层析分离法.doc

第三章 层析分离法1. 主要教学目标：学习和掌握柱色谱、纸色谱和薄层色谱法的原理、技术和应用。2. 教学方法和手段：采用板书及与多媒体课件相结合，课堂上师生互动，采用启发式和提问式的教学方式，并且课堂上学习的表现记入学生的平时成绩。3. .教学重点及难点：柱层析及基本理论；纸色谱色谱法又称层析法，是一种广泛应用的分离方法。色谱分析法是在1906年由俄国植物学家Tsweet首先系统地提出，他将叶绿素的石油醚液流经装有CaCO3的管柱，并继续以石油醚淋洗时，发现由于CaCO3对于叶绿素中各种色素吸咐能力的不同而使它们彼此分离，于是管中出现不同颜色的谱带，如图31所示。图3-1 Tsweet的色谱工作图 尤如光谱一样，这样就有可能对它们进行定性分析和定量测定，于是他将这种彩色分层物定义为层析谱，而将这种分析方法称为色谱分析法。色谱法(Chromatograph)这名词是由希腊字“Chroniatus”(颜色)和“graphein”(记录)二字合并而成。并发表了“植物界的色素”专论。到1931年，Kuhn和Leaerer又成功地适用Tsweet的方法分离了植物的色素，才使这一方法得到公认和广泛应用。 1935年人工合成离子交换树脂后，为离子交换色谱的广泛应用提供了物质基础。 1938年苏联的Izmailo等创立了薄层色谱法，主要是用于药物分析，应用于无机物分析则是50年代末才开始的。应用于稀土元素的分离是1964年由Pterce开始的。 1941年Martin和Synge首先介绍了分配色谱法，并将蒸馏塔板理论应用于色谱分离中，使色谱方法在理论上向前推进了一步。 1944年Consden，Cordon和Martin首先开始了纸色谱法，Martin和Synge并用此法成功地分离了氨基酸的各种成份，获得1952年的诺贝尔奖。 1947年美国的Boyd和Spedng等人发表一系列论文，报告他们应用离子交换色谱法分离裂变产物和稀土元素混合物的情况。1952年Martin和Games开创了气一液色谱的新领域。20世纪60年代末，法国的G.Aubouin和美国的Scott等人同时各自创立了高压液相色谱法，它与分光光度、库仑、电导、荧光等方法联用，可使分离和检测实现自动化。 到目前为止，各种色谱还在不断发展，色谱设备日益完善，操作技术不断突破，色谱分析法已成为近代化学中最重要的分离分析手段之一。 色谱法有许多分支，但在色谱分析过程中总是由一种流动相(例如Tsweet工作的石油醚)，带着被分离物质(如叶绿素)流经固定相(如CaCO3)，从而使分离物中各组分分离。它有许多分类方法。 按流动相和固定相性质不同分类流动相 固定相 色谱分析法种类 固体 气固色谱法气体 气相色谱(气相层析) 液体 气液色谱法 固体 液固色谱法液体 液相色谱(液相层析) 液体 液液色谱法按操作形式分类 柱色谱：柱色谱顾名思义就是将固定相(如硅胶、氧化铝、氧化铝、碳酸钙、淀粉、纤维素)，离子交换(树脂等)装人一根被称为色谱柱的玻璃瓶中，这种色谱柱通常又称为“层析柱”或“分离柱”。 纸色谱：利用滤纸作为固定相，让样品溶液在其上展开，达到分离鉴定的目的。 薄层色谱：将吸附剂研成粉末，再压成或涂成薄膜，然后用与纸色谱相类似的方法操作。 按分离过程的原理不同分类 吸附色谱：固定相为吸附剂，利用吸附剂表面对被分离组分吸附能为强弱的差异性进行分离。气固色谱和液固色谱属这一类。 分配色谱；是利用各个被分离组分在固定相和流动相两相间分配系数的不同来进行分离的。气液色谱和液液色谱属于这一类。 离子交换色谱：以离子交换剂作固定相，利用各种组分的离子交换亲和力的差异来进行分离。 凝胶色谱：又称排阻色谱。用凝胶作固定相，利用凝胶对分子大小不同的组分所产生阻滞作用的差异来进行分离。 气相色谱和高效液相色谱属于仪器分析，这里不作表述。本章重点介绍柱色谱、纸色谱和薄层色谱。 色谱分离法的特点 （1）高选择性：色谱分析的高选择性主要表现在它能对性质极为相似的物质，例如有机化合物中的各种类型的异构体(顺反异构体、旋光异构体、芳香烃中邻位、间位、对位异构体等)，又如氢同位素氢(H)、氘(D)、及氘(T)可以形成的六种氢分子，这些异构体和同位数，原则上都可以用色谱方法进行分离测定。 （2）高效能：是指色谱可以分离分配系数接近的组分，从而可以分析极为复杂的化合物。这是因为在分离的全过程中，可以认为是无限个流动相在无限个固定相中移动，物质即在两相中作无限次抽提、溶解，再抽提、再溶解的过程，尽管它们之间分配系数差异不大，但经反复抽提，溶解的结果，使微小的差异积累成明显的差异，因而提高了分离效率。 （3）高灵敏度：总的来说，各种色谱分析的灵敏度都比较高，样品的分析量可以达到10-1210-14克，因此在痕量分析上广泛应用，而且成为最重要的手段，可以鉴定出环境分析中的杂质，高分子单体、原子能裂变物等，鉴定量1ppm0.lppb以下。（4）高速度：色谱分析一般来说还是比较快的，如纸色谱、柱色谱可以同时分离几种或十几种物质，而且既能定性又能定量。特别是气相色谱及高效液相色谱，大部分样品只要几分钟即可完成一个分析周期。3-1 柱色谱 柱色谱，按其作用原理又可分为吸附柱色谱和分配柱色谱。一、吸附柱色谱 吸附柱色谱是各种色谱法中最早建立的。所谓吸附是指物质在吸附剂表面上集中浓缩的现象，吸附剂一般是多孔性的微粒状物质，在其表面具有许多吸附中心(或吸附位置)，这些吸附中心数量的多少及其吸附能力的强弱直接影响吸附剂的吸附性能，吸附能力减弱，加热驱除水分，可使吸附能力增强，即所谓“活化”；反之，加入一定量的水分，可使活性降低，称之为“脱活性”。 1. 吸附等温线 在一定温度下，某种组分在吸附剂表面的吸附规律可用平衡状态时此组分在两相中浓度的相对关系曲线表示。这种关系曲线称吸附等温线。吸附等温线有线性和非线性两种。如图3-2(a)所示。图3-2 吸附等温线(a)和对应的洗脱曲线(b) 线性吸附等温线如图3-2(a)，当溶质A随着流动相缓缓流过层析柱中的吸附剂(即固定相)时，溶质A在两相同不断地发生吸附、脱附，再吸附、再脱附过程。以Cm表示溶质A在流动相中的浓度，Cs表示溶质A在固定相中的浓度，吸附平衡可用下式表示：则吸附平衡的平衡常数( 3 1 )即溶质在固定相和流动相中浓度的比值，又称分配系数。对于这类吸附过程KD为一定值。当流动相的流速保持恒定时，溶质A的区带在层析柱中将以恒速前进，随后流出柱外。若测定流出液中A的浓度，绘制出流出液浓度(C)和体积(V)的关系曲线，则得如图3-2(b1)所示曲线；为一对称形的层析图谱，或称为洗脱曲线。 非线性等温线主要可分为两种：一种是呈凸形吸附等温线，如图3-2(a2)所示；一种呈凹形等温线，如图3-2(a3)所示。由于吸附剂表面上具有吸附能力强弱不同的吸附中心，溶质在其上的分配系数不同，吸附力强的吸附中心，分配系数(KD)较大，溶质分子首先占据它们，其次再占据较弱的，弱的和最弱的，于是KD值随着溶质在吸附中心上的浓度增加，强吸附中心的被饱和而逐渐变小，因而吸附的等温线逐渐向下弯曲而呈凸状。对于这种层析过程进行洗脱时，由于数量较多的弱的和较弱的吸附中心上的溶质先被洗下，接着较少的强吸附中心上的溶质也被洗下，于是获得的洗脱曲线呈拖尾形，如图3-2(b2)所示，吸附层析等温线以这种形式为主。但若减少溶质量，只利用凸形等温线开始的一部分，接近于线性关系，此时洗脱曲线也就变得对称了。 在试样中各组分的KD值多有差异，KD值较大的组分在柱上吸附较牢，在固定相中保留时间较长，要将它洗脱下来，所需溶剂(流动相)也较多。反之，KD值较小的组分，较易被洗脱下来。于是可利用各组分吸附能力的差异，即保留特性的差异将它们分开。 组分在柱上的保留特性可用保留时间和保留体积表示。所谓保留时间是从进样开始到流出液中出现浓度最高点的时间；所谓保留体积是从进样开始到流出液中出现浓度最高点时流过层析柱的流动相的体积。 2. 吸附剂及其选择 为了使试样中各组分分开，必须选择适宜的固定相和流动相。 吸附剂一般应为粗度均匀的细小颗粒，具有较大的表面积和一定的吸附能力，吸附剂与欲分离的试样和所用的洗脱剂不起化学反应，也不溶于洗脱剂中，常用的吸附剂有氧化铝，硅胶和聚酰胺等。 (1) 氧化铝是由Al(OH)3在300400时脱水制得。对氧化铝表面的吸附机理，人们的认识还不一致，有人认为氧化铝表面存在铝羟基A1-OH，由于羟基的氢键作用而吸附物质。氧化铝因生产条件的不同可分为中性、酸性和碱性三种，吸附性能也有差异。中性氧化铝应用广泛，适用于醛、酮、醌、酯、内酯化合物及某些苷的分离；酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素，某些氨基酸等；碱性氧化铝适用于分离碱性化合物，如生物碱、醇等。一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质也可用中性氧化铝分离。 氧化铝的活性与含水量密切相关，活性强弱用活度级IV级表示，活度I级含水量极少，吸附力最强，V级最弱。把氧化铝加热至100150，除去与羟基结合的部分水分，使氧化铝具有一定活性，加热150以上，氧化铝活性增至IIIII级，加热至300400，活性增至I-II级，再升温至600以上，进一步脱水，并开始烧结。由于脱水过程受许多因素影响，因此每批生产的氧化铝活性也不一致。一般讲，分离弱极性的组分选用吸附活性强一些的吸附剂，分离强极性的组分，选用活性弱的吸附剂。(2) 硅胶层析用硅胶是由弹性多聚硅酸脱水制得，性能稳定。