蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的克隆原核表达及其功能分析.docx

doi: 10.13345/j.cjb.1305312014 chin j biotech, all rights reserved 生物技术与方法 蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的克隆、原核表达及其功能分析杜次 1,2，李菁 1,2，唐云涛 1,2，彭清忠 1,21 吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首4160002 植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首416000摘 要 : 赖氨酸脱羧酶 (lysine decarboxylase, ldc) 是抗老年痴呆药石杉碱甲生物合成的第一个酶。为了研究蛇足石杉中 ldc 的特性和功能，以其总 rna 为模板，通过 rt-pcr 扩增得到 2 个赖氨酸脱羧酶基因 ldc1和 ldc2，克隆至 pmd19-t 中测序发现，两基因同源性为 95.3%，分别编码 212 和 202 个氨基酸。将两基因 引入 pet-32a(+)构建重组表达质粒 pet-32a(+)/ldc1 和 pet-32a(+)/ldc2，分别转入 bl21(ed3)中进行诱导表 达，在 30 条件下获得可溶性表达产物 trx-ldc1 和 trx-ldc2；采用 ni-nta 亲和层析法纯化目的蛋白，建 立酶促反应体系分析其脱羧酶活性，薄层层析 (tlc) 检测表明重组融合蛋白 trx-ldc1 和 trx-ldc2 均能催 化赖氨酸脱羧生成尸胺。利用生物信息学软件分析发现 ldc1 和 ldc2 理化性质存在差异，但预测的二级结构 和三维结构基本一致。关键 词 : 蛇足石杉，赖氨酸脱羧酶，基因克隆，原核表达，酶活性，结构预测received: october 15, 2013; accepted: december 10, 2013supported by: national natural science foundation of china (no. 31260081), scientific research fund of hunan provincial educationdepartment (no. 13a078).corresponding author: qingzhong peng. tel: +86-743-8725365; e-mail: 国家自然科学基金 (no. 31260081)，湖南省教育厅科学研究基金 (no. 13a078) 资助。杜次, 李菁, 唐云涛, 等. 蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的克隆、原核表达及其功能分析. 生物工程学报, 2014, 30(8):12991307.du c, li j, tang yt, et al. cloning, prokaryotic expression and characterization of lysine decarboxylase gene from huperzia serrata. chin j biotech, 2014, 30(8): 12991307.1300issn 1000-3061 cn 11-1998/q chin j biotech august 25, 2014 vol.30 no.8cloning,prokaryoticexpressionandcharacterizationoflysine decarboxylase gene from huperzia serrataci du1,2, jing li1,2, yuntao tang1,2, and qingzhong peng1,21 college of biology and environmental sciences jishou university, jishou 416000, hunan, china2 key laboratory of plant resource conservation and utilization, college of hunan province, jishou 416000, hunan, chinaabstract: huperzine a is a promising drug to treat alzheimers disease (ad). to date, its biosynthetic pathway is stillunknown. lysine decarboxylase (ldc) has been proposed to