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细胞培养理论课 第一部分细胞培养基本知识李松第二部分细胞培养室的设置 细胞培养用液李松第三部分细胞培养的基本技术卿晨博士第四部分正常组织细胞的培养李松第五部分肿瘤细胞培养杨继红博士第六部分组织培养技术和应用卿晨博士杨继红博士 实验部分 参观实验室培养细胞的观察培养细胞生长曲线的绘制 第一章细胞培养基本知识组织培养工作始于本世纪之初 Harrison1907 Carrel1912 组织培养 细胞培养 器官培养组织细胞培养的主要优点 1 研究的对象是活的细胞 2 研究的条件可控制 3 研究的样本可以达到均一性 4 研究的内容便于观察 检测 5 研究的范围比较广泛 6 研究的费用相对较经济 细胞培养存在的不足 1 组织或细胞与体内相应者仍然存在差异 2 细胞培养存在一定的不稳定性也是其缺点之一 3 细胞培养对人员 设备等条件都要求较高 研究的内容 1 细胞与细胞之间的相互作用 2 细胞内部与细胞外界之间的作用 3 细胞内胞质的活动 4 胞质与胞核之间流动 应用领域 1 病毒学利用培养的细胞可获得大量病毒以产生疫苗及鉴定 2 免疫学杂交瘤一单克隆抗体技术 3 遗传学可以利用细胞培养技术进行染色体分析 细胞遗传学 4 肿瘤学细胞培养技术已广泛应用于肿瘤的研究和治疗 5 分化及发育6 细胞毒试验7 临床医学及生物技术方面的应用 一 培养细胞的特性 一 培养细胞的生长方式及类型1 贴附生长型细胞 上皮细胞型 其生长特点为细胞之间紧密相靠 互相衔接 具有连接成片能力 成纤维细胞型 其生长特点为细胞一般并不紧靠相连成片 而是排列为漩涡状 放射状 2 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物即可生长 肿瘤细胞及部分正常细胞 二 培养细胞的生长特点1 贴附细胞接种后5 10min可见细胞以伪足初期附着 接着细胞逐渐伸展开 细胞体的中心部分亦随之变为扁平 2 接触抑制及密度依赖性细胞生长汇合成一片时 其分裂增殖停止 这种生长特性即为密度依赖性调节 转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降 他们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长 三 培养细胞的生长过程1 单个细胞的生长过程 细胞周期细胞周期 间期 M期 G1期 S期 G2期 M期G1期 DNA合成前期 为下一步DNA复制和蛋白质合成作准备 S期 DNA合成期 本期的细胞活动主要为DNA的合成 G2期 DNA合成后期 M期 有丝分裂期 2 细胞系 cellline 的生长过程 原代培养 primaryculture 传代期 subculture 衰退期 3 每代细胞的生长过程滞留期 一般细胞滞留期约为24 96h 指数生长期 此期细胞增殖旺盛 成倍增长 适用于进行实验研究 持续3 5d 平台期 二 培养细胞生长的条件 一 细胞的营养需要1 基本营养物质 包括氨基酸 维生素 碳水化合物 无机离子 2 促生长因子 血清中含有多种上述细胞生长所需的物质 3 其它条件 温度 需在保持一定恒温 适宜的温度与取材的动物种类有关 高温比低温对细胞的影响细胞更为明显 气相 多数细胞需要有O2条件下才能生长 氧张力通常维持在略低于大气状态 体外培养细胞其气体环境一般应为95 空气加CO2的混合气体 pH 适于在pH7 2 7 4条件下生长 一般来说 偏酸的条件比偏碱的环境对生长有利 渗透压 人类血浆的渗透压约为290mmol L 多数培养细胞对渗透压有一定范围的耐受能力 无污染及无毒 微生物的污染 不同细胞类型的交叉污染 第二章细胞培养室的设置和准备工作一 细胞培养实验室的设置及设备 一 细胞培养实验室的设置细胞培养实验室应能进行 