硅胶表面化学组成有下面几种： 硅氧 游离型 束缚型 活泼型 烷 硅醇基 硅醇基 硅醇基 硅氧烷不具吸附性，硅醇基能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键，因而具有吸附性，其中活泼型硅醇基构成最强烈的吸附中心，游离型次之，束缚型又次之。由于活性羟基在硅胶表面较小的孔穴中较多，因而表面孔穴较小的硅胶吸附性能较强，水与硅胶表面的羟基结合成水合硅醇：、OH、OH2，使其失去吸附性，加热至100左右能可逆地除去这些水分，使硅胶活化，最佳的活化条件是105110，加热30分钟，若加热至200以上，则硅胶逐渐失去结构水，形成硅氧烷，吸附力下降。束缚型 活泼型硅醇基硅醇基加热至400以上，上述反应发生在两相邻表面间，胶的表面积逐渐变小，以至于烧结。 硅胶具有微酸性，吸附能力较氧化铝稍弱，可用于分离酸性和中性物质。如有机酸、氨基酸、萜类、甾体等。 (3) 聚酰胺它是由己内酰胺聚合而成，因而又称聚己内酰胺，或称锦纶，层析用聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末，易溶于浓盐酸、热甲酸、乙酸、苯酚等溶剂，不溶于水及甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯等有机溶剂。对碱比较稳定，对酸的稳定性较差，热时更敏感。 聚酰胺分子内存在很多酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，因面对这些物质有吸附作用，酚类和酸类是以其羟基或羧基与聚酰胺中酰胺键的羧基形成氢键；另外硝基化合物和醌类化合物是以其硝基或醌基与聚酰胺分子中酰胺键，游离胺基形成氢键，如图3-3所示。各种化合物因其与聚酰胺形成氢键能力的不同，吸附能力也不同，因此可以得到分离。一般讲，只有以下规律，能形成氢键基团较多的溶质，吸附能力较大，对位、间位取代基团都能形成氢键时，吸附力增大，邻位的使吸附力减小，芳香核具有较多共轭双键时，吸附力增大，能形成分子内氢键者，吸附力减小。 3. 流动相及其选择 流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性的流动分子占据活性中心的能力强，因而具有强的洗脱作用，非极性流动相占据活性中心的能力弱，洗脱作用也要弱得多。因而为了要使试样中吸附力稍有差异的各组分分离，就必须根据试样的性质、吸附剂的活性，选择适当极性的流动相。图3-3 聚酰胺吸附作用原理显然，强极性的组分容易被吸附剂所吸附，应选用极性较强的流动相才能将其从吸附剂上洗脱下来；弱极性的组分则应选用弱级性的流动相洗脱之，被分离组分的结构不同，其极性也不同，常见的功能团按其极性增强次序排列如下： 烷烃烯烃醚硝基化合物二甲胺酯酮醛硫醇胺酰胺醇酚羧酸。当有机分子的基本母核相同时，取代基团的极性增强，整个分子的极性增强，极性基团增多，整个分子的极性增强，分子中双键多，吸附力强，共轭双键多，吸附力增强。 流动相极性较弱时，可使试样中弱极性的组分洗脱下来，在层析柱中移动较快，而与极性较强的组分分离。同样，强极性和中等极性的流动相适用于强极性和中等极性组分的分离，常用的流动相按其极性增强顺序排列如下： 石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸甲酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸。 可将各种溶剂按不同配比配成混合溶剂作为流动相，因此流动相的种类很多，流动相的选择也比固定相的选择更为复杂了。 当然，在选择层析分离条件时，必须从分离组分，吸附剂和洗脱剂三方面考虑，对于某种试样，就必须考虑如何选择合适的固定相和流动相，上面讨论的仅是一般规律，对于具体的某种试样尚需通过实践进行适当选择。至于溶解试样用的溶剂，极性应与流动相接近，以免因两者极性相差过大而影响层析分离。二、分配柱色谱1. 比移值 分配色谱是根据欲分离组分在两种互不混溶(或部分混溶)溶剂间溶解度的差异而分离的。在层析中，这两种互不混溶的溶剂之一是流动相；另一种是吸收在载体或粗体(往往也把它们称为吸附剂)中的溶剂，这种溶剂在层析过程中不流动，是固定相，例如含有一定量水分的硅酸，吸附性能消失(或极弱)，它含有的水分是固定的，硅胶为粗体。当流动相带着试样中的各种组分沿着层析柱流动肘，试样中的各种组分就在流动相和固定相两种溶剂间进行分配，不同两组分分配系数有差异肘，它们在层柝柱中前进的速度就不相同，于是得以分离。分配柱层析中的分配系数以KD表示之。 