catalyze the first-step of the biosynthesis of huperzine a. to identify and characterize ldcs from huperzia serrata, we isolated two ldc fragments (ldc1 and ldc2) from leaves of h. serrata by rt-pcr and then cloned them into pmd19-t vector. sequence analysis showed that ldc1 and ldc2 genes shared 95.3% identity and encoded the protein of 212 and 202 amino acid residues respectively. thus, we ligated ldc genes into pet-32a(+) to obtain recombinant expressing vectors pet-32a(+)/ldc1 and pet-32a(+)/ldc2 respectively. we further introduced two expression vectors into escherichia coli bl21(de3) and cultured positive colonies of e. coli inliquid lb medium. after inducing for 4 hours with 260 g/ml iptg at 30 , soluble recombinant trx-ldc1 andtrx-ldc2 were obtained and isolated for purification using a ni-nta affinity chromatography. we incubated purified recombinant proteins with l-lysine in the enzyme reaction buffer at 37 and then derived the reaction products using dansyl chloride. it was found that both trx-ldc1 and trx-ldc2 had decarboxylase activity, could convert l-lysine into cadaverine by way of thin layer chromatography assay. further, bioinformatics analysis indicated that deduced ldc1 and ldc2 had different physicochemical properties, but similar secondary and three-dimensional structures.keywords: huperzia serrata, lysine decarboxylase, gene cloning, prokaryotic expression, enzyme activity, structure prediction蛇足石杉huperzia serrata (thumb.) trev.为石杉科石杉属蕨类植物，别名千层塔、金不 换、蛇足草等，系我国传统中草药，常用于治疗瘀血肿痛、跌打损伤、肌肉痉挛、精神分裂等疾病1-2。上世纪80年代我国科学家首次从蛇 足石杉中分离出石杉碱甲 (huperzine a)，后经研究证明是一种高效、可逆、选择性强的乙酰 胆碱酯酶抑制剂，治疗老年痴呆症 (alzheimers disease, ad) 疗效显著，而且具有毒性低、生物利用率高、易穿透血脑屏障、药效长等优点2-4。 由于优于同类其他药物，石杉碱甲作为新一代治 疗老年痴呆药物引起医药界的极度重视，而其药源植物蛇足石杉也受到国内外学者的广泛关注。 蛇足石杉生长缓慢、资源更新周期长，而石杉碱甲在全草中含量甚微，近些年由于提取石杉碱甲的高额利润，对野生蛇足石杉进行地 毯式采收，使得该类植物资源日趋枯竭。一些学者尝试寻求新途径获取石杉碱甲，如化学合成法、组织培养法、微生物发酵法等5-10，虽取 得一些进展，但离生产实践有很远距离。解决资源短缺和实现新途径生产石杉碱甲，首先有 必要从分子水平理解石杉碱甲的生物合成机 制。目前一些研究表明，石杉碱甲生物合成是以赖氨酸 脱 羧 酶 (lysine decarboxylase, ldc) 介导 赖氨 酸脱 羧开 始， 接着 由铜 氨氧 化 酶 (copper amine oxidase) 催化尸胺生成四氢吡啶(2,3,4,5-tetrahydropyridine)，然后经过一系列的 酶促反应生成石杉碱甲3,11-12。