无菌操作 孵育 制备 清洗 消毒灭菌处理 储藏 1 无菌操作区 1 无菌操作室 2 净化工作台侧流式或称为垂直式 外流式或称为水平层流式 3 无菌操作箱2 孵育区3 制备区 进行培养液及有关培养用液等的制备 4 储藏区5 清洗和消毒灭菌区 二 细胞培养实验室设备1 常用的基本设备 1 显微镜 倒置显微镜 2 培养箱 恒温培养箱及CO2培养箱 3 干燥箱 4 水纯化装置 培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水 5 冰箱 6 细胞冷冻储存器 7 离心机 8 消毒器 9 滤器 10 各类培养用器皿 培养器皿 培养瓶 多孔培养板 吸管 加样器等 2 特殊设备 酶联免疫检测仪 超低温冰箱 流式细胞仪等 二 培养用品的清洗和消毒灭菌 一 培养用品的清洗1 清洗 1 浸泡 在5 稀盐酸溶液中浸泡过夜 以中和其碱性物质 2 刷洗 3 清洁液浸泡 由浓硫酸 重铬酸钾及蒸馏水配制而成 浸泡6h以上 2 冲洗 二 培养用品的消毒灭菌1 消毒灭菌的方法 1 干热消毒 2 湿热消毒 3 紫外线消毒 4 过滤除菌消毒 血清 合成培养液 酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等 微孔滤膜滤器 有孔径为0 6 m 0 45 m 0 22 m三种滤膜 注意滤膜的正面 光面 应向上 5 消毒剂及抗菌素 抗菌素的应用是为了预防 不能依赖抗菌素来达到消毒灭菌 常用的抗菌素为青霉素及链霉素 2 消毒方法的选择实验室中空气的消毒 过滤 紫外线消毒 电子灭菌灯 实验室的消毒 最常用的是以酒精擦拭 亦可以紫外线照射 培养器械的消毒 干热或湿热消毒 消毒剂浸泡或紫外线照射 培养用液体的消毒 高压蒸汽消毒 过滤方法除菌 第三章细胞培养用液及培养基一 培养用液1 水水为细胞培养所必需 在组织细胞培养中用水必须非常纯 2 平衡盐溶液维持渗透压 调节pH值 供给细胞所需的能量和无机离子成分 主要作为合成培养基 液 的基础液及用于洗涤组织 细胞等 平衡盐溶液主要以无机盐及葡萄糖配制而成 各种平衡盐溶液的主要不同点在于氯化纳的浓度 离子的浓度及缓冲系统不同 3 消化液 1 胰蛋白酶液 常用浓度为0 25 配制时应用不含Ca2 Mg2 和含血清的液体 2 EDTA 二乙烯四乙酸二钠 液 EDTA是一种化学螯合剂 主要作用在于能吸取Ca2 Mg2 使细胞分离 常用浓度为0 02 用无Ca2 Mg2 平衡盐液溶解 3 胶原酶 二 培养基 一 天然培养基1 血清小牛血清 胎牛血清 马血清 兔血清以及人血清等 血清虽是常用的天然培养基 对绝大多数细胞的生长有利 某些成份可能对细胞有害 2 血浆3 组织浸出液4 水解乳蛋白 二 合成培养基合成培养基给细胞提供了一个近似体内生存环境 又便于控制和标准化的体外生存环境 1 合成培养基基本成分氨基酸 以必需氨基酸为主 细胞仅能利用氨基酸的L型同分异构体 细胞对谷氨酰胺之有较高的要求 维生素 糖类 培养基中的碳水化合物包括葡萄糖 核糖 脱氧核糖 丙酮酸钠等 无机离子 培养基含有平衡盐液中的钾 钠等无机盐 有些培养基含有微量元素 如Fe2 Zn2 Ca2 等 其它成分 三磷酸腺苷 辅酶A 2 硫基乙醇 植物血凝素等 2 常用的合成培养基 1 199培养液 是Morgan Morton及Parker等人在1950年为培养鸡胚细胞研制的 2 Eagle培养液 由Parker首先备制 Eagle等根据胞质内的氨基酸及维生素的含量比基本培养液中大1 5倍 配制了最低必需培养液 Eagle sminimumessentialmedium MEM 又改良研究制成了BME BasalEagleMedium 和DMEM DulbeccoMEM 3 RPMI1640培养液 由Moor等研究成功 不仅肿瘤细胞而且很多正常组织细胞可用 