在分配柱层析中，若在单位时间内，一个分子在流动相中停留的时间分数(即在流动相中出现的几率)以R表示，若R = 1/3，卸表示读分子有1/3时间在流动相，2/3时间在固定相，对于大量的分子，则可认为有1/3的溶质分子在流动相，有2/3(即1一R)的溶质分子在固定相。在流动相和固定相中溶质的量可分别用Cm、Vm及Cs、Vs表示，其中Vm，Vs分别为层析柱中流动相和固定相的体积，于是( 3 2 )整理上式得： ( 3 3 )R是溶质分子出现在流动相中的几率，它表示层析过程中溶质分子在层析柱中移动的情况，如表示溶质分子与流动相分子在层析柱中移动速度的相对值，常以Rf表示，称为比移值。从式3-3可见，在一定层析条件下，Vs和Vm是定值，Rf值只和分配系数KD有关，各种不同组分，由于分配系数的不同，比移值不同，从而达到分离目的。Rf值相差较大有利于分离。 2. 分配柱层析的担体、固定相和流动相(1) 担体担体也常被称为吸附剂。严格讲，担体又起负载固定相的作用，本身应是情性的但实际并非如此，对于同一种试样，改变担体，常常会使Rf值发生变化，这可能是由于担体表面固定液膜较薄，部分担体裸露于外，起了吸附剂作用，这也就是分配层析常混杂着吸附层析的原因。分配柱层析常用韵担体有如下几种： 硅胶：在分配柱层析中用作担体的硅胶应在较低温度下活化，使其表面残留一定量的水分作固定相。 纤维素：层析用纤维素可分两种，即天然纤维系和微晶纤维素，前者是由质量较好的纸浆，经干燥、粉碎后制成，纤维长约2-20mm，平均聚合度为400 500；微晶纤维素是由棉花等较纯的纤维素，与强酸一起加热，部分水解后形成的微小晶体纤维素，平均聚合质为40-200。纤维素上有许多羟基，易与水形成氢键而将水吸附，这种吸附着的水分形成分配层析中的固定相。硅藻土：系天然存在的非晶形硅胶，其中除SiO2外，还含A12O3、Fe2O3、CaO、Na2O和有机物及水分等，需净制才能供层析用，硅藻土表面积小，仅1-5m2g，不适于作吸附剂用，但作担体较为适宜。(2) 固定相分配柱层析中常用的固定相为水，也有用稀硫酸、甲醇、甲酷酰胺等强强极性溶剂。(3) 流动相分配柱层析中的流动相一般是与水不相棍溶的有机溶剂，如正丁醇、正戊醇等，为了防止层析过程中流动相把吸附于担体上的少量水带走，流动相应予先用水饱和，并要加入羟酸、氨水等弱酸，弱咸，防止某些被分离组分的离解。 分配柱层析常用来分离强极性的、亲水性的物质，如脂肪酸、多元醇、水溶性氨基酸等。 分配柱层析速度较慢，处理量小，温度的影响较大。因此能用吸附柱层析分离的试样总是尽量采用吸附柱层析。 三、柱色谱的操作 柱色谱常用的层析柱如图3-4所示，基本上与Tsweet当年用的相似。用玻璃或塑料制成，其直径与长度比约为1：101：60，底部塞以玻璃纤维或脱脂棉，然后可将吸附剂装入柱内，装柱可用干法、湿法两种。 1. 干法装柱图3-4 层析柱将已选定并经处理的吸附剂通过漏斗缓缓流入柱中，必要时可轻轻敲打管柱，使之装填均匀，装毕后，在吸附剂表面铺层滤纸，然而打开旋塞，并从管口徐徐加入洗脱剂，注意勿冲起吸附剂，吸附剂润湿后，注意柱内要无气泡；但干法装柱常会在柱内出现气泡，使层析时发生沟流现象。2. 湿法装柱先在柱内加入已选定的洗脱剂，将下端旋塞稍打开，将吸附剂缓缓加入管中，加入的速度不要太快，以免带入空气。必要时轻轻振动管柱，有助于填充均匀，并使吸附剂带入的气泡外溢。 装填完毕后，可加入试液，前面已提到，溶解试样的溶剂极性应与洗脱剂相似，将试液小心地注入管柱上端，勿使吸附层受到扰动。试液要浓，体积要小，这样使试样集中在管柱顶部层可能小的范围内，以利于展开。若试样难溶于极性与洗脱剂相似的溶剂中，可先溶于适当溶剂中，加入少量吸附剂，拌匀，待溶剂挥发后，再将吸附着试样的吸附剂加于柱中吸附层上，然后进行层析分离。 将已选定的洗脱剂小心地从管柱顶端加人柱中，勿冲动吸附层，并保持一定液面高度，控制流速，一般为0.152mL/min。若是有色物质，展开后可看到不同颜色的谱带。 分离后的各组分，可分段洗脱，分别测定，就可将整条吸附剂从柱中推出，分段切开，分别洗脱后测定。 由于柱层析可处理较大量的试样，因而常用来提纯某些物质。四、液相色谱的基本理论 1. 基本保留方程式 假设有A和B两种组分在层析柱上进行分离，溶质分子在行经层析柱的过程中是保持分配平衡的，则每一种组分在平衡状态时两相间的浓度比，称为分配系数(KD)KD值愈大，则该组分在固定相中浓度分配愈大，较难洗脱下来，反之则易于洗脱。故根据KD值的大小，可以判断两种组分分离的难易。 如果试样组分的进样量非常小时，可获得对称性的色谱峰(分配系数与试样浓度呈线性关系)，在这样的条件下，可以把达到最大峰值的洗脱时间与平衡分配系数联系起来，这个时间叫保留时间( tR)，如图3-5所示图3-5 保留时间(tR)色谱示意图(w为峰宽 to为非滞留时间) 洗脱时间是流动相流速的函数，因为最基本的留值参数是保留体积(VR)。