基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用.ppt

基因修饰技术在人源化肝脏小鼠模型中的应用 早在17世纪动物试验就已经出现了 目前试验动物广泛应用于生理学 医学 药学等学科的教学与研究 以及食品 化妆品 生物制品 工业产品等的安全性 毒性和效力等方面的试验和检测 具有重要价值和作用 试验用动物 种属差异 动物基因组 人类基因组 代谢 免疫相关人类毒性 肝脏是人体最重要的代谢器官 也是出现受试人员中毒时最常见 表现最明显 影响最严重的毒性靶器官 另据报导 每年临床发生肝毒性损伤的病例亦非常多 药物引发肝损伤占全部中毒事件20 50 暴发性肝衰竭可达15 30 药物性肝损害 非阿尿苷事件回顾 非阿尿苷是抗乙肝病毒核苷类似物 其前期试验药效显著 结果良好 而1993年15名受试者加大剂量 0 1or0 25mg kg d 的二期临床试验中 前8周疗效明显 而13周时7名受试者出现肝衰竭 脾衰竭 乳酸中毒 其中5名不治身亡 动物试验非阿尿苷最大耐受剂量 小鼠50mg kg d90d 大鼠500mg kg d30d 比格犬3mg kd d90d 食蟹猴25mg kg d30d 小鼠给药剂量达到250mg kg d 人类剂量1000倍 时 50只小鼠仅有4只死于肾衰竭 大鼠剂量达510mg kg d 人类剂量2000倍 持续给药70d 所有大鼠ALT AST均正常 试验动物作为预测工具如不能完全准确预测人体可能会出现的情况 就如同战地扫雷 一旦出现误判 代价很有可能将是巨大的 危险 安全 那么能不能构建一种临床前更贴近人肝代谢 预测性更一致性的试验动物模型 将可能发生的人类肝毒性提前筛查出来 降低无谓成本 减少临床损失呢 这将具有极其重大的意义和价值 人源化肝脏小鼠模型由此成为研究热点 现代生物医药领域研究模式 基因修饰技术ES打靶基因修饰技术TALEN基因修饰技术CRISPR Cas9基因修饰技术TetraOneTM基因修饰技术 基因修饰动物建模 免疫缺陷小鼠模型的构建 人源化肝脏小鼠模型的构建 工程基因片段uPA基因片段Fah基因片段HSVtk GCV自杀系统Tet on uPA自杀系统其他 移植用人类细胞肝细胞造血干细胞胸腺细胞其他 1 uPA Rag2小鼠 Dandri 2001年 德国 uPA全称尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子 Urokinase typePlasminogenActivator 当白蛋白启动的uPA基因片段在小鼠肝细胞内表达时 纤维蛋白溶酶原会激活纤维蛋白酶 诱发粗面内质网发生裂解损伤 最后肝细胞损伤并逐渐消亡 Rag2全称重组激活基因2 Recombination ActivatingGene2 在VDJ基因重排和淋巴细胞发育中起关键性作用 Rag2 小鼠为C57BL 6J品系背景 T B淋巴细胞早期发育严重停滞 外周血没有成熟的循环T B淋巴细胞 非特异性免疫收影响小 Rag2小鼠 uPA基因 肝细胞人源化率仅有15 适合病毒学研究 但无法满足代谢研究需求 2 uPA SCID小鼠 Tateno 2004年 日本 SCID小鼠全名联合缺陷免疫小鼠 severecombinedimmunedeficiency 其第16对染色体隐性基因突变 纯合子的淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域的重组酶活性异常 基因重排无法正常进行 影响B T细胞的正常分化 外周血白细胞总数减少 但粒细胞 巨噬细胞 NK细胞 LAK细胞正常 uPA SCID小鼠相比uPA Rag2小鼠具有更高的人源化比率 其肝细胞替换可达50 运用免疫抑制剂后可提升至70 基本满足代谢和毒性研究需求 许多学者利用该模型进行了多种药物研究 SCID小鼠 uPA基因 持续性自发肝损 出血性疾病导致死亡 高血补体浓度 C3 肾病 生殖障碍 移植窗较小 出生后2W内移植 存在非特异性免疫 需药物抑制免疫 2 uPA SCID小鼠 Tateno 2004年 日本 3 Fah小鼠 Grompe 1993年 波兰 Fah全称延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因 fumarylacetoacetatehydrolase Fah 小鼠酪氨酸代谢受阻 出现 型酪氨酸血症 毒性产物损伤肝 肾 2 硝基 4 三氟甲苯 1 3环乙烷碘 NTBC 可以抑制酪氨酸降解通路中4 对羟基苯丙酮酸双氧化酶 4 HPPD 活性 减少毒性代谢产物积聚 起到治疗作用 NTBC治疗维持 具有免疫系统 不适合人源化组织和细胞移植 Fah nude Fah Rag1 Fah Nod Scid ll2rg基因是白细胞介素2受体的gamma链 Il 2R c 又称CD132 是具有免疫功能的细胞因子Il 2 Il 4 Il 7 Il 9 Il 15和I 21的共同受体亚基 L2rg 小鼠机体免疫功能严重降低 尤其是NK细胞的活性几乎丧失 4 FRG小鼠 Azuma 2007年 波兰 持续性的自发肝脏 自发性 型酪氨酸血症突出 易诱发肝癌 需要药物NTBC控制肝损伤程度 易对试验结果造成影响 小鼠存活率不高 饲养时易死亡 4 FRG小鼠 Azuma 2007年 波兰 FRG小鼠在性状和效果上都优于Fah 小鼠 其肝细胞替换率达80 以上 后经其他学者改进探索 可达95 左右 该模型应用于代谢和病毒等多个领域研究 有重要意义 5 NOG NSG小鼠 Ito 2002年 日本 NOG小鼠由日本实验动物研究所的Ito培育而成 通过杂交NOD Scid和Il2rg 小鼠而来 其T B细胞皆缺失 NK细胞功能缺陷 与NOD Scid小鼠相比 NOG小鼠的人体细胞和组织移植存活率显著提高 同时能够植入更高比例的正常或癌变人类细胞和组织 NOG NSG是类似的并行品系 源于日本为NOG NOD Shi scid Il 2R cnull 源于美国为NSG NOD scid C SzJ NOG小鼠在免疫缺陷模型 肿瘤模型 异种移植模型 传染病模型领域有大量应用 6 TK NOG小鼠 Hasegawa 2011年 日本 单纯疱疹病毒胸苷激酶 更昔洛韦 HSVtk GCV 系统是分子生物学基因修饰技术中运用十分广泛的自杀系统 GCV本身无毒 但是在转染了HSVtk基因的细胞中可被磷酸化 成为单磷酸盐 再经内源性细胞激酶作用可转化为二磷酸和三磷酸盐 对细胞有高毒性 NOG TK NOG 具有人肝等效的酶表达及生物功能 具有较高立体组织结构 人源化程度高 90 生存率高 移植时段宽裕 可重复利用 无需外源性药物维持性状 可生殖传代 雌性可与NOG小鼠生育 在代谢 毒性 病毒 微生物方面大量应用2011 2017 美日有诸多研究和数据 无商业化成品供应 国内来源受限 6 TK NOG小鼠 Hasegawa 2011年 日本 7 uPA NOG小鼠 Gutti 2014年 美国 uPA NOG小鼠是在NOG小鼠基础上通过基因修饰加入uPA基因培育而来 目前应用相对较少 有报导