sun 等13曾对蛇/cjbcn1301杜次 等/蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的克隆、原核表达及其功能分析足石杉中铜氨氧化酶基因进行克隆和功能鉴 定，但是目前尚未见赖氨酸脱羧酶基因功能表 征方面的研究报道，而关于石杉碱甲整个合成途径中的关键基因和调控机理也知之甚少。鉴于此，本研究拟采用 rt-pcr 方法从蛇足石杉中 克隆赖氨酸脱羧基因，对其进行重组表达和功能分析，以及生物信息学分析，以期丰富赖氨酸脱羧酶家族分子信息，为阐明蛇足石杉中石 杉碱甲生物合成机制提供参考数据。1.2 方法1.2.1 总 rna 提取及 cdna 合成野外采集蛇足石杉完整植株 (带土壤)，运 回实验室。从植株上剪取幼嫩叶片约 100 mg， 置于液氮预冷的研钵中迅速研磨成粉，立即使 用 rnaiso plus 试剂提取总 rna。采用 1%的琼 脂糖凝胶电泳检测 rna 质量，并用分光光度计 测定 rna 浓度，提取的总 rna 于70 保存 备用。利用 takara 公司提供的 primescript 反 转录试剂盒，按其说明书操作流程，以蛇足石 杉总 rna 为模板反转录合成 cdna 第一链。1.2.2ldc 基因克隆与测序 从ncbi数据库中搜索赖氨酸脱羧酶相关基因进行同源比对，根据序列保守区域，采用 vector nti软件设计一对包含全长ldc基因的扩 增引物ldc-f和ldc-r (表1)，以cdna第一链为 模板扩增蛇足石杉的ldc基因片段。配制50 l 反应 体系 ： 10ex pcr 缓冲 液 5.0 l ， dntps (2.5 mmol/l) 4.0 l，引物 (ldc-f和ldc-r) 各1.0 l，ex taq聚合酶0.25 l，cdna 4.0 l， 补加ddh2o至终体积50 l；pcr反应程序：94 预变性5 min；94 变性30 s，52 退火30 s，72 延伸1 min，30个循环；72 延伸10 min，4 保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。材料与方法11.1材料 1.1.1菌株与质粒大肠杆菌 bl21(de3)、大肠杆菌jm109，质 粒pet-32a(+) 为 本 实 验 室 保 藏 ；质粒 pmd19-t 购自大连宝生物工程有限公司(takara)。1.1.2酶和试剂ex taqdna聚合酶、t4 dna 连接酶、nco和 xho限制性内切酶，dl2 000 dnamarker，protein molecular weight marker (low)，total rna 提取试剂 rnaiso plus，primescript1st strand cdna synthesis kit，agarose gel dna fragment recovery kit ver.2.0 和 minibest dna fragment purification kit ver.3.0 均购自takara 公司；ni-nta sefinosetm resin kit， iptg 和磷酸吡哆醛均购自上海生物工程有限公 司；赖氨酸 (l-lysine) 和尸胺 (cadaverine) 购 自 sigma 公司；其他试剂均为分析纯。1.1.3 材料蛇足石杉样品采自湖南省古丈县高望界自 然保护区，经吉首大学张代贵高级实验师鉴定 为蛇足石杉。表1本研究所用引物序列table 1primers used in this studynamethe underline parts are the restriction endonuclease primerprimer sequence (53)ldc-fatggaagcgttcattgatccgldc-rttataccagacgttcaatctcccldc-efcatgccatggaagcgttcattgatccgldc-erccgctcgagttataccag acgttcaatc tc1302issn 1000-3061 cn 11-1998/q chin j biotech august 25, 2014vol.30 no.8利用 agarose gel dna fragment recoverykit ver.2.0 对 pcr 产物进行割胶纯化，电泳检 测纯化结果，并用紫外分光光度计测定其浓度。2上样缓冲液，沸水浴 3 min，短暂离心后于12%的 sds-page 中电泳检测。1.2.4表达产物纯化及活性鉴定 将重组菌接种于 1 l 液体培养基中培养、诱导表达，收集菌体，pbs 洗涤 3 次，使用 ni-nta sefinosetm resin 蛋白纯化试剂盒中的结合缓冲液重悬菌体，溶菌酶酶解，冰浴超声破碎细胞，12 000 r/min 离心收集上清液。