所谓保留体积就是层析柱上洗脱下某一组分所需流动相的毫升数。任一组分的保留体积，可直接从测量该组分的保留时间乘以用mL/ S表示的体积流速而得到，即 VR = tR F0 ( 3 4 )F0为体积流速。 图3-5还给出了非滞留（或称非吸着)组分的保留时间(t0)，即在固定相中，完全不吸附或不溶解的物质。因此它与流动相以同一速率流过柱子，其保留体积是 VM = t0 F0 ( 3 5 )VM是柱子中所含有流动相总体积的一个量度，又称柱的“死体积”。 对于任何色谱过程的基本保留方程式可用下式表示 VR = VM + KDVs ( 3 6 )式中，Vs是固定相的体积，这个色谱的基本方程式，将组分的保留体积与柱的死体积及分配系数和固定相体积的乘积联系起来。2. 容量因子()其定义为：( 3 7 ) 容量因子基本上是样品组分的量在两相间的比例，是当样品通过整个柱时，分配程度的一个尺度，将(3-6)和(3-7)结合起来，得( 3 8 )由此可见，当 = 0时，VR VM，表明样品组分不被滞留(即不被吸着)。 将(3-4)、(3-5)代人(3-8)式，得： （3 9）一般流动相的流速常保持恒定，因此，容量因干()可以保留时间表示出：容量因子()就是净保留时间与非滞留(非吸着)时间的比值。非滞留时间(t0)等于柱长(L)除以流动相的线速度(V)，即等于L/V，因此，(3-9)式可改为( 3 10 ) 此式给出了保留值与平衡，柱长和流动相流速间的基本关系。柱长加长一倍，保留时间也相应加大一倍，而流动相流速增加一倍，保留时间就相应减半。通过与容量因子的关系，保留时间也与固定相和流动相的相对量有关，较大量的固定相将导致较大的保留时间，影响保留值的另一个因素分配系数(KD)，KD愈大，保留时间也愈长。 相对保留值()，或叫分离因数，也是一个重要的色谱参数。所谓相对保留值()，就是两个组分净保留时间之比，也可以看作是两个组分容量因子之比，或者是两个组分分配系数之比，即( 3 11 )KD值相差愈大，或两容量因子相差愈大，分离因数()就愈大，两组分分离率愈高。 3. 分辨率 在柱色谱中，为了定量描述两个相邻谱带之间的分离效果，一般采用分辨率(Rs)，或称分离度，其定义为两谱带中心之间的距离除以同单位表示的谱带平均宽度，即(以时间单位表示)( 3 12 )或(以体积单位表示)( 3 13 )从峰的转折点所引切线与基线相交，即可求得峰宽w。保留时间tR或保留体积VR反映了色谱的热力学性质，它与被分离组分固定相与流动相的性质有关。当色谱体系确定后，某一组分的保留时间或保留体积由该组分的性质决定。因此，保留时间或保留体积是色谱定性的基本方法。谱峰的宽度反映了色谱的动力学性质，它与流动相的流速，固定相的粒度等有关。分辨率Rs综合了色谱过程的热力学和动力学特性，比较全面地表示出两种组分色谱分离的实际效果。当相邻两组分色谱峰保留值之差愈大，或两组分色谱峰的宽度愈窄，分辨率就愈大，表示两组分色谱分离的效果愈好。 4. 塔板理论 当试样组分在层析柱中分离时，总伴有谱带的展宽，这时组分的分离是有害的。为了描述怎样衡量一根层析柱的好坏，即色谱展宽的程度。Marmt和Synge首先将蒸馏塔板理论用于色谱分离中，把层析柱比拟分馏塔，并假定每个塔板高度间隔内，被分离组分在两相间达到分配平衡。保留体积小的，或分配系数小的，先从层析柱中流出。色谱中的塔板理论，虽然是半经验性的理论，但可用理论塔板数N和理论塔板的高度H来衡量层析柱的效率。对一根层析柱来说，N值愈大，柱效愈高；H愈小，柱效愈高，计算理论塔板数N值，常采用如下公式( 3 14 )式中VR是组分的保留体积，w是峰宽，是高斯函数的标准偏差，以体积为单位表示。 理论塔板数N值，也可用下式计算：( 3 15 )式中tR是组分的保留时间，st是以时间单位表示的高斯函数的标准偏差。 若层析柱的理论塔板高度为H，理论塔板数为N，层析柱的高度为L，则( 3 16 ) 理论塔板数和理论塔板高度虽然可以用来衡量层析柱的效率和表达色谱峰的扩张程度，但它不能正确反映色谱过程的实际情况。目前，特别注意从动力学方面，即速率理论，来研究谱峰扩宽的问题。 5. 速率理论 塔板理论对于衡量一个层析柱的效率，无疑是有用的。但是，由于这种理论的依据是理想状态下的分配平衡，而没有考虑层析过程的动力学因素，如填充剂颗粒的大小，溶质的扩散，流动相的流速等。 1952年Lapidus和Anicendson提出了速率理论，Deeniter和Zuiderweg等于1956年进一步发展了这一理论。这个理论从层析柱的动力学因素考虑到扩散的影响，以及传质过程受扩散控制的情况。 