4 Ham培养液 Ham首先备制 将其命名为F7 后改良为F10 F12培养基 这种培养基特别适合进行单细胞培养和克隆化培养 3 无血清培养基基础培养液 以HamF12和DMEM最为常用 辅加成分 1 培养基质 主要目的是帮助细胞附着贴壁 常用的培养基质有 纤维连结素 fibronectin 多聚赖氨酸 poly lysine 胶原 2 营养成分 主要目的是补加各种不同细胞生长所需以及已知血清中促进细胞生长的物质 3 酶抑制剂 目的是替代血清的保护作用 第四部分正常组织细胞的培养不同组织细胞和器官的结构功能 生长特性不同 在体外培养中所需要的分离方法和生长条件也不同 一 上皮细胞的培养许多器官的上皮细胞具有特定的功能 上皮细胞在体外培养中需要从表皮分离 培养液和基质选择 增加适当的生长因子 一 表皮细胞表皮细胞生长在胶原基膜上 并从基膜获取生长分化所需要的物质 在体外培养情况下 可用胰蛋白酶消化法使表皮与真皮分开 原代或有限表皮细胞需要使用某些基质 培养液及包括滋养层在内的一些添加物 在正常Ca2 浓度情况下可形成分化的复层生长细胞 在低Ca2 浓度下 则呈未分化单层细胞生长 有充足滋养细胞时 有助于减少混杂的成纤维细胞 1 用品 1 培养液 1 含有4倍浓缩维生素及氨基酸的Eagle sMEM 加有热灭活的15 FCS 2 与上相同的4 MEM 加无Ca2 的HBSS 用CaCL2调整Ca2 浓度为0 08mmol L 用于人表皮细胞时则为0 22mmol L 3 FAD培养液 其组成为1份F12和3份DMEM 并加入腺嘌呤 1 8 10 4mol L 霍乱毒素 10 10mol L EGF 10ng ml 氢化考的松 0 4 g ml 和5 FCS 4 成品上皮细胞培养液 角化上皮细胞的KGM 适用于一般表皮细胞的EGM 2 方法在X线照射过的3T3细胞滋养层上也可以生长 为了模拟体内生长情况 已建立了一种 器官式培养系统 即将细胞接种在胶原凝胶体上或者真皮上 培养的细胞可显示体内生长时的某些特点及分化状态 或将表皮细胞悬液或整个的培养物移植于体内 使表皮细胞生长受到间质的影响 表皮细胞表现出体内生长的特点 3 鉴定表皮细胞对角蛋白特异性单克隆抗体 CK 反应阳性 间充质细胞对波型丝特异性单克隆抗体 vimetin 反应阳性 二 乳腺上皮细胞乳腺上皮细胞来源于乳汁中 或乳房成形成术时 人胚胎小肠纤维细胞滋养层可抑制间质细胞生长 胰岛素 氢化可的松 霍乱毒素 EGF等可促进上皮细胞生长 用品 1 人血清 HuS 2 储存液 胰岛素1mg ml 溶于6mmol LHCL 氢化可的松0 5mg ml 溶于生理盐水 霍乱毒素 50 g ml 溶于生理盐水 3 消化液 TEGPE 0 5 EDTA10ml 溶于PBSA0 2 EDTA4ml 溶于PBSA0 2 胰蛋白酶4ml 溶于HBSS1 0 胰蛋白酶2ml 溶于HBSS 4 培养液 RPMI1640 15 FCS 10 HuS 霍乱毒素50ng ml 氢化可的松0 5 g ml 胰岛素1 g ml 三 子宫颈子宫颈上皮细胞在细胞分化 癌前病变及癌的研究中有重要意义 原代培养易污染 可用组织块法进行原代培养 传代培养需要经照射过的3T3细胞作滋养层 培养液中需适当的添加物 四 肝肝实质由大量肝细胞为主组成 含间质量少 用组织块法和原位灌注消化法均易获得肝细胞用于原代培养 肝实质细胞培养在游离漂浮的胶原薄片上细胞能较好表达其功能 预先在培养皿底铺一层胶原凝胶 把细胞接种在凝胶上 五 胰将胰脏标本修剪切碎后消化 并使之浮于牛血清白蛋白溶液之上 经过3次离心分离 收集细胞 在水浴槽中用旋转法使细胞聚集 接种于涂布了胶原的培养皿 可获得体外培养的胰腺细胞 用品 1 摇动式培养箱 2 锥形瓶 容积25ml 经硅化处理 3 尼龙筛 孔径25 m和40 m 透析袋 5ml或10ml吸管 胶原涂布的培养皿 