按照试剂盒操作 说明，采用 ni-nta 纯化柱进行重组蛋白纯化，12%的 sds-page 电泳检测纯化结果。在 1.5 ml 离心管中配制 500 l 酶反应体 系，使各试剂终浓度分别为：磷酸钾缓冲 液 (ph 8.0) 100 mmol/l 、 磷 酸 吡哆醛 (palp)0.20 mmol/l、赖氨酸 10.0 mmol/l、重组赖氨酸 脱羧酶 1.00 mg/ml。将反应混合液于 37 水浴 锅中反应至出现浑浊，向反应液中加入 1 滴浓 hcl 混匀，然后加入 500 l 氯仿剧烈振荡，10 000 r/min 离心 10 min 弃去两相中间不溶物。 氮吹仪 40 吹干，干燥后的两相残留物用 1 mol/l 的 hcl 溶解，取溶解后的上清用丹磺酰氯衍生剂进行衍生，同时对赖氨酸和尸胺标准 品进行丹磺酰氯衍生，氯仿萃取浓缩衍生物进 行薄层层析 (tlc) 检测，展开剂为氯仿、乙醚、 三乙胺 (配比为 812)。使用全自动点样仪 (camag ats 4，瑞士) 点样，全自动展开仪 (camag adc 2，瑞士) 进行展开，然后用 tlc visualizer 进行检测成像。1.2.5ldc 基因编码蛋白的生物信息学分析ldc 基因编码蛋白 的理 化性质 预测 采用 expasy bioinformatics resource portal 提供的 在 线 工 具 protparam (/ protparam/)；ldc蛋白质结构搜索分别采用在线 工 具 prosite (/) 和按厂家说明书将纯化的dna 片段连接至载体pmd 19-t 上，转化感受态细胞 jm109，通过氨苄抗性和蓝白斑筛选，挑取阳性菌落进行 pcr 检测，从检测合格的重组菌株中提取质粒，送 takara 公司测序。1.2.3 ldc 基因的原核表达根据 ldc 基因序列设计一对引物 ldc-ef 和 ldc-er (表 1)，分别在引物 5端引入 nco 和 xho酶切位点。以 1.2.2 中的重组质粒为模 板进行 pcr 扩增，纯化扩增产物，采用限制性 内切酶 nco和 xho进行双酶切；同时对表达 载体 pet-32a(+)进 行 双 酶 切。采用 minibest dna fragment purification kit ver.3.0 对酶切产 物进行纯化，分光光度计检测各酶切产物浓度。 利用 t4 dna 连接酶于 4 对两纯化产物进行连 接，将连接产物转化 bl21(de3)，在氨苄和氯霉 素抗性平板上筛选转化子。从平板上挑取多个菌 落进行全菌 pcr 检测，提取相应克隆子的重组质 粒，并进行 nco和 xho双酶切鉴定。将鉴定的阳性克隆子接种至 lb 液体培养 基，于 37 摇床培养 34 h (od600 约为 1.0)， 添加 iptg (终浓度 260 g/ml)，继续 30 恒温 摇床培养 (150 r/min) 4 h。同时以空载体重组菌 bl21(de3)/pet-32a(+)作对照。取经过诱导表达 的菌液于 1.5 ml 离心管中，离心收集菌体，用 pbs 洗涤和重悬菌体。重悬菌液分 2 份，其中 一份加入 2 l 溶菌酶 (100 mg/ml)，室温静置10 min 后反复冻融 3 次，12 000 r/min 离心10 min，收集上清液和沉淀。分别在上清、沉淀、 全菌 (另一 份 ) 和对照 组全菌中加入等体积的 /cjbcn1303杜次 等/蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的克隆、原核表达及其功能分析ncbi 在线工具 (/structure/cdd/wrpsb.cgi/)； 蛋白质二级结构分析 和 三 维 建 模 采 用 swiss-model (http:/ /)。trx-ldc1 和 trx-ldc2 融合蛋白，如图 3a 所示。trx-ldc1 和 trx-ldc2 融合蛋白大小约为40 kda，在重组菌破碎后的上清液和沉淀部分 均存在，其中沉淀部分含量较高，表明融合蛋 白的可溶性比例较少。根据融合蛋白所带组氨 酸标签，采用 ni-nta 柱对可溶性重组蛋白进行 纯化，获得纯度较高的融合蛋白 trx-ldc1 和 trx-ldc2，如图 3b 所示。结果与分析22.1ldc 基因的克隆和序列分析 根据植物赖氨酸脱羧酶相关基因和 est 同源序列设计保守引物，利用 rt-pcr 技术从蛇足2.3 重组赖氨酸脱羧酶的活性鉴定按 照 文 献 14 和 15 方 法 分 别 建 立trx-ldc1 和 trx-ldc2 融合蛋白酶促反应体系，37 进行催化反应后加入浓 hcl 终止反应，并 通过氯仿萃取去除重组融合蛋白；两液相反应 物干燥后与丹磺酰氯进行酰基化衍生反应，由 于丹磺酰基具有强烈荧光，衍生物能利用薄层 层析 (tlc) 进行检测，如图 4 所示，两融合蛋 白反应体系中均有尸胺生成 (泳道 2 和 3)，而 加热灭活的融合蛋白反应体系中未检测到尸胺 (泳道 4 和 5)，据此，可以推测融合蛋白 trx-ldc1 和 trx-ldc2 具有赖氨酸脱羧酶活性，能催化赖 氨酸脱羧生成尸胺。