速率理论认为组分在层析柱中运动而使谱带变宽的现象称为区域扩张或谱带扩张。谱带扩张原因是由下列三个因素引起的：沟流扩散、分子扩散和传质过程。 （1）沟流扩散 由于层析柱装填了颗粒大小不均匀的填充剂，当溶质分子以一定速度流过层析柱时，一部分溶质分子将从柱中敞开的通道随流动相更加迅速地通过，另一部分溶质分子将扩散进入许多弯曲的通道而缓慢通过，并在流动相中形成类似沟流(或涡流)的流动。由于溶质分子在柱中的通道不一样，他们在柱中的保留时间也不一样，因此起谱带的扩张，并用下式表示 ( 3 17 )式中Hp是沟流扩散提供的塔板高度，dP是填充剂颗粒的平均直径，l是与装填的均匀性有关的因素，装换愈均匀，l值愈小。沟流扩散是使l值增大，大颗粒和非常小颗粒混杂装柱，要求均匀，很困难，并增加了流动的不平衡。因此，使用中等大小直径(1-6mm)的柱子，以单一细小的颗粒填充为宜，这样，谱带扩张将减小，柱效将提高。 （2）分子扩散 层析柱内存在着溶质分子的纵向浓度梯度，在流动相和固定相中就会引起纵向扩散的谱带扩张，在固定相中因扩散很小可忽略不计，而在流动相中，由于纵向分子扩散引起的谱带扩张，可用下式表示：( 3 18 )式中Hd是纵向分子扩散提供的塔板高度，Dm为溶质在流动相中的扩散系数，V为流动相的线流速，m为填充剂装填造成柱内扩散途径弯曲的校正因素，又称弯曲因子。分子的纵向扩散随溶质在层析柱中停留时间的增长而增加，高的流速减小了停留时间，因此，使用细小单一的颗粒，低扩散的流动相和在高速下操作。谱带扩张将减小，柱效将提高。 （3）传质过程物质在两相间进行分配而发生的质量迁移过程，称为传质过程。在层析柱中，每一个溶质分子都是连续地进入和离开固定相。当一个分子进入固定相，或被吸附时，它就落后于谱带的中心，而在后面连续地移动到柱的下端。当一个分子从固定相中出来，或被解吸下来，它就成为流动相的一部分，因流动相的流速往往较谱带流速大，这个分子的移动就较快于谱带中心的移动，这种不规则的前后运动引起谱带的扩张，某些分子将以偶然的机会移动在前，而另外一些分子则落在后。 因为吸附和解吸需要一定时间，因此，在层析柱的动流相中的溶质和固定相中的溶质都是在动力学的不平衡状态中。如图3-6所示。图3-6局部不平衡对谱峰扩张影响示意图 由于传质过程与固定相和流动相有关，因此需用这两项来说明谱带的扩张，固定相中传质提供的塔板高度Hs，用下式表示：( 3 19 )式中，q为固定相的构型因素，d为固定相的厚度，Ds为溶质在固定相中的扩散系数，V为流动相的线速度，r为不断随溶质和流动相的相对迁移速率变化而变化的数值。 在流动相中传质过程引起谱带扩张所提供的塔板高度比可用下式表示：( 3 20 )式中，w为柱系数，决定于填充剂结构，柱的直径和形状，dP是填充剂颗粒的直径，一般指平均直径，Dm为溶质在流动相中的扩散系数，v为流动相的线速度。 将以上各种情况引起的谱带扩张所提供的塔板高度综合起来，则层析柱总的理论塔板高度(H)如下：H = Hp + Hd + Hs + Hm( 3 21 )将(3-17)，(3-18)，(3-19)，(3-20)代入(3-21)式：( 3 22 )在液相色谱中，一般Hd和Hm很小，可略，于是 H = Hp + Hs = 2dp + qrd2v/Ds( 3 -23 ) 对于一个给定的层析柱，若固定上式中的其它变量，便可将总的理论塔板高度H表示为流速V的一元函数，即H = f(V)并用图3-7表示出两者关系。在色谱分离的实际工作中，我们应在色谱理论指导下，结合具体情况，选择最佳分离条件，使各种因素引起的谱带扩张流减小到最低限度，达到提高色谱分离效果的目的。图3-7 理论塔板高度与流动相流关系3-2 纸色谱法 图3-8 上行法二元组分纸色谱带一、纸色谱法原理 纸色谱法是根据不同物质在两相间的分配系数的不同而进行分离的，因此属于分配色谱法的一种类型。这种方法设备简单，操作方便，又是一种微量分离方法，既能分离无机元素，又能分离有机化合物，应用广泛。 纸色谱法是用滤纸作为载体，先将滤纸放在饱和水蒸气的空气中，滤纸吸收水份后(一般滤纸吸附约等于本身重量20%的水份，称为吸附水)生成水合纤维素络合物，并固定在滤纸上作为固定相。将待分离的试液用毛细管滴在滤纸的原点位置上，另取一合适的有机溶剂作流动相(展开剂)，流动相由于滤纸的毛细现象不断地在纸上渗透扩展，而与固定相相遇，在相遇的每一瞬间，可以认为是一个体积无限小的流动相与一个体积无限小的固定相接触，试样即在它们中间不断进行分配，在滤纸渗透展开的全过程中，可认为是无限个流动相在无限个固定相中移动，物质即在两相中作无限次抽提，溶解，再抽提再溶解，由于物质在两相溶剂中溶解度不同，即分配系数不同，因此就在两相间一次又一次的分配过程中(相当于一次又一次的萃取)分配比大的组分移动得快，分配比小的组分移动得慢，从而将它们逐个分开，表现在纸上的相对位置即不同，这样就形成一系列的点或一系列的谱带。