4 HBSS 无Ca2 Mg2 HBSS HBSS DVC 5 F12组织培养液 加20 小牛血清 6 I型胶原酶 7 0 25 胰蛋白酶 溶于柠檬酸盐缓冲液 每升含柠檬酸三钠3g NaCL6g 葡萄糖5g 用NaOH调pH至7 6 8 牛血清白蛋白 BSA 结果 其中30 40 可判断为腺细胞 在光学和相差显微镜下都可观察到酶原小滴 如果用已照射过的肺纤维细胞作为滋养层 细胞的3H TdR掺入及存活期均可明显增加 六 肾从基质中可以分离出肾小管细胞 因为这些细胞含有D 氨基酸氧化酶 能够在D 缬氨酸中生长 基质细胞则不可 用胶原酶消化切碎的肾脏组织10h左右 再用吸管吹打则可获得肾小管及肾小球上皮细胞 七 气管及支气管上皮有血清存在 气管上皮细胞停止分裂 不会终分化 在无血清培养液中接种气管组织碎块 可以促进气管细胞生长 并抑制成纤维细胞生长 二 中胚层细胞的培养 一 结缔组织细胞在细胞培养中结缔组织细胞最容易生长 不需要特殊条件 统称为成纤维细胞 成纤维细胞系中3T3系 成纤维细胞可分泌I和 型胶原 大量分泌I型胶原则是结缔组织细胞的特点 结缔组织细胞可向多个方向分化 可采用组织块法培养 二 脂肪组织细胞脂肪组织细胞中很难培养出脂肪细胞 成纤维细胞可被诱导分化出脂肪细胞 血清中的脂肪形成因子可能具有诱导作用 三 肌肉组织细胞骨骼肌 心肌 平滑肌细胞均可在体外培养中生长 心肌细胞在培养中还具有自动节律性收缩功能 传代培养后可能逐渐丧失这种功能 平滑肌细胞可通过胰蛋白酶或胶原酶消化法从血管壁 气管壁及肠壁等获得 四 软骨细胞软骨分为生长部和休止部 休止部软骨细胞表现为终末分化细胞的特性 无形成软骨基质的能力 生长部软骨细胞在体外培养条件下代谢较活跃 具有形成软骨基质的功能和成骨细胞的某些特性 软骨细胞易于在弱碱性 增加Mg2 浓度的培养液中生长 由于软骨细胞包于糖蛋白基质中 必需消化方可获得软骨细胞 用透明质酸酶 胰蛋白酶和胶原酶联合消化 用品 1 Gey s平衡盐溶液 GBSS pH7 0 为防止污染可加入抗菌素 如100U ml青霉素 100 g ml制霉菌素 2 F12培养液加12 胎牛血清 2 3mmol LMg2 100U ml链霉素 pH7 6无血清F12培养液 3 0 5 睾丸透明质酸酶 溶于GBSS 加入青霉素100U ml 链霉素100U ml 4 0 2 胶原酶 溶于GBSS 5 0 2 胰蛋白酶 溶于GBSS 6 0 25 胰蛋白酶 溶于无Ca2 Mg2 生理盐水 关节软骨细胞分离培养 将生后当天乳兔12只 分3次 在无菌条件下解剖分离乳兔的双侧下颌骨髁状突 仔细剥离髁状突软骨表面的纤维被膜 然后切取半透明状的髁状突软骨 用锐利小剪刀将其剪碎成1mm3大小 放于离心管中 先用0 25 胰蛋白酶37 消化30min 离心5min 1000rpm 弃上清后加入0 1 胶原酶IA3ml 37 下消化5h后 用吸管将沉于底部的组织及细胞轻轻悬浮后 用200 m滤网滤过后离心沉淀细胞 再用含10 FBSDMEM培养液 含青霉素100IU ml 链霉素100 g ml 将细胞悬浮后 接种于培养瓶在5 CO2 95 空气 饱和湿度 37 孵浴箱内进行培养 软骨细胞鉴定 形态观察 多角形 类似上皮样细胞 可形成具有折光性的细胞外基质 甲苯胺兰染色呈异染性 细胞组织化学染色 软骨细胞可特异性的合成葡萄糖胺聚糖 GAG 分泌 型和 型胶原 并具有碱性磷酸酶活性 抗 型胶原免疫组织化学染色呈阳性 五 骨细胞骨细胞是终末分化的细胞 埋藏于骨基质之中 尚未见到从皮质骨中分离培养出纯骨细胞的报导 只是在进行成骨细胞培养时可见到少量星状细胞 可形成花边样网状结构 在某些激素 如甲状旁腺素 的作用下 或去除培养液中血清的条件下 这些细胞可变为圆形 二羟基维生素D3可以刺激某些成骨样细胞变星状 已制备出抗骨细胞的特异性单克隆抗体 六 