石杉茎尖嫩叶总 rna 中扩增获得2 个基因片段，如图 1 所示，长度分别约为 1 100 bp 和650 bp。对扩增所得的 2 个基因片段进行克隆测 序，采用 vector nti 软件分析，发现两序列均 包含有完整开放阅读框，长度分别为 639 bp 和609 bp，编码 212 个和 202 个氨基酸，两编码基 因分别命名为 ldc1 和 ldc2；同源比对分析发 现，ldc1 除在 3末端比 ldc2 多出 30 bp 小片 段外，其余序列均完全一致，两者同源性为 95.3%。将 2 个基因送 genbank 注册，accession number 分别为 jq308624.1 和 jq308625.1。2.2 赖氨酸脱羧酶基因的原核表达采用 1.2.3 中的引物进行 pcr 扩增时，分别在ldc 基因起始密码部位引入 nco酶切位点，终止 密码后引入 xho酶切位点。纯化的扩增产物经nco和 xho双酶切、回收后，与经过同样双酶 切的表达载体 pet-32a(+)进行连接，即构建成重组 质粒 pet-32a(+)/ldc，构建过程如图 2 所示。重组质粒 pet-32a(+)/ldc 转化 bl21(de3)， 通过 pcr 扩增和 nco/xho双酶切筛选阳性 克隆子。将鉴定正确的重组菌株接种于 lb 培养基 中培养，经 iptg 低 温 诱导表达发 现，含 pet-32a(+)/ldc1 的 重 组 菌 株 和 含 pet-32a(+)/ldc2 的 重 组 菌 株 分 别 产 生 图 1赖氨酸脱羧酶基因的 rt-pcr 扩增fig. 1rt-pcr amplification of ldc gene fromhuperzia serrata. m: dna marker; 1, 2: rt-pcrproducts of ldc gene; ct: 1304issn 1000-3061cn 11-1998/qchin j biotechaugust 25, 2014vol.30no.8图 2重组质粒 pet-32a(+)/ldc 的构建fig. 2construction of recombinant plasmid pet-32a(+)/ldc.图3 重组蛋白trx-ldc1和trx-ldc2的sds-page电泳fig. 3 sds-page analysis of recombinant trx-ldc1 and trx-ldc2. (a) unpurified recombinant fusion proteins. (b) purified recombinant fusion proteins. m: protein molecular weight markers; 1, 2 and 3: supernatant, precipitation and entire cell from bl21(de3) transformants including pet32a(+)/ldc1 respectively; 4, 5 and 6: supernatant, precipitation and entire cell from bl21(de3) transformants including pet32a(+)/ldc2 respectively; ct: recombinant cells only with pet-32a(+). ldc1: purified trx-ldc1; ldc2: purified trx-ldc2./cjbcn1305杜次 等/蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的克隆、原核表达及其功能分析化性质有一些差异。2.4.2ldc 的二级结构和三维结构预测 通过在线软件对 ldc1 和 ldc2 二级结构进行预 测，结果显 示 ldc1 的 二级结构 主要 由- 螺旋和 - 折叠结 构构 成，分 别 占 43.8% 和34.4%，无规则卷曲占 21.8%；同样 ldc2 的二 级结构也主要由 -螺旋和 -折叠结构构成，分 别占 43.5%和 34.2%，无规则卷曲占 22.3%。由 swiss-model 在线分析软件对 ldc1 和 ldc2 进行三维结构模建，得到三维模型如图 5 所示。 虽然 ldc1 比 ldc2 在 c 末端多出 10 个氨基酸， 但从二级结构预测和三维结构模建可知，ldc1 和 ldc2 的高级结构基本一致，从而表现出相 同的生物活性。图 4重组蛋白 trx-ldc1 和 trx-ldc2 酶促反应的tlc 检测fig. 4tlc detection of recombinant trx-ldc1/trx-ldc2 enzyme reaction. 