经一定时间展开后，取出滤纸，喷上显色剂显色，可得到图3-8所示的色谱带。 在多数情况下，色谱带中的斑点也经常是模糊或稍带拖尾现象，这主要是由于滤纸对样品表现一定吸附力的原因，纸本身就是一种吸附剂，因此纸色谱作用机理，除分配作用外，还有一定的吸附作用，但分配作用是主要的，为减少斑点的拖尾现象，通常在展开剂中加入一定量的水，这部分水被滤纸吸附作为固定相，并使滤纸吸附性降低。 前面讨论中介绍了纸色谱法中水作为固定相的分配机理，但在实际操作中常常用跟水易混的有机溶剂(如乙醇、丙酮等)作展开剂使用，此时把水作为纸的固定相是不易理解的，因而为更清楚理解这种分配机理，可进步从纸的结构上进行讨论。滤纸的化学组成是纤维素的集合体(C6Hl0O5)n其分子内存在许多亲水性大的羟基。当含水的有机溶剂在滤纸上渗透时，滤纸内的羟基即把水分子从有机溶剂中吸引到纤维索分子内部，当纤维素吸附一定量水分时，羟基亲水性强度与有机溶剂亲水性强度可达到一定平衡，即水分子按一定比例分配在有机溶剂与滤纸中间，在滤纸中的水分即起到固定相作用，因此物质通过在滤纸中的水和有机溶剂间的分配系数的不同以达到分离之目的。二、移动速率及其影响因素1. Rf值 各组分在纸色谱中的位置，即移动速率比可用移值Rf表示，已知比移值是溶质分子和流动相分子在展开过程中移动速度的相对值，因此在纸色谱中如图3-8，对于组分A，从式(3-3)已知 对于一定的纸色谱体系，Vs、Vm为定值，Rf值只与分配系数KD有关，不同的组分因其KD值不同而有不同的Rf值，这就是物质定性的依据。另外，根据各种物质Rf值间的差异大小，亦是判断彼此能否分离的依据。但由于影响Rf值的因素很多，从文献上查得的某条件下的Rf值只能供参考。为了进行定性鉴定，必须用纯物质在相同条件下进行对照层析方可。2. 影响Rf值的因素 Rf值是纸色谱分离工作中唯一用数值表示的参数，由于各种因素的变化常常会影响它作为一常数处理的重复性，所以搞清影响Rf值的各种因素对纸色谱法是非常重要的。 温度的影响图3-9 温度Rf值的影响(10%丙醇水) 纸色谱对温度的要求并不十分严格，一般在室温下进行是可以的。但是温度可影响分配系数的变化，而这个方法的机理是利用物质分配系数的不同而进行分离的，因此温度的改变将影响Rf值的变化，而且展开剂组成也受温度影响而有一定程度的改变，但这些影响在室温范围内是很小的。例如氨基酸在丙醇水溶液中展开时，温度对Rf值影响由图39看出，在室温范围内几乎无显著变化，在用苯酚作展开剂时，温度在7一25范围内几乎无影响，但如用可立啶分离氨基酸时，温度对Rf值的影响非常明显，又如图1NHCl溶液饱和丁醇分离Cd2+时，温度在0、17、25时，Rf值分别为0.22、0.35，0.57，看出温度的影响将是十分大的。 滤纸种类对Rf值的影响 滤纸的种类对Rf值有一定影响，日本科学家柴田村冶观察了5种不同的滤纸对Rf值的影响，现列表于下：表3-1 滤纸种类对Rf值的影响(展开距离15cm)滤纸种类WhalmanNo.3K.KNo.52K.KNo.2K.KNo.131K.KNo.502NHCl饱和正丁醇Hg2+Cd2+Fe3+Cu2+0.790.660.220.170.730.6l0.230.130.740.640.200.140.720.600.200.130.720.620.200.148%浓盐酸混合的丙酮Co2+0.570.480.540.520.55Mn2+0.400.400.380.350.37Ni2+0.190.200.130.130.13因此，在记录Rf值数据时，应注明所用滤纸的种类。 在纸色谱中，滤纸是载体，滤纸的吸附水又是固定相，一般要求使用的滤纸应具备以下条件： a. 滤纸中应不含有水或有机溶剂能溶解的杂质。 b. 滤纸被溶剂浸润时，不应有机械折痕和损伤，即应具有一定的强度。 c. 滤纸对溶剂的渗透速度要适当，渗透速度太快时易引起斑点拖尾，影响分离效果，速度太慢，则耗费时间太长。d. 纸质应均一，否则会影响重现性，特别是对定量工作这点尤为重要。 展开距离对Rf值的影响 展开溶剂渗透距离对Rf值影响实验结果列于下表表3-2 展开距离对Rf的影响(日本K.K No.2滤纸)溶剂距离3NHCl饱和丁醇含8%浓盐酸的丙酮Rf离子15cm20cm15cm20cmHg2+Ca2+CO2+Mn2+Fe3+0.740.260.140.170.320.800.300.200.200.350.870.600.540.350.920.700.610.40展开溶剂的渗透距离与渗透速度也存在一定关系。