除了对天冬氨酸蛋白酶具有抑制作用 外，还可能兼有云芝多糖和云芝糖肽等的活性功能，保证了其应用的安全性。在医药保 健及食品饮料等方面将有很好的应用前景。 马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u m ) 块茎中含有多种蛋白类蛋白酶抑制剂，含量占所含可溶 性蛋白的5 0 以上【6 ”。目前，马铃薯除食用外一般用于淀粉牟产。我国马铃薯淀粉产业 近年来发展迅速，全围牛产企业多达万家，年产量达4 3 万吨，马铃薯年加工近3 0 0 万 吨 6 9 】，但是淀粉牛产中产牛的蛋白液般当作废水排放于河流和水库中，造成严重的污 染m “】。全国年加工马铃薯按3 0 0 万吨，排放蛋白液约1 2 0 万吨计算，等于年排放了蛋 白质等营养物质4 万多吨。如果被提取后再利用，价值过亿元。因此以马铃薯为培养 基主要成分，采用云芝发酵来制取蛋白酶抑制剂不但具有很好的药用前景，而且有 潜在的经济效益、环境和社会效益。 江南大学硕上学位沦文 1 4 本论文主要研究内容 本论文的研究重点是从不同真菌中筛选出一株天冬氨酸蛋白酶抑制剂高产菌株，进 行液体深层发酵条件优化，同时寻找一种合适的抑制剂提取方案，以及对抑制剂的基本 组成和特性做进一步的了解。 本文的主要研究内容： 1 筛选一株液体深层发酵天冬氨酸蛋白酶抑制剂较好的菌株； 2 建立抑制剂提取方案，对发酵出来的活性成分进行分离纯化及基本性质研究； 3 探讨发酵条件对产天冬氨酸蛋白酶抑制剂的影响。 第二章产天冬氨酸蛋白酶抑制剂菌种的筛选 第二章产天冬氨酸蛋白酶抑制剂菌种的筛选 2 1 前言 对酶的结构及其氨基酸序列进行研究，能明确酶活性部位的外貌，重建酶和底物之 间发生的实际的化学反应。这为针对特定的酶制造抑制化合物提供了有力的工具。因此， 在寻找蛋白酶抑制剂的过程中，有必要确定蛋白酶的结构。在这几种天冬氨酸蛋白酶当 中，以胃蛋白酶的结构最为明确，早在1 9 3 4 年国外就有人拍摄出第一张胃蛋白酶的x 光晶体图片【6 4 1 。所以我们选择胃蛋白酶作为天冬氨酸蛋白酶抑制剂筛选的靶酶。以胃蛋 白酶作为靶酶的另一个原因是，胃蛋白酶最容易获得，而且价格低廉、无毒等。 鉴于以往对天冬氨酸蛋白酶抑制剂及利用灵芝发酵全粉提取抑制剂的研究【7 2 1 ，我们 想从不同的真菌中筛选出产天冬氨酸蛋白酶抑制剂较好的菌株。 不同种类的真菌、真菌的不同部位、不同培养方式的真菌、不同的提取方式和条件， 都会得到不同的生物活性物质。由于天冬氨酸蛋白酶抑制剂在艾滋病、恶性肿瘤及高血 压等疾病防治中有很好的应用前景，而真菌深层发酵是工业化大规模的一种趋势，故对 真菌发酵液和菌丝体中可能存在的抑制剂进行分离和特性研究，将是非常有意义的。 本章丰要任务是以胃蛋白酶为靶酶筛选产天冬氨酸蛋白酶抑制剂较好的菌株，并对 抑制剂的提取作初步探讨。 2 2 材料和方法 2 2 1 供试菌株 甜芝、云芝、韩芝、赤芝g 8 ( 均购自华中农业大学菌种实验中心) ，4 。c 冰箱保存， 每6 个月转管一次。 2 2 2 主要试剂与仪器 主要试剂：f o l i n 一酚试剂自配， 丰要仪器： h i m a c c r 2 2 g 高速冷冻离心机 真空冷冻干燥机 其余试剂均为国产分析纯。 h y g i ia 回转式恒温调速摇瓶柜 d s 1 高速组织捣碎机 立式压力蒸汽灭菌器 电热恒温水浴锅 s h z i i i 型循环水真空泵 s e n c or 2 5 0 旋转蒸发器 7 2 2 型光栅分光光度计 隔水式电热恒温培养箱 w 2 0 1 d 恒温水浴锅 9 日本日立h i t a c h i 公司 v i r t i s 上海欣蕊自动化设备有限公司 上海标本模型厂制造 上海花线医用核子仪器有限公司 上海医疗器械五厂 河南省巩义市站街光亚仪器厂 上海申顺生物科技有限公司 上海精密科学仪器有限公司 上海跃进医疗器械厂 上海申顺牛物科技有限公司 江南大学硕十学位论文 c j 8 8 1 强力搅拌器 2 2 3 培养基 金坛市恒丰仪器厂 斜面培养基( p d a ) ：新鲜马铃薯2 0 ( 切丝加热煮沸3 0 m i n ) ，葡萄糖2 ，k h 2 p 0 4 o 3 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 5 ，琼脂2 ，p h 自然，1 2 1 灭菌2 0 m i n 摇瓶种子培养基：新鲜马铃薯2 0 ( 切丝加热煮沸3 0 m i n ) ，葡萄糖2 ，k h 2 p 0 40 3 ， m g s 0