成骨细胞在骨组织 骨膜中均有成骨细胞 可用骨组织块法 酶消化法 骨膜组织块法以及骨髓培养法分离培养出成骨细胞 骨组织块培养法常用骨小梁或新生鼠 兔 人胚胎颅盖骨标本 把切碎的骨组织块放入培养瓶 按常规组织块法进行培养 在培养液中加入抗胶原血清 可抑制成纤维细胞成长 骨膜组织块培养法将手术切取的骨膜标本清洗后切成碎块按一般组织块法进行培养 3 酶消化培养法将小梁骨切成2 5mm3的小块 置于胶原酶和胰蛋白酶中消化 获得细胞悬液 接种培养 用品 1 常规培养器具 解剖刀 钳等 2 Ham sF12培养液 3 胰蛋白酶液 4 骨细胞消化液 a液 NaCL8 0g KCL0 2g NaH2PO4 H2O0 05g 溶于100ml蒸馏水b液 I型胶原酶137mg 型胰蛋白酶50mg溶于10mla液中 调整pH至7 2加蒸馏水至100ml 过滤除菌 制得骨细胞消化液 分装为100ml 5 9cm培养皿 25cm2或75cm2培养瓶 骨髓培养法骨髓单个核细胞在体外培养条件下可分化为成骨细胞 随着培养时间的延长 95 以上的贴壁生长细胞表现出成骨细胞的特征 在原代培养时培养液中加入高浓度马血清可限制骨髓干细胞的生长 有利于单个核细胞的生长和分化 用品 常规组织块法器皿 20ml注射器100U ml肝素 含30 马血清的RPMI1640培养液 含10 胎牛血清的MEM培养液 5 成骨细胞鉴定 1 形态观察 酶消化法和骨组织块法培养生长的成骨细胞多为立方状 体积小 核圆 骨髓培养法初期细胞为圆形 两周后主要为梭形 与纤维细胞非常相似 2 碱性磷酸酶 AP 活性检测 可采用细胞化学染色或定量测定 并以纤维细胞为对照 3 型和 型原胶原测定 成熟的成骨细胞能合成 型胶原 不能合成 型胶原 I型原胶原也是成骨细胞的标志物之一 4 矿化检测 成骨细胞在体外培养时能形成矿化的细胞外基质 一般培养至6 8周时即可出现 矿化区经VonKossa s染色呈阳性反应 七 破骨细胞脾脏和骨髓中的单个核细胞可以互相融合形成多核的破骨细胞随血流到达破骨功能活动跃的部位 在新生动物的长骨内面反复冲洗或用胶原酶消化新生动物的颅盖骨 都可获得破骨细胞 用骨髓培养法也可使单个核细胞分化为破骨细胞 1 四肢长骨机械分离法破骨细胞附着在四肢长骨骨干内表面 用机械冲洗法获得悬液中含有破骨细胞 可用于培养 2 下蛋母鸡长骨分离法下蛋母鸡在缺钙情况下骨内膜中破骨细胞数量增加 可从其长骨骨内膜获得破骨细胞进行培养 3 颅盖骨消化法用胶原酶消化新生或胚胎动物的颅盖骨可获得破骨细胞用于体外培养 用品 1 酶消化原代培养法常规器皿 2 Hanks液 HEPES液 灭活胎牛血清 青霉素 链霉素 二性霉素 1 g ml胶原酶 溶于199培养 MEM培养液 4 骨髓单个核细胞培养法骨髓中的单个核细胞在二羟基维生素D3的作用下可分化为破骨细胞 破骨细胞鉴定从四肢长骨和颅盖骨获得的培养中 往往有纤维细胞和成骨细胞与破骨细胞共同生长 且破骨细胞数量较少 用骨髓单个核细胞培养法可获得较多的破骨细胞 但也有其他骨髓细胞混杂生长 目前尚未见到纯粹破骨细胞培养及破骨细胞传代培养的报导 形态观察 破骨细胞体积大 多个核 细胞直径20 100 m 组织化学染色 破骨细胞与抗酒石酸磷酸酶 TRACP 反应呈棕色 降钙素反应呈兰紫色 与破骨细胞单克隆抗体免疫反应呈阳性 功能观察 破骨细胞具有破骨功能 八 内皮细胞内皮细胞在血管内形成单层内表面 培养方法主要是在血管内注入胶原酶使内皮细胞分离 然后培养在铺有明胶基质的培养器皿内 用品 1 无菌条件下切取血管 长10cm 直径约大于5mm 2 胶原酶 0 25 粗制胶原酶 200U mg 溶于PBSA 加入0 5 牛血清白蛋白 3 DMEM培养液 加10 胎牛血清和抗菌素 4 直径10cm的培养皿或75cm2培养瓶内表面1 5 明胶 溶剂为PBSA 培养过夜 去除多余明胶 加入培养液和血清