开始很快，随后逐渐减慢，当渗透距离达到一定高度时，渗透速度即减小到难以感觉的程度。这个现象可用下式定量的表示出来h2 = Dt式中h表示溶剂渗透高度(min)，t表示时间(分)，但应根据滤纸刚放人展开剂中，开始展开的10分钟，D是与滤纸种类展开剂的性质有关的常数，由此式很容易看出，溶剂的渗透高度与渗透时间成抛物线关系，如图3-10所示。所以在同系列实验中应尽量使用同类滤纸和保持一定的展开距离，在记录Rf值的数据时，应把所用的滤纸种类及展开距离和展开时间同时记录。图3-10 溶剂的渗透 共存物质及试样溶液性质的影响 纯物质的Rf值与它在样品中得的Rf值常常存在一定的偏差。这主要是由于一些共存物质的相互影响所致，如在氨基酸的试样中存在NaCl时，一般说来随着NaCl浓度增加，Rf值有一定程度减少(如图3-11)所示，由于无机盐的存在，常常使有机纸色谱的分离效率降低，因此有时需对样品进行预先脱盐处理。图3-11 共存盐的影响(32%丙醇水)试样在溶液中的状态和性质对Rf值也有一定的影响，如把喹啉作成硫酸盐用丁醇一醋酸水(4:1:5)展开时的Rf值为0.42，如喹啉以游离碱状态展开时，其Rf值为0.92。在无机离子分离时，常来用含无机酸的展开剂，以防止金属离子水解，因为金属离子水解，往往以多种形式存在，这样一个组分可以出现几个斑点，影响分离。但溶剂的酸度对Rf值也有一定的影响，因此在配制时必须严格控制一定的浓度。 3. 比移值的意义 Rf值是物质定性分析的基本数据一定条件下，物质在某一固定溶剂中分配系数是定值。因此，Rf值也是个定值，这就是纸色谱的定性基础。在无机纸色谱分析中，一般金属的离子都有其固定的Rf值，见表3-3和表3-4。表中(T)表示斑点拖尾。表3-3 普通金属离子的Rf值溶剂Rf离子2mol/L HCl饱和丁醇3mo1/LHCl饱和丁醇异丙醇含10%5mo1LHCl乙醇含10%5mol/LHCl丙酮含10%浓HCl异戊醇24%浓.HCl.26%Ag+Hg2+Pb2+Hg2+Bi3+Cu2+Cd2+As3+Sb3+Sn2+Sn4+A13+Cr3+Fe3+Zn3+Mn2+Co2+Ni2+Ca2+Sr2+Ba2+Mg2+Na+K+0.00.930.750.560.170.610.530.520.670.670.070.090.190.620.110.100.090.050.050.030.00.950.00.820.690.300.780.650.780.820.820.210.240.450.760.270.260.260.120.100.090.060.050.031.00.840.280.840.660.770.880.350.280.350.870.370.270.230.110.050.230.150.020.08(T)0.161.00.940.471.00.500.850.970.370.470.560.930.360.320.340.110.040.330.080(T)1.00.6(T)1.00.940.720.930.720.940.940.940(T)0(T)0.970.890.400.590000.010.840.200.840.550.370.820.790.800.910.070.090.940.800.110.160.090.080.040.020.100.04表3-4 贵金属的Rf值AuDsPtPdRhlfRu丁酮含30%浓HCl0.95-0.970.92-0.930.76-0.840.61-0.650.06-0.160.06-0.160.07戊酮含30%浓HCl0.91-0.920.89-0.910.750.530.11-0.170.11-0.170.07乙醚:丁醇：浓HCl（1:2:2.5）0.980.840.640.12乙醚:戊醇:浓HCl(1:2:1.5)0.950.700.520.09为了得到准确和重现性好的Rf值，必须严格控制影响Rf值，如：温度，溶剂的pH、展开距离，展开时间和滤纸型号等，另外，还要根据地点的颜色，与标准物此较是否样，未知物的鉴定常要采用几种不同的展开剂，得出几个Rf值都与纯品的Rf值致，才认为可靠。 Rf值是判断元素间分离效果的依据 在一定条件下，两组分间的Rf值相差愈大(Rf值大)愈易于分离，例如用不同展开剂分离：K+、Rb+，Cs+，其Rf值见下表。表3-5 不同展开剂分离K+、Rb+、Cs+的Rf值HCl饱和的苯酚苯酚甲醇-HCl(70:10:20)RfRfRfRfK+Rb+Cs+0.190.260.480.070.220.000.190.460.190.27显然，用后一种展开剂分离效果较好。 根据Rf值选择纸条长度 用上行法或下行法展开时，就有一个纸条长度问题，纸条过短分离