1: cadaverine (cad); 2, 3:products of trx-ldc1/trx-ldc2 enzyme reaction respectively; 4, 5: products of boiling-inactivated trx-ldc1/trx-ldc2 enzyme reaction respectively; 6: l-lysine.2.4 ldc 基因编码蛋白的理化性质和空间结构预测 2.4.1 ldc 理化性质ldc1 基因预测编码 212 个氨基酸，ldc2 编码 202 个氨基酸，根据 expasy bioinformatics resource portal 提供的在线工具 protparam 对两 基因编码蛋白进行分析，推测 ldc1 分子式为 c1035h1650n274o302s10，分子量为 23.08 kda，等 电点 pi 为 5.59；带负电残基(asp + glu)为 28， 带正电残基(arg + lys)为 23；ldc1 的不稳定系 数为 31.96 ，脂 肪系 数 为 97.45 ，亲 水系 数 为0.008。ldc2 分子式为 c985h1589n267o282s9，分 子量为 21.97 kda，等电点 pi 为 7.74；带负电残 基(asp + glu)为 24，带正电残基(arg + lys)为25；ldc2 的不稳定系数为 25.59，脂肪系数为100.35，亲水系数为 0.013。结果表明两蛋白理图 5ldc1 和 ldc2 的三维结构模建fig. 5predicted three-dimensional structures ofldc1 and ldc2.讨论3目前有关石杉碱甲生物合成途径、代谢调控机理及关键基因功能的研究资料非常匮乏。 一些研究表明赖氨酸脱羧酶是参与石杉碱甲生 物合成的第一个酶/入口酶3,11-12，但是在蛇足石1306issn 1000-3061 cn 11-1998/q chin j biotech august 25, 2014vol.30 no.8杉和其他石杉科植物中均未见编码该酶基因的研究报道。本研究根据其他植物赖氨酸脱羧酶 基因和推测的 est 序列设计保守引物，从蛇足 石杉中成功克隆出 2 个赖氨酸脱酶基因 (ldc1 和 ldc2)，同源性达 95%，即 ldc1 除在 3末 端比 ldc2 多 30 bp 外，其余序列均一致；由于 两者的编码蛋白 ldc1 比 ldc2 多 10 个氨基酸， 生物信息学分析表明 ldc1 和 ldc2 理化性质 存在差异，但是其预测的二级结构和三维结构 基本一致，这与其后分析的两重组表达蛋白均 具有催化赖氨酸脱羧基功能相印证。根据这些 结果我们可以推测 ldc1 在 c 末端多出的 10 个 氨基酸并非其酶活性中心或底物结合区域序 列，或也非其他必需氨基酸序列，不影响该酶 的结构和功能；蛇足石杉中为什么存在如此形 式的 2 个 ldc 基因尚不清楚，但在此可进一步 推测 ldc1 和 ldc2 可能来源于同一祖先基因， 在进化过程中 ldc1 出现冗余片段，或者一个 基因是另一个基因整合到植物染色体中的拷贝 形式，整合过程中发生了插入或缺失突变等。 另外，通过氨基酸序列相似性比对还发现， ldc1和ldc2蛋 白 序 列 与 野 芭 蕉 musa balbisiana (bag70979.1)、玉米 zea mays (np001148565.1)、蒺藜苜蓿 medicago truncatula (xp003588965.1) 和拟南芥 arabidopsis thaliana (cab87668.1) 推测的 ldc 氨基酸序列具有较 高的同源性 (数据未提供)，该结果是否暗示低 等蕨类蛇足石杉与上述高等植物在进化上有较 近亲缘关系有待研究。为了验证克隆获得的 2 个 ldc 基因功能， 我们将其引入可溶性表达载体 pet-32a(+)，分别 于 37 、 30 和 25 进 行诱导 表达 ，sds-page 分析表明 37 条件下表达量最高，但重组蛋白均为包涵体，25 表达量非常低， 几乎检测不到重组蛋白 (数据未提供)；30 重组蛋白以包涵体和可溶性两种形式存在，但可溶性表达量比较低。如果要提高可溶性蛋白表 达水平，还需对表达条件做进一步探讨。将 30 诱导的可溶性蛋白 trx-ldc1 和 trx-ldc2 进行分离和纯化后，我们曾多次尝试用肠激酶对融 合蛋白进行酶切，遗憾的是酶切过程中蛋白变性产 生沉 淀析 出， 最后 我们 选用 融合 蛋白 trx-ldc1 和 trx-ldc2 进行酶活性分析，酶促 反应结果表明它们均具有催化赖氨酸脱羧生成尸胺的能力。根据 tlc 检测结果中底物赖氨酸和产物尸胺的比例，可初步确定重组融合蛋白 总体酶活性力比较低，其主要原因可能是酶反应条件不适宜所致，当然也不排除融合蛋白 trxa 片段空间位阻效应妨碍 ldc 与底物结合 等其他因素的影响。虽然已有学者研究了大豆 glycine max、烟 草 nicotiana glauca 、 多叶羽扇 豆 lupinus polyphyllus 和柳叶黄薇 heimia salicifolia 等植物的赖氨酸脱羧酶活性和功能16-20，但是至今 有关植物 ldc 的分子信息仍然知之甚少。本研究首次从蛇足石杉中分离出 2 个 ldc 基因，通 过生物信息学分析和原核重组表达研究了其编 码蛋白的结构和酶活性，这些结果为进一步阐述 ldc 的生物学功能及其编码蛋白的酶学性质 奠定基础。石杉碱甲作为新一代治疗老年痴呆的珍稀药物，随着对其生物合成入口酶 ldc 及 代谢过程中其他关键酶 (基因) 的逐步认识，将能全面解析其生物合成路径和分子作用机制， 为通过生物技术 (如组织/细胞培养、代谢工程 等 ) 手段解决石杉碱 甲药源问 题提供科学 依据。/cjbcn1307杜次 等/蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的克隆、原核表达及其功能分析referencesmicrobiol biotechnol, 2011, 38(9): 12671278.ma x, gang dr. the lycopodium alkaloids. natprod rep, 2004, 21(6): 752772.bunsupa s, katayama k, ikeura e, et al. lysine decarboxylase catalyzes the first step of quinolizidine alkaloid biosynthesis and coevolved with alkaloid production in leguminosae. plant cell, 2012, 24(3): 12021216.sun jy, morita h, chen gs, et al. molecular cloning and characterization of copper amine oxidase from huperzia serrata. bioorg med chem lett, 2012, 22(18): 57845790.kamio y, terawaki y. purification and properties of selenomonas ruminantium lysine decarboxylase. j bacteriol, 1983, 153(2): 658664.wang fq, liu f, meng y, et al. biogenic amines in salted duck analyzed by tlc combined with hplc. food sci, 2011, 32(14): 273276 (in chinese).王凤芹, 刘芳, 孟勇. tlc 和 hplc 法相结合分析盐水鸭中 的生物胺 . 食品科学学 报 , 2011,32(14): 273276.kim hs, kim bh, cho yd. purification and111guo b, xu ll, wei yh, et al. research advancesof huperzia serrata (thunb.) trev. chin j chinmater med, 2009, 34(16): 20182023 (in chinese). 郭斌, 徐玲玲, 尉亚辉, 等. 千层塔的研究进展. 中国中药杂志, 2009, 34(16): 20182023.ma xq, tan ch, zhu dy, et al. a survey of potential huperzine a natural resources in china: huperziaceae. j ethnopharmacol, 2006, 104(1/2):5467.ma xq, tan ch, zhu dy, et al. huperzine a from122133huperziaspecies-anethnopharmacological14review. j ethnopharmacol, 2007, 113(1): 1534.wang r, yan h, tang xc. progress in studies of huperzine a, a natural cholinesterase inhibitor from chinese herbal medicine. acta pharmacol sin, 2006, 27(1): 126.takahiro k, satoshi y, tohru f. total synthesis of(-)-huperzinea